鉴别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻‑粘膜病病毒的PCR检测试剂盒及其专用引物的制作方法

本发明属于生物检测技术领域中的兽医动物病原检测，特别是涉及一种能够特异性鉴别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(i型和ii型)的普通pcr检测试剂盒及其专用引物。

背景技术：

瘟病毒属

瘟病毒属包括粘膜病病毒群的病毒以及猪瘟病毒和羊边界病病毒。病毒粒子呈圆形，有脂蛋白的囊膜，在细胞浆内增殖和发育成熟，是最小的有囊膜的rna病毒(直径约40nm)，内含非螺旋状的、有可能是二十面体对称的核衣壳。基因组为单分子的单股rna，本身就可作为信息rna(mrna)。瘟病毒不能在无脊椎动物体内增殖。血清学上与本属内的病毒呈现交叉反应，但与黄病毒科其它属的病毒成员没有交叉关系。

猪瘟病毒和牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(i型和ii型)

猪瘟(classicalswinefever,csf)又称猪霍乱(hogcholera，hc),是由猪瘟病毒(classicalswinefevervirus，csfv)引起的一种高度接触性传染病，世界动物卫生组织(oie)将其列为必须通报的动物传染病。猪瘟的临床症状由急性、亚急性逐渐转变为慢性温和型，临床症状不典型，在猪瘟高发地区，主要采用常规的免疫接种进行猪瘟的预防。疫苗的品质则直接决定猪群抵抗猪瘟病毒的能力，现常用的猪瘟疫苗有传代细胞源、兔源等不同厂家的猪瘟疫苗，因猪瘟疫苗生产离不开细胞培养，细胞培养最重要的原材料之一为血清，血清主要来源于牛血清。随着牛群的进口引进，目前，牛病毒性腹泻-粘膜病(bvd-md)分布于世界各地，从20世纪八、九十年代以来，在北美州，美国、加拿大bvd-md的感染率达到50％-85％；在欧洲、法国、德国，经血清学调查结果显示bvd-md的感染率为76％，瑞典的发病率在10％-80％之间，芬兰肉牛的感染率不小于50％，希腊阳性率为1.3％-14％，立陶宛阳性率为70％-100％，瑞士和波兰的平均阳性率分别为12.5％和86％；在南美洲，巴西、委内瑞拉、秘鲁、新西兰及澳大利亚bvd-md的阳性率分别为15.1％-56％、36％-37％、50％-96％和89％。因牛病毒性腹泻-粘膜病(bvd-md)病毒(bvdv)的广泛存在，生产猪瘟疫苗等疫苗类产品时为避免原材料血清被bvdv污染，需要建立一种快速、简单的对牛血清中的bvdv进行检测的方法。

csfv和bvdv的检测

由于csfv和bvdv是同一个属的成员，同源性高，具有很强的血清学交叉反应，生产猪瘟细胞苗常利用牛睾丸细胞和胎牛血清来扩大培养猪瘟病毒，若牛睾丸细胞或胎牛血清被bvdv污染，会直接导致猪瘟细胞苗污染bvdv病毒，导致csfv疫苗不纯净，并且，用含有bvdv抗体的血清进行cfsv病毒的体外培养对cfsv病毒具有抑制作用，因此为保证猪瘟细胞源疫苗的安全性及有效性，bvdv病毒和csfv病毒的鉴别尤为重要。常规的鉴别是对bvdv病毒和csfv病毒分别检测，常用的csfv和bvdv检测方法有琼脂扩散试验、免疫荧光技术、酶联免疫吸附试验、动物接种试验、病毒中和试验、常规pcr试验和rt-pcr试验等，因琼脂扩散试验、免疫荧光技术、酶联免疫吸附试验、动物接种试验和病毒中和试验费时、费力，并且成本较高，现常用的检测方法为pcr技术，由于实时荧光定量pcr技术的仪器昂贵、成本高，因此普通pcr检测技术为首选的csfv和bvdv的检测技术。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供用于对i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(bvdv)进行普通pcr检测的引物，并实现牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(bvdv)与猪瘟病毒(csfv)的鉴别。

本发明所提供的用于对i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒进行普通pcr检测的引物为：上游引物(pu-bvdv-f)的核苷酸序列如序列表中sedidno：1所示，下游引物(pu-bvdv-r)的核苷酸序列如序列表中seqidno：2所示。

由上述引物衍生的引物序列也属于本发明内容。所述衍生序列是指在seqidno：1和/或seqidno：2的基础上经过一至十个碱基的取代、缺失或添加得到的引物序列。

本发明的第二个目的是提供用于对i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(bvdv)进行普通pcr检测的试剂盒。

本发明所提供的普通pcr检测试剂盒，包括上述用于对i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒进行普通pcr检测的引物。

具体来讲，所述试剂盒还包括以下用于25μl普通pcr反应体系的试剂：一步法pcr反应液2×onesteprt-pcrbufferiii12.5μl(购于takara公司)，takaraextaqhs0.5μl(购于takara公司)，primescriptrtenzymemixii0.5μl(购于takara公司)，pu-bvdv-f(20μm)0.5μl，pu-bvdv-r(20μm)0.5μl，rna-freeh2o8.5μl，核酸模板2μl。该体系中引物稀释至20μm，反应体系中最终加量为0.4μmol/l。

为方便检测，所述试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为牛病毒性腹泻-粘膜病病毒i型和ii型基因组rna，所述阴性对照为不含i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒的反应体系，如h2o(双蒸水、无菌去离子水等)。

本发明的第三个目的是提供所述引物或试剂盒在对i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(bvdv)进行非疾病诊断目的的检测、或在对牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(bvdv)与猪瘟病毒(csfv)进行非疾病诊断目的的鉴别的应用。

该应用之一为一种用上述普通pcr检测试剂盒及普通pcr技术对i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(bvdv)进行非疾病诊断目的的定性检测的方法，该普通pcr检测方法包括以下步骤：

1)提取待测样品的基因组rna，以提取的基因组rna为模板，在上述引物引导下进行普通pcr扩增检测；

2)用得到的pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，实现对i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(bvdv)的定性检测，出现预期目的条带“233bp”表明待测样品中含有i型和/或ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(bvdv)，若无预期目的条带则表明待测样品中无i型和/或ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(bvdv)。

应用之二为一种非疾病诊断目的的鉴别i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(bvdv)与猪瘟病毒(csfv)的方法，在上述步骤后还包括：

3)结果判定：

本发明的普通pcr检测方法只对bvdv样品有扩增条带而对csfv样品无扩增条带，本发明充分利用两者基因序列的差异，在pu-bvdv-f序列上筛选出较好的8个位点(自5’端148、152、155、156、160、164、166、170位点)，在pu-bvdv-r序列上筛选出较好的1个位点(自5’端355位点)，用pu-bvdv-f和pu-bvdv-r可同时扩增i型和ii型bvdv，pcr扩增若出现预期扩增条带“233bp”可以确认其为i型和/或ii型bvdv病毒，因与csfv序列具有8个碱基的差异无法扩增csfv序列(未出现预期条带)，从而实现鉴别i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(bvdv)与猪瘟病毒(csfv)的目的。

具体判定方法：pcr扩增若出现预期扩增条带“233bp”，则确认为bvdv阳性(样品中含有i型和/或ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒)，无预期扩增条带出现，则确认为bvdv阴性(样品中不含有i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒)。

在上述方法中，所述步骤1)中的待测样品可以为采自犊牛用于疫苗生产的血清，也可以为犊牛睾丸分离的原代细胞，对其检测用于非诊断目的。通过对此类待测样品中bvdv病毒的定性检测以实现对基于犊牛的产品及原料的监控，并为后续原料处置提供客观数据。

所述步骤1)和步骤2)中的25μl普通pcr反应体系可包括：模板2μl，一步法pcr反应液2×onesteprt-pcrbufferiii12.5μl(购于takara公司)，takaraextaqhs0.5μl(购于takara公司)，primescriptrtenzymemixii0.5μl(购于takara公司)，pu-bvdv-f(20μm)0.5μl，pu-bvdv-r(20μm)0.5μl，rna-freeh2o8.5μl。引物稀释为20μm，反应体系中最终加量为0.4μmol/l。

所述步骤1)和步骤2)中的普通pcr反应条件可为：先52℃15min，95℃5s；然后94℃5s，56℃30s，72℃45s，35个循环；最后终延伸72℃7min。

本发明提供了一种可特异性鉴别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(i型和ii型)的普通pcr检测试剂盒及其专用引物。本发明能对i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒实施快速检测，可为猪瘟病毒疫苗生产过程中的质量监控提供有力依据，确保疫苗接种的安全性和纯净性，对猪瘟病毒疫苗的生产具有指导作用；还可以对犊牛来源原材料的质量进行监控，并为后续处置提供客观数据，以保证犊牛血清、细胞及其制品的安全性。本发明的试剂盒和检测方法操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性好，不仅可用于i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒的检测，更可以实现牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(bvdv)和猪瘟病毒(csfv)的鉴别，将在i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒的检测(包括临床诊断中临床病料或培养物中i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒的准确检测)及疫苗生产和犊牛制品生产(非诊断目的的应用)中发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为本发明用普通pcr技术对i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(bvdv)进行定性检测的技术路线

图2为16份临床疑似血清病料i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(bvdv)的检测结果

图3为i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(bvdv)的普通pcr检测方法的特异性检测结果

图4为i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(bvdv)的普通pcr检测方法的灵敏度检测结果

图5为i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(bvdv)的普通pcr检测方法的重复性检测结果

图6为10份csfv疫苗半成品中外源病毒i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(bvdv)的检测结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《molecularcloning:alaboratorymanual》(sambrook，j.，russell，davidw.，molecularcloning:alaboratorymanual，3rdedition，2001，ny，coldspringharbor)。

所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(w/w，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(w/v，单位g/100ml)百分比浓度或体积/体积(v/v，单位ml/100ml)百分比浓度。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

所用引物由北京华大基因有限公司合成。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

生物基因组是直接反应生物基本信息的一个最客观的指标，不同的病毒所含有的基因组信息不同，通过基因组信息可将不同的病毒分类至不同的族群，利用基因组碱基互补配对的原则，可实现特异位点基因序列的大量扩增，从而通过一定的方法使得肉眼可见。

如图1所示，本发明基于以上基本原理设计了1对特异性引物，利用碱基互补配对的原理，建立了一种特异性检测i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(bvdv)的普通pcr检测方法。

实施例1、设计用普通pcr技术检测i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(bvdv)的引物

检测序列的选取：牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(bvdv)的常规pcr检测，有文献介绍其检测序列为5’utr，然而，由于csfv和bvdv的5’utr基因区域的高相似性原因，导致已有文献报道的检测序列存在无法鉴别csfv和bvdv的问题。本发明首先从检测序列上进行突破，从ncbi的核酸数据库genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)对bvdv不同毒株基因进行大量检索，获得i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(bvdv)的5’utr区域基因(bvdvi型genbank号：kc963967，序列表中sedidno：3；bvdvii型genbank号：kc176779.1，序列表中sedidno：4)的序列，用dnaman软件进行比对后，根据引物设计原则，通过分析研究，筛选、比较、确定在bvdv不同毒株之间相对保守的一段基因作为检测序列。最终，选取i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒的5’utr区域基因的特异性保守序列(自5’端第147-379位碱基，序列表中sedidno：5)作为检测序列。

引物设计：基于确定的检测序列，用primerexpress6.0软件设计对i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒进行普通pcr检测的引物，获得4组引物，经分析、比较、实验，最终确定的引物序列如下：

pu-bvdv-f(上游引物)：5’-gtgagttcg/a/tttggatggcc/tgaag/tc-3’(序列表中sedidno：1)

pu-bvdv-r(下游引物)：5’-gtgccatgtacagcagagattttta-3’(序列表中sedidno：2)。

以上检测引物确定过程中，本发明还充分考虑了利用该引物检测中对bvdv和csfv的鉴别，因此，还充分考虑了两者基因序列的差异，在pu-bvdv-f序列上筛选出较好的8个位点(自5’端148、152、155、156、160、164、166、170位点)，在pu-bvdv-r序列上筛选出较好的1个位点(自5’端355位点)，用pu-bvdv-f和pu-bvdv-r可同时扩增i型和ii型bvdv，pcr扩增若出现预期扩增条带“233bp”可以确认其为i型和/或ii型bvdv病毒，因与csfv序列具有8个碱基的差异无法扩增csfv序列(未出现预期条带)，从而实现鉴别i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(bvdv)与猪瘟病毒(csfv)的目的。

实施例2、用本发明的引物对i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(bvdv)进行普通pcr检测

一、提取待测样品的基因组rna

分别对灭活的i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒的细胞培养物(阳性对照)以及待测样品提取基因组rna，具体方法包括以下步骤(axyprep^tmbodyfluidviraldna/rnaminiprepkit，axygen公司)：

(1)axygen试剂盒准备：按试剂盒说明书，预先配制含1％冰乙酸的异丙醇和在试剂bufferw1a和bufferw2中添加指定浓度的无水乙醇。

(2)在1.5ml离心管中加入200ul的待检样品，并加入200μlbufferv-l，漩涡振荡混匀后，静置5min.

(3)在步骤(2)的1.5ml样品及试剂混合离心管中加75μlbufferv-n，漩涡振荡混匀，12000g离心5min。

(4)将上清转移至2ml离心管(试剂盒内提供)中，加300μl异丙醇(1％冰乙酸)，上下倒置6-8次，混合均匀。

(5)将制备管置于2ml离心管中(试剂盒内提供)中，取步骤(4)的混合液移入制备管中，6000g离心1min。

(6)弃滤液，将制备管置回至2ml离心管中，加500μlbufferw1a，室温静置1min。12000g离心1min。

(7)弃滤液，将制备管置回至2ml离心管中，加800μlbufferw2，12000g离心1min。

(8)将制备管置回到2ml离心管中，12000g离心1min。

(9)将制备管置于洁净的1.5ml离心管(试剂盒内提供)中，在制备管膜中央加40ul无酶水，室温静置1min，12000g离心1min洗脱rna。

二、待测样品中i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(bvdv)的普通pcr检测

1、待测样品和阴性和阳性对照pcr扩增

对步骤一提取的来自i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒的基因组rna、阴性对照和待测样品rna进行pcr扩增，25μl反应体系如下：

表1i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒5’utr区域基因的pcr扩增体系

反应体系中引物最终加量为0.4μmol/l。

pcr反应循环条件如下：

表2i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒5’utr区域基因的pcr循环条件

2、待测样品和阴性和阳性对照pcr产物电泳检测

将pcr扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，电压为110v，电泳40min。

3、对i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(bvdv)血清样品的普通pcr检测

本实施例用本发明建立的牛病毒性腹泻-粘膜病病毒i型和ii型的普通pcr检测方法对所收集的16份临床疑似血清病料(待测样品)提取的rna进行检测，以灭活的i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒细胞培养物提取的rna为阳性对照，以无酶水为阴性对照，根据普通pcr检测结果，以是否出现“233bp”扩增条带为标准对临床样本是否感染i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒进行判定(出现判定为阳性，未出现判定为阴性)。

结果如图2(m1：2000bpmarker；m2：100bpdnaladder；1：0627-1(结果：阴性)；2：0627-2(结果：阳性)；3：0627-3(结果：阳性)；4：0627-4(结果：阳性)；5：0627-5(结果：阳性)；6：0627-6(结果：阴性)；7：0627-7(结果：阴性)；8：0627-8(结果：阴性)；9：0627-9(结果：阴性)；10：0627-10(结果：阴性)；11：0627-11(结果：阴性)；12：0627-12(结果：阴性)；13：0627-13(结果：阴性)；14：0627-14(结果：阴性)；15：0627-15(结果：阴性)；16：0627-16(结果：阳性)；ntc：空白对照(结果：成立)；—：阴性对照(结果：成立)；+：阳性对照(结果：成立))所示，所检测的16份疑似血清中有5份血清判定为阳性(说明感染了i型和/或ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒)，11份血清判定为阴性(说明未感染i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒)。

实施例3、本发明检测方法的特异性实验

按照实施例2所述方法用dna/rna同时提取的axygen试剂盒(购自康宁生命科学(吴江)有限公司)对i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(bvdv)、牛鼻气管炎病毒(ibrv)、猪瘟病毒(csfv)和口蹄疫病毒(fmdv)提取rna，对伪狂犬病毒(prv)、羊口疮病毒(orfv)、羊痘病毒和布鲁氏菌病细菌提取dna，同时以灭活的i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒细胞培养物提取的rna为阳性对照，以无酶水为阴性对照，在本发明引物的引导下进行普通pcr检测，pcr反应体系及反应条件参照实施例2，以验证该方法的特异性。

检测结果如图3(m：2000bpmarker；1：ibrv病毒；2：csfv病毒；3：bvdv病毒；4：fmdv病毒；5：羊口疮病毒；6：羊痘病毒；7：布病细菌；8：伪狂犬病毒；9：ntc(空白对照))所示，仅有bvdv出现预期的扩增条带“233bp”，结果阳性，其它样品未出现预期扩增条带，结果阴性。检测结果表明用本发明的方法可特异性地检测出i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒。

实施例4、本发明检测方法的灵敏度实验

按照实施例2所述，将携带牛病毒性腹泻-粘膜病病毒的阳性核酸样品，采用nanodrop仪器测定浓度后，按照10倍梯度依次进行稀释，分别稀释至浓度为1.5ng/μl、0.15ng/μl、0.015ng/μl、1.5pg/μl、0.15pg/μl、0.015pg/μl、1.5fg/μl、0.15fg/μl、0.015fg/μl、0.0015fg/μl，以不同浓度的核酸样品作为模板，在本发明引物的引导下进行普通pcr检测，pcr反应体系及反应条件参照实施例2，以验证该方法的灵敏度。

检测结果如图4(m：2000bpmarker；1：1.5ng/μl；2：0.15ng/μl；3：0.015ng/μl；4：1.5pg/μl；5：0.15pg/μl；6：0.015pg/μl；7：1.5fg/μl；8：0.15fg/μl；9：0.015fg/μl；10：0.0015fg/μl；11：阴性对照；12：ntc(空白对照))所示，显示本发明i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒的普通pcr检测方法的检测敏感度为1.5pg/μl。

实施例5、本发明检测方法的重复性实验

按照实施例2所述，将10倍梯度稀释的1.5ng/μl、0.15ng/μl、0.015ng/μl、1.5pg/μl共4个梯度的核酸样品，每个样品进行3个重复，在本发明引物的指导下进行普通pcr检测，pcr反应体系及反应条件参照实施例2，以验证该方法的重复性。

检测结果如图5(m：2000bpmarker；1、5、9：1.5ng/μl；2、6、10：0.15ng/μl；3、7、11：0.015ng/μl；4、8、12：1.5pg/μl)所示，从图中可见每一个浓度梯度的3个重复样，检测结果一致，表明本发明i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒的普通pcr检测方法的重复性较好。

实施例6、检测i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(bvdv)的普通pcr检测试剂盒

基于实施例1和2，本发明所提供的普通pcr检测试剂盒，包括用于对i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒进行普通pcr检测的引物(pu-bvdv-f和pu-bvdv-r)。使用中引物稀释为20μm，反应体系中引物最终加量为0.4μmol/l。

具体来讲，该试剂盒包括以下用于25μl普通pcr反应体系的试剂：一步法pcr反应液2×onesteprt-pcrbufferiii12.5μl(购于takara公司)，takaraextaqhs0.5μl(购于takara公司)，primescriptrtenzymemixii0.5μl(购于takara公司)，pu-bvdv-f(20μm)0.5μl，pu-bvdv-r(20μm)0.5μl，rna-freeh2o8.5μl和模板2μl。

为方便检测，试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为牛病毒性腹泻-粘膜病病毒i型和ii型基因组rna，所述阴性对照为不含牛病毒性腹泻-粘膜病病毒i型和ii型的反应体系，如h2o(双蒸水、无菌去离子水等)。

试剂盒中各试剂的使用可参考实施例2的内容。

实施例7、csfv疫苗生产过程中对i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病外源病毒的普通pcr检测

本实施例对csfv疫苗生产(csfv疫苗生产方法可参考文献《猪瘟活疫苗生产工艺改进现状》，广东畜牧兽医科技，2012-08-18，谢文强，金宇保灵生物药品有限公司)中半成品样品中的i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病外源病毒进行检测，检测方法与实施例2相同，待检样品为csfv疫苗半成品1-10号

检测结果如图6(m：100bpdnaladder；1：01#疫苗(结果：阴性)；2：02#疫苗(结果：阴性)；3：03#疫苗(结果：阴性)；4：04#疫苗(结果：阴性)；5：05#疫苗(结果：阴性)；6：06#疫苗(结果：阴性)；7：07#疫苗(结果：阳性)；8：08#疫苗(结果：阳性)；9：09#疫苗(结果：阴性)；10：10#疫苗(结果：阴性)；11：阴性对照(结果：成立)；12：阳性对照(结果：成立))所示，从图中可见在10份csfv疫苗半成品中，2份有外源病毒bvdv的污染，8份无外源病毒bvdv的污染，可见csfv疫苗生产过程中监控外源病毒bvdv非常有必要，也显示本发明能够特异性鉴别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(i型和ii型)，可为猪瘟病毒疫苗生产过程中的质量监控提供有力依据，确保疫苗接种的安全性和纯净性。

序列表

<110>金宇保灵生物药品有限公司

<120>鉴别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻-粘膜病病毒的pcr检测试剂盒及其专用引物

<130>cgcnb175056w

<160>5

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>pu-bvdv-f（上游引物）,d为g或a或t，y为c或t，k为g或t

<220>

<223>

<400>1

gtgagttcdttggatggcygaakc24

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>pu-bvdv-r（下游引物）

<400>2

gtgccatgtacagcagagattttta25

<210>3

<211>12301

<212>dna

<213>i型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒：kc963967全基因

<400>3

gtatacgagaatttgcctaacctcgtatacgtattggacactctaaaaaataattaggtc60

tagggaaaatcctccttagcgaaggccgaaaagaggctagccatgcccttagtaggacta120

gcaacataaggggggtagcaacagtggtgagttcgttggatggctgaagccctgagtaca180

gggtagtcgtcagtggttcgacgctttggaggacaagcctcgagatgccacgtggacgag240

ggcatgcccacagcacatcttaacatggacgggggtcgttcatgtgaaaacggtttaacc300

aaccgctacgaatacagcctgatagggtgctgcagaggcccactgtattgctactgaaaa360

tctctgctgtacatggcacatggagttgatcacaaatgaacttttatacaaaacatacaa420

acaaaaacccactggagtggaggaaccagtatacgaccaagctggcaaccctttgtttgg480

agaaagaggagtgattcatccgcagtcaacgctaaaactgccacataaaagaggggagcg540

tgaagtccccaccaatttggcctctttaccaaaaagaggtgactgcaggtcaggtaatag600

caaggggcctgtgagtggaatctatttaaaaccagggccagtattctaccaggattacaa660

aggacccgtctatcatagagccccattggagttttttgaggaagcgcccatgtgtgagat720

aactaaaagaatcgggagagtaactggcagtgacagcaaattataccacatttatgtgtg780

tattgatgggtgcataataattaagagtgctacaaaagattgccaaaaaatactcaaatg840

ggtccacaacaagctaaactgccccctatgggtttcaagctgctccgacacaaaggatga900

aggggcggtgagaaagaagcaacaaaagccagataggttggaaaaggggagaatgaagat960

aacacctaaggagtcagaaaaagacagtaagaccaagccaccagatgccacgatagtagt1020

agatggagttaaatatcaggtaaagaagaaaggaaaagtcaagagcaagaacacccagga1080

tggcttataccacaacaagaacaaacctcaagagtcacgcaagaaactagagaaagccct1140

actggcctgggcaataatagctctagttttgttccaagtcacagtgggagagaacataac1200

gcaatggaacttgcaagataatggaacggagggaatacaacgagccatgtatcaaagagg1260

tgtgaatagaagtctacatgggatctggccagagaaaatctgtacaggtgtcccttccca1320

cctggccaccgacacggaactgaaggcaattcacggtatgatggatgcaagtgagaagac1380

aaattatacatgttgcaaactccaacgccatgagtggaacaaacatggttggtgcaactg1440

gtacaacattgaaccttggatccttcttatgaataagactcaagccaaccttactgaagg1500

tcagcctttaagggagtgtgccgtcacatgcaggtatgatcgagatagtgacctgaatgt1560

agtaacacaagctagggatagccccacaacattgacaggctgcaagaaaggcaagaactt1620

ttcctttgcaggcatattggtacaagggccttgcaactttgaaatagccgtaagtgatgt1680

gctgttcaaagagcatgattgcactagtgtgattcaagacacagctcactacctcgtaga1740

cgggatgaccaactccctagagagtgctaggcaagggactgcaaaactaacaacttggct1800

gggcaggcaacttgggatactaggaaagaaactggaaaacaagagtaagacatggttcgg1860

ggcatatgcagcttctccttactgcgaggtagaacggaagcttggttacatctggtatac1920

aaagaattgcactcctgcctgtctgcctagaaacacaaagatcattggccccggcaagtt1980

cgacaccaacgctgaggatggtaaaatactgcatgagatggggggtcacttgtcggaggt2040

gctactactctcagtggtagtgttgtccgatttcgctccagagacagccagtgtgatata2100

cttggttctccatttctccatcccacaagggcacactgatatacaagattgtgacaaaaa2160

ccaactaaacctcaccgtagaactcacaacagcagaagtaataccaggttcagtttggaa2220

tttgggtaaatatgtttgcataagaccaaattggtggccttatgagacagtcacggttct2280

ggcgtttgaagaggtgggtcaagtaattaagattgtcttaagggcgttgagagatctgac2340

gcgcatttggaccgctgctacgaccactgcattcctggtttgcttggtgaaggtggtgag2400

aggccaagtgttgcaaggtatactgtggctgatgctcataacaggggcgcaagggtaccc2460

agactgcaaacctgacttttcatacgccatagccaaaaacgatgaggtcggtccacttgg2520

agctacaggcctcaccactcagtggtacgaatactcagaaaggatgcggctgcaggactc2580

aacagttgaaatctggtgtaaagatggagagttcaaatatctgattagatgtgagaggga2640

agccaggtatctggctattctacacacgagagccttgccgacatctgtagtatttaaaaa2700

gatcttagatggaaaagaacaagaggacatagtagaaatggatgacaactttgaattcgg2760

tctttgcccgtgtgatgctagacccgtgataagaggaaaatttaatacaacacttctaaa2820

tgggccagccttccagatggtttgtcctataggatggacggggactgtaagctgcacact2880

ggctaataaggatacgttggccacaaccgttgtgcgaacatataagaggaccaggccttt2940

cccatatagacagaactgtgttacccaaaaaaccattggggaagacctctacgactgtgc3000

cttaggagggaattggacttgtgtgctgggggatgcattacgatatgtagctgggcctgt3060

cgagtcttgtaagtggtgtggttacaggttttttaaaaatgagggcctgccgcatttccc3120

aatcggcaaatgcagactgaagaatgagagtggctatagacaagtggatgagacttcctg3180

caacagaaacggcgtggctatagtgccatctggcctggtcaaatgcaaaataggggacac3240

ggtggtacaagtcattgcaatggatgataaactagggcccatgccttgcaaaccacatga3300

aatcatatccagtgaagggccagtggaaaagacggcatgcacctttaactacacaaaaac3360

attgaaaaacaagtactttgagcctagggacaactatttccaacaatatatgttaaaggg3420

ggagtaccaatattggtttgacctagagatcactgaccaccaccgggactactttgctga3480

gtccctgctggtgatagtagttgcactcctgggtggcaggtacgtgctttggttgctagt3540

cacatacatggtcctatcagaacaaatggcctcgggtgcccagtatggggcaggtgaaat3600

agtgatgatgggcaacttgttaacacatgacagtgttgaagtggtgacatatttcttact3660

actatacctactactgagagaggataacaccaaaaaatgggtcatacttatataccacat3720

catagtaatgcacccactaaagtcggtgacggtgatactgctaatggttggagggatggc3780

aaaggccgagccaggcgcccaggggtacctagagcaggttgaccttagtttcacgatgat3840

tacgatcatcgtagtaggcctggttatagccaggcgtgaccccactgtggtgccattagt3900

cacaataattgcagcactgaagatcacaggactaggctttgggcctggagtggacgcagc3960

tatggcagttctcaccttaaccctactgatgattagttatgttacagactacttcaggta4020

taaaaggtggatacaatgcatcctcagcttagtagctggggtgttccttattcggagcct4080

caaacacctaggtgaaatcaaaacccctgagctgaccataccgaactggaggccactaac4140

cttcatactattatacctgacttcagcaacagttgttacaagatggaaagttgacatagc4200

tggcatattactgcaaggggccccgatccttttgctgatcgccaccctatgggccgactt4260

cctgacccttgttctgatcttacccacctacgaattagtcaagttgtactacctaaagaa4320

tgtcaagactgacgtggaaaagagttggcttggggggttagactacaaaacaattgactc4380

tgtttatgatgtggatgaaagtggagaaggcgtgtacctcttcccgtccaaacagaagaa4440

aaataagaatatcagcatactcctgcccctcatcagagctacgctaataagttgtattag4500

cagcaaatggcagatggtgtatatggcttacctaaccctggactttatgtactacatgca4560

cagaaaggttattgaagagatatcagggggtaccaacgtgatatctagagtgatagcagc4620

actcatagagttaaactggtccatggaagaagaagaaagcaagggcttaaagaagttttt4680

tatactatctggaaggttgaggaaccttataataaagcataaggttaggaaccagaccgt4740

agcaagctggtatggggaggaagaagtctacggcatgccaaaagtcatgaccataataag4800

ggcctgtacactaaacaagaataaacattgcataatatgcacagtatgtgaggctaaaga4860

atggaagggaggcaactgccctaagtgtggccgctacgggaagcccatcacttgtgggat4920

gactctagcggattttgaagaaaggcactacatgagaatttttatacgggaaggtaactt4980

taaagggcccttcagggaggaacgcaatgggttcttacaatacaccgctagggggcaatt5040

gttcctgaggaatttacccatattagcaactaaagtaaaaatgctcatggtaggcaacct5100

aggagaggaaattggtgatttagaacacctaggatggatcctaagaggacctgccgtgtg5160

caagaaaataactgagcacgaaaaatgccatgttaacatactggacaagctgactgcatt5220

tttcggggttatgccaagaggaaccacaccaagggctccggtgagattcccaacagcatt5280

actaaaggtaaggaggggattggaaaccggttgggcttacacgcatcaaggtggcataag5340

ctcagtagaccatgtgaccgctggcaaggatctattggtttgtgatagtatgggtaggac5400

tagagtggtttgccaaagcaacaacaagttaactgatgagacagaatatggtgtcaagac5460

ggactccggatgtccagacggagccagatgctatgtattaaatccagaggcagtaaatat5520

atcagggtccaagggagctgtcgtacacctccaaaaaacgggtggcgaatttacatgcgt5580

tactgcatcaggtacaccagccttcttcgacctaaaaaatttgaaaggatggtcaggtct5640

acccatatttgaagcctccagcggcagagtggttggcagggtcaaagtgggaaagaatga5700

ggaatctaaacctacaaaattaatgagtggtatccaaactgtttcaaaaagtacggccga5760

tttaacagaaatggtaaagaagataaccagcatgaacaggggggactttaagcagataac5820

cctagcaacaggggcagggaagaccactgaactcccaaaagcagtgatagaggagatagg5880

gcggcataaacgggtactagtgcttataccattaagagcagctgctgagtcagtctatca5940

gtacatgagattgaaacatccaagtatctcctttaacctgagaataggggacatgaagga6000

aggggacatggcaaccgggatcacttacgcctcatatggatacttctgccaaatgccgca6060

gccaaagctcagggcagcaatggtagagtattcatacatattcctggatgagtatcactg6120

cgctacacctgagcagttggctgttataggaaaaatccacagattttctgagagtataag6180

ggtggttgccatgactgccaccccagcagggtcggtaaccacaacagggcaaaaacaccc6240

aatagaagaattcatagcccctgaggtgatgaaaggggaggaccttggaagccagttcct6300

tgacatagcggggttaaagatccctgtagaggagatgaagggcaacatgttggtcttcgt6360

gcccacgaggaacatggcggttgatgtagccaagaaattaaaagccaagggctacaactc6420

agggtattactacagcggggaagacccagctaacttgagagtggtaacatcacagtcccc6480

atatgttgtagtggccaccaatgccatcgagtcaggggttacgctgccagatttagatac6540

agttgttgacacaggtctgaagtgtgagaagagggtgagggtgtcttccaaaataccctt6600

tatagtgacaggccttaaaagaatggctgtcactgtgggtgaacaagctcagcggagagg6660

cagggtaggcagagtgaagcccggcaggtattatagaagtcaggaaacagcaaccgggtc6720

aaaggactaccattatgacctgttacaggcacagaggtacgggatcgaagatgggatcaa6780

cgtaacaaagtcttttagggagatgaattatgactggagcctgtatgaggaagacagctt6840

gctaataacccagctggagatactgaacaatctactcatctctgaagacttgccagcagc6900

cgtcaaaaacatcatgacaagaactgatcacccagagcctatccagcttgcatacaacag6960

ctacgaggtgcaagtccctgtgctgttcccaaaaataaggaatggggaggttacggacac7020

ttacgagaactactcattcctgaatgcaaggaaactaggggaagacgtgcccgtgtacat7080

ttatgccaccgaagatgaagacctggcagtggaccttctaggcttggactggccggaccc7140

agggaatcagcaagtagtggagactggaaaagcactaaagcaagtggtcggtctgtcctc7200

tgccgaaaatgccttgctcatagccctattcgggtatgtaggataccaagccttgtcaaa7260

aagacacgtcccaatgatcacagacatatataccatagaagatcaaagactggaggacac7320

aacccaccttcaatatgcgcccaatgctataagaactgaggggaaggagactgaactaaa7380

ggaattggcagtgggtgacttggacaaaatcatggagtccatctcggattacgcatccgg7440

gggattggatttcgtaaggtcccaggcagaaaagataagatctgcccccgttttcaaaga7500

aaacatggaagctgctaaagggtacgtccaaaagtttattgattctctcatagaaaataa7560

agaaaccataatcagatatggtctgtggggaacacatacagcactctacaagagtattgc7620

tgcgagattgggtcatgaaactgcatttgctacactagtgataaagtggctggccttcgg7680

gggtgagtcagtgtcagaccatgtgagacaagcagctgtcgacctggttgtttattatgt7740

gatcaacaaaccttccttcccaggggattctgaaacccaacaggaaggaaggcgattcgt7800

cgccagcttattcatctctgctttggcaacctacacatacaaaacttggaactaccacaa7860

cctctccaaagtagtagaaccagccttagcatacctcccctatgctaccagtgcactgaa7920

aatgttcaccccaactagactggagagcgtagtcatactcagtacaacaatatacaaaac7980

ttacctctcaataaggaaaggaaaaagtgatggactattgggtacagggatcagtgcggc8040

aatggagattctgtcacagaacccggtgtcggtaggcatatctgtcatgctgggggtggg8100

ggcgattgccgcgcacaatgccattgagtctagtgaacaaaaaaggaccctgttgatgaa8160

ggtgtttgtaaaaaacttcctggaccaggcggcaacagatgagctggtaaaggagaatcc8220

agagaaaataataatggccctatttgaagcagttcagacaattggcaaccccttgaggct8280

aatatatcacctgtatggggtttactataaaggctgggaggcaaaagaactatccgagag8340

aacagcaggcaggaacctgtttaccttgataatgttcgaagcattcgaactactaggaat8400

ggactctgaagggaagataaggcaactgtctgggaactatgtcttggatttgatctatag8460

cctacacaaacagataaacagaagcttaaaaagaatgatcttgggatgggcccccgcacc8520

atttagttgtgactggacccctggtgacgagagaattaggttacccacagacaactatct8580

aagagtagaaacaaagtgcccatgtggctatgagatgaaagcactaaggaacgttagtgg8640

cagtcttaccatagtggaggagaaagggccttttctctgcaggaacaggcctggcagagg8700

gccggtcaactatagagttacaaggtactatgatgacaaccttaaagagataaaaccagt8760

tgcaaaactagaaggacttgtggatcactattacaaaggtgtcacagcaagaatagatca8820

tggcaaaggaaaaatgctattagctactgataaatgggaggttgagcacggtgttgtcac8880

taggatggcaaagagatataccggagttggattcaagggtgcatacctgggtgatgaacc8940

caactaccgcgacctagtggaaagagactgtgcaactataacaaaaaacacagtgcagtt9000

tttaaaaatgaagaaaggttgtgcatttacctatgacttaaccctgtccaatttgaccag9060

gttgattgaattggtacacagaaataacctcgaagagaaagaaataccagccgccacagt9120

aacaacatggctggcttatacatttgtaaatgaagatattgggactataaaaccagtact9180

gggagagagagtggtcaccgacccagtggtggatgtcaacttacagccagaagtacaagt9240

ggatacatcagaggttgggatcactttagttggaaaggcagtcttaatgacgacaggtac9300

tacacccgtagttgagaacaccgaacccaatgctgatggtggtccaagctctgtgaagat9360

cggattggacaaaggaagttacccaggacctggactgcaagaccgcaccttaaccgatga9420

aatacattctagggatgggaggccttttatcctagtcctgggctcaaaaaattccatgtc9480

aaatagagctaaaactgctagaaacattaatttatacactggaaaagacccgagggagat9540

tagagatctgatggcacaggggcgtatgctagttgtggctttaaaggattttaaccctga9600

gttgtctgaactagttgattacaaggggactttcttggacagggaagccttggaagctct9660

cagtctggggcggccaaagcccaagcaggtgaccacagccacagttagggagttattaga9720

gcaggaggcgcaagtcgagatccccagttggtttggcgcagatgatccagtcttcttgga9780

agtggctctgaagggcgacaaatatcacttagtaggagatgtagacaaagtgaaagatca9840

agcgaaggggcttggggccactgaccagacaagaatagtaaaggaagtgggtgcgagaac9900

ttataccatgaagctgtctagttggttccttcaggcatcaaataagcagatgagtttgac9960

ccctctatttgaggagctgttattacgttgcccccctaaggaaaatagcaataaagggca10020

catggcatcagcttatcaattagctcagggtaattgggagccactcaattgtggagttca10080

cctgggcaccatacctgctaggagggtaaaaatccacccatatgaagcatacctgaaact10140

gaaggatctattagaagaagaagaaaagaaaccaaaatgtagagatacagtaatgagaga10200

acataacaagtggatcctaaaaaaaataaggcaccaagggagtctcaatacaaagaaaat10260

cctcaaccctggaaagctatcagagcagctagatagagaaggacataaaagaaacatcta10320

taataaccagattggcaccataatgacaggagcagggataagactggaaaaattaccggt10380

cgttagagcccaaactgacactaaaagtttccatgaggcaatcagagataagatagacaa10440

gaatgaaaatcagcagagtccaggactgcatgataaattgttagagatctttcatacaat10500

agcccaatccagcctaaaacacacctacggcgaagtgacgtgggagcaacttgagacagg10560

gattaatagaaaaggggctgcgggctttctagagaagaagaatgttggagaagtattgga10620

ctcagagaagcacctggtggaacaactgatcagagatttgaaaacaggaaagaagataag10680

gtattatgaaacagcaataccaaaaaatgaaaagagagatgtcagtgatgattggcaatc10740

aggggacatagtggatgagaagaaaccaagggtgatccaataccctgaagctaagacaag10800

actagccattacaaaagtgatgtacaactgggtgaaacagcagcccgtcgtgatcccagg10860

gtatgaagggaagacaccattatttaacatcttcaacaaggtgaggaaggaatgggattt10920

gttcaatgaaccagtagctgtgagtttcgacaccaaggcttgggacacccaagtaaccag10980

tagagatctacggcttattggtgaaattcaaaaatattacttcaggaaagagtggcacaa11040

attcatcgacaccattaccgaccatatggtggaggtgcccgttataacggcagatggtga11100

ggtatacataagaaatggacaaaggggtagtggccagccagacacaagtgcaggcaacag11160

catgctaaatgtgttaacaatgatgtatgccttctgtgaaagtacgggggttccatataa11220

gagtttcaacagggttgcaaggatccatgtctgtggggatgacggcttcttaataacaga11280

gaaggggctgggattaaagtttgccaacaatgggatgcaaattctgcatgaagcgggcaa11340

gcctcaaaagataaccgaaggggaaagaatgaaagttgcctataggtttgaggacataga11400

attttgctcacacacaccagtccccgttaggtggtctgataacaccagcagttacatggc11460

cggcagagacacagccgttatattatcaaagatggcaacaagattggattcaagtggaga11520

aaggggtactatagcatatgaaaaagcagtggcttttagttttctactgatgtactcctg11580

gaatcctcttgtgaggaggatttgtctactggttctttcacagcagccagagacaactcc11640

atcaacccagaccacttactactataagggagacccaataggagcctataaagatgtgat11700

aggtaagaacttgagtgaattaaaaaggacgggttttgaaaaattggctaatctaaacct11760

aagcctttccacgttaggaatctggtccaaacatacaagtaaacgaattatccaagattg11820

tgtaaccatcggaaaagaggaaggcaattggctagtcaatgccgacaggctgatatctag11880

caaaactggccatttgtacataccagacaaaggttatacattacaaggaaaacattatga11940

acaacttcaactgcaagcaagaactagcccagtcatgggggtagggacagagagatataa12000

actaggccctatagtgaacctgctgctgaggaggttgagagtcctgcttatggcagctgt12060

cggtgccagcagctgaaacaaaatgtatatattgtaaataaatcaatccatgtacatatt12120

gtttataaatatagttgggatcgtctacctcaagaagactacatgcccagcacacacagc12180

taaacagtagttgagatcatctacctcatgataacactacatttgatgcacacagcactt12240

tagctgtatgaggatacacccgacgtctacagttggactagggaagacctctaacagccc12300

c12301

<210>4

<211>260

<212>dna

<213>ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒：kc176779.1（其5’端基因）

<400>4

catgcccatagtaggactagcaaagagaggggactagcggtagcagtgagttcattggat60

ggccgaatccctgagtacagggaagtcgtcaatggttcgacgctctggcaacaaagagcc120

tcgagatgccatgtggacgagggcatgcccacggcacatcttaacctatgcgggggttgc180

gtaggtgaaagcatcatcttgagatgttatggacacagcctgatagggtgtagcagagac240

ctgctattccgctagtataa260

<210>5

<211>233

<212>dna

<213>i型和ii型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒的5’utr区域基因的特异性保守序列（自5’端第147-379位碱基）

<400>5

gtgagttcgttggatggctgaagccctgagtacagggtagtcgtcagtggttcgacgctt60

tggaggacaagcctcgagatgccacgtggacgagggcatgcccacagcacatcttaacat120

ggacgggggtcgttcatgtgaaaacggtttaaccaaccgctacgaatacagcctgatagg180

gtgctgcagaggcccactgtattgctactgaaaatctctgctgtacatggcac233