本发明涉及常规分子学技术领域，尤其涉及一种检测大肠杆菌的荧光定量pcr方法。
背景技术：
大肠埃希氏菌(escherichiacoli)通常被称为大肠杆菌，是escherich在1885年发现的，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌；直到20世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜(禽)，常引起严重腹泻和败血症，它是一种普通的原核生物，根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为6类：肠致病性大肠杆菌(epec)、肠产毒性大肠杆菌(etec)、肠侵袭性大肠杆菌(eiec)、肠出血性大肠杆菌(ehec)、肠黏附性大肠杆菌(eaec)和弥散粘附性大肠杆菌(daec)；大肠杆菌属于革兰氏阴性细菌(g-)；其检测方法较多，但大多较为繁琐，且结果并不准确，本发明的目的是提供一种能够快速有效检测目标中大肠杆菌的方法。
技术实现要素：
本发明提出了一种检测大肠杆菌的荧光定量pcr方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
本发明提出了一种检测大肠杆菌的荧光定量pcr方法，包括如下步骤：
s1、根据目的基因序列设计特异性的引物和荧光探针如下：
引物a：5’-tggcatgacgttataggctacaat-3’；
引物b：5’-agcttgttctaactgggctaatcct-3’；
引物c：5’-tgctattctaactgggctaataag-3’；
引物d：5’-agctattctatctctgctaataac-3’；
探针p：5’-fam-ataggatgacaaatatctgcgctgct-bhq1-3’；
s2、选取大肠杆菌样品，提取样品的dna/rna；
s3、将提取得到的rna转换成cdna，其具体步骤如下：
a1、取灭过菌且无核酸酶的0.2ml离心管，取4-6μgrna提取物加入离心管，在60-65℃环境中保温5min，然后冰浴6-8min；
a2、在离心管中依次加入下列组份：rnase抑制剂(40u/μl)0.5μl，10×m-mlvreactionbuffer2μl，dtt(200mm)1μl和逆转录酶(m-mlv)1μl；
a3、将离心管内部组份轻轻混匀后，进行离心操作；
a4、将离心得到的产物放入恒温箱，先在40℃保温1-2h，然后72℃保温20-30min，最后在-20℃环境中保存留用；
s4、使用紫外分光光度计检测上一步中提取物，检测结果保证1.7＜od260/od280＜1.9，以保证提取物为纯dna，结果不满足则说明含有rna和蛋白质杂质，需要重新提取；
s5、荧光定量pcr，取大肠杆菌dna2μl，10μmol/l的引物a和引物b各3μl，10μmol/l的探针p0.5μl，2×taqmanuniversalmastermix10μl，再加入ddh2o补充至25μl，混合均匀后转移到加热箱中进行加热，其加热保温过程为：先在55-60℃环境中保温1min，之后使用96-100℃加热5-6min，之后转到80-88℃加热5min，最后采用70℃保温1min，进行55-60个循环，在58℃进行单点荧光检测；
s6、采用双标准曲线法，对样品检测的ct值进行实验结果分析：
a、无ct值且无扩增曲线，表示样品中不含大肠杆菌；
b、ct值≤35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中含大肠杆菌；
c、当ct值＞35.0，则该样品做重复实验；重复实验结果无ct值则该样品中不含大肠杆菌；若重复实验结果有ct值，则该样品中含大肠杆菌。
优选的，所述s2中关联的具体步骤如下：
b1、选取处于生长旺盛时期的大肠杆菌样品；
b2、去掉培养基，加入1μltrnzol在-70℃环境中保存4-8h；
b3、加入氯仿后2200-2400rpm离心40s，静置得到位于下层的有机层和位于上层的水样层；
b4、收集水样层加入异丙醇，沉淀得到rna；
b5、收集有机层加入乙醇，沉淀后得到dna。
优选的，所述s3中的离心操作为在-0.09mpa环境中采用2200-2400rpm离心40s。
本发明具有的优点如下：
1、能够准确高效地提取出高纯度的大肠杆菌dna，有助于提高实验结果的准确性；
2、通过利用双标准曲线法，构建标准曲线方程，从而计算出样品中大肠杆菌的数量；
3、提供了灵活的、操作简便的且快速高效的检测体系，能够用于大肠杆菌的定性和定量检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例来对本发明做进一步说明。
实施例1
一种检测大肠杆菌的荧光定量pcr方法，包括如下步骤：
s1、根据目的基因序列设计特异性的引物和荧光探针如下：
引物a：5’-tggcatgacgttataggctacaat-3’；
引物b：5’-agcttgttctaactgggctaatcct-3’；
引物c：5’-tgctattctaactgggctaataag-3’；
引物d：5’-agctattctatctctgctaataac-3’；
探针p：5’-fam-ataggatgacaaatatctgcgctgct-bhq1-3’；
s2、选取大肠杆菌样品，提取样品的dna/rna，具体步骤如下：
b1、选取处于生长旺盛时期的大肠杆菌样品；
b2、去掉培养基，加入1μltrnzol在-70℃环境中保存4h；
b3、加入氯仿后2200rpm离心40s，静置得到位于下层的有机层和位于上层的水样层；
b4、收集水样层加入异丙醇，沉淀得到rna；
b5、收集有机层加入乙醇，沉淀后得到dna；
s3、将提取得到的rna转换成cdna，其具体步骤如下：
a1、取灭过菌且无核酸酶的0.2ml离心管，取4μgrna提取物加入离心管，在60℃环境中保温5min，然后冰浴6min；
a2、在离心管中依次加入下列组份：rnase抑制剂(40u/μl)0.5μl，10×m-mlvreactionbuffer2μl，dtt(200mm)1μl和逆转录酶(m-mlv)1μl；
a3、将离心管内部组份轻轻混匀后，在-0.09mpa环境中采用2200离心40s；
a4、将离心得到的产物放入恒温箱，先在40℃保温1h，然后72℃保温20min，最后在-20℃环境中保存留用；
s4、使用紫外分光光度计检测上一步中提取物，检测结果保证1.7＜od260/od280＜1.9，以保证提取物为纯dna，结果不满足则说明含有rna和蛋白质杂质，需要重新提取；
s5、荧光定量pcr，取大肠杆菌dna2μl，10μmol/l的引物a和引物b各3μl，10μmol/l的探针p0.5μl，2×taqmanuniversalmastermix10μl，再加入ddh2o补充至25μl，混合均匀后转移到加热箱中进行加热，其加热保温过程为：先在55℃环境中保温1min，之后使用96℃加热5min，之后转到80℃加热5min，最后采用70℃保温1min，进行55个循环，在58℃进行单点荧光检测；
s6、采用双标准曲线法，对样品检测的ct值进行实验结果分析：
a、无ct值且无扩增曲线，表示样品中不含大肠杆菌；
b、ct值≤35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中含大肠杆菌；
c、当ct值＞35.0，则该样品做重复实验；重复实验结果无ct值则该样品中不含大肠杆菌；若重复实验结果有ct值，则该样品中含大肠杆菌。
实施例2
一种检测大肠杆菌的荧光定量pcr方法，包括如下步骤：
s1、根据目的基因序列设计特异性的引物和荧光探针如下：
引物a：5’-tggcatgacgttataggctacaat-3’；
引物b：5’-agcttgttctaactgggctaatcct-3’；
引物c：5’-tgctattctaactgggctaataag-3’；
引物d：5’-agctattctatctctgctaataac-3’；
探针p：5’-fam-ataggatgacaaatatctgcgctgct-bhq1-3’；
s2、选取大肠杆菌样品，提取样品的dna/rna，具体步骤如下：
b1、选取处于生长旺盛时期的大肠杆菌样品；
b2、去掉培养基，加入1μltrnzol在-70℃环境中保存5h；
b3、加入氯仿后2300rpm离心40s，静置得到位于下层的有机层和位于上层的水样层；
b4、收集水样层加入异丙醇，沉淀得到rna；
b5、收集有机层加入乙醇，沉淀后得到dna；
s3、将提取得到的rna转换成cdna，其具体步骤如下：
a1、取灭过菌且无核酸酶的0.2ml离心管，取4.5μgrna提取物加入离心管，在62℃环境中保温5min，然后冰浴6.5min；
a2、在离心管中依次加入下列组份：rnase抑制剂(40u/μl)0.5μl，10×m-mlvreactionbuffer2μl，dtt(200mm)1μl和逆转录酶(m-mlv)1μl；
a3、将离心管内部组份轻轻混匀后，在-0.09mpa环境中采用2300rpm离心40s；
a4、将离心得到的产物放入恒温箱，先在40℃保温1.5h，然后72℃保温25min，最后在-20℃环境中保存留用；
s4、使用紫外分光光度计检测上一步中提取物，检测结果保证1.7＜od260/od280＜1.9，以保证提取物为纯dna，结果不满足则说明含有rna和蛋白质杂质，需要重新提取；
s5、荧光定量pcr，取大肠杆菌dna2μl，10μmol/l的引物a和引物b各3μl，10μmol/l的探针p0.5μl，2×taqmanuniversalmastermix10μl，再加入ddh2o补充至25μl，混合均匀后转移到加热箱中进行加热，其加热保温过程为：先在56℃环境中保温1min，之后使用97℃加热5-6min，之后转到82℃加热5min，最后采用70℃保温1min，进行56个循环，在58℃进行单点荧光检测；
s6、采用双标准曲线法，对样品检测的ct值进行实验结果分析：
a、无ct值且无扩增曲线，表示样品中不含大肠杆菌；
b、ct值≤35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中含大肠杆菌；
c、当ct值＞35.0，则该样品做重复实验；重复实验结果无ct值则该样品中不含大肠杆菌；若重复实验结果有ct值，则该样品中含大肠杆菌。
实施例3
一种检测大肠杆菌的荧光定量pcr方法，包括如下步骤：
s1、根据目的基因序列设计特异性的引物和荧光探针如下：
引物a：5’-tggcatgacgttataggctacaat-3’；
引物b：5’-agcttgttctaactgggctaatcct-3’；
引物c：5’-tgctattctaactgggctaataag-3’；
引物d：5’-agctattctatctctgctaataac-3’；
探针p：5’-fam-ataggatgacaaatatctgcgctgct-bhq1-3’；
s2、选取大肠杆菌样品，提取样品的dna/rna，具体步骤如下：
b1、选取处于生长旺盛时期的大肠杆菌样品；
b2、去掉培养基，加入1μltrnzol在-70℃环境中保存7h；
b3、加入氯仿后2350rpm离心40s，静置得到位于下层的有机层和位于上层的水样层；
b4、收集水样层加入异丙醇，沉淀得到rna；
b5、收集有机层加入乙醇，沉淀后得到dna；
s3、将提取得到的rna转换成cdna，其具体步骤如下：
a1、取灭过菌且无核酸酶的0.2ml离心管，取5.5μgrna提取物加入离心管，在64℃环境中保温5min，然后冰浴7.5min；
a2、在离心管中依次加入下列组份：rnase抑制剂(40u/μl)0.5μl，10×m-mlvreactionbuffer2μl，dtt(200mm)1μl和逆转录酶(m-mlv)1μl；
a3、将离心管内部组份轻轻混匀后，在-0.09mpa环境中采用2350rpm离心40s；
a4、将离心得到的产物放入恒温箱，先在40℃保温1.8h，然后72℃保温28min，最后在-20℃环境中保存留用；
s4、使用紫外分光光度计检测上一步中提取物，检测结果保证1.7＜od260/od280＜1.9，以保证提取物为纯dna，结果不满足则说明含有rna和蛋白质杂质，需要重新提取；
s5、荧光定量pcr，取大肠杆菌dna2μl，10μmol/l的引物a和引物b各3μl，10μmol/l的探针p0.5μl，2×taqmanuniversalmastermix10μl，再加入ddh2o补充至25μl，混合均匀后转移到加热箱中进行加热，其加热保温过程为：先在59℃环境中保温1min，之后使用99℃加热5.8min，之后转到88℃加热5min，最后采用70℃保温1min，进行59个循环，在58℃进行单点荧光检测；
s6、采用双标准曲线法，对样品检测的ct值进行实验结果分析：
a、无ct值且无扩增曲线，表示样品中不含大肠杆菌；
b、ct值≤35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中含大肠杆菌；
c、当ct值＞35.0，则该样品做重复实验；重复实验结果无ct值则该样品中不含大肠杆菌；若重复实验结果有ct值，则该样品中含大肠杆菌。
实施例4
一种检测大肠杆菌的荧光定量pcr方法，包括如下步骤：
s1、根据目的基因序列设计特异性的引物和荧光探针如下：
引物a：5’-tggcatgacgttataggctacaat-3’；
引物b：5’-agcttgttctaactgggctaatcct-3’；
引物c：5’-tgctattctaactgggctaataag-3’；
引物d：5’-agctattctatctctgctaataac-3’；
探针p：5’-fam-ataggatgacaaatatctgcgctgct-bhq1-3’；
s2、选取大肠杆菌样品，提取样品的dna/rna，具体步骤如下：
b1、选取处于生长旺盛时期的大肠杆菌样品；
b2、去掉培养基，加入1μltrnzol在-70℃环境中保存8h；
b3、加入氯仿后2400rpm离心40s，静置得到位于下层的有机层和位于上层的水样层；
b4、收集水样层加入异丙醇，沉淀得到rna；
b5、收集有机层加入乙醇，沉淀后得到dna；
s3、将提取得到的rna转换成cdna，其具体步骤如下：
a1、取灭过菌且无核酸酶的0.2ml离心管，取6μgrna提取物加入离心管，在65℃环境中保温5min，然后冰浴8min；
a2、在离心管中依次加入下列组份：rnase抑制剂(40u/μl)0.5μl，10×m-mlvreactionbuffer2μl，dtt(200mm)1μl和逆转录酶(m-mlv)1μl；
a3、将离心管内部组份轻轻混匀后，在-0.09mpa环境中采用2400rpm离心40s；
a4、将离心得到的产物放入恒温箱，先在40℃保温2h，然后72℃保温30min，最后在-20℃环境中保存留用；
s4、使用紫外分光光度计检测上一步中提取物，检测结果保证1.7＜od260/od280＜1.9，以保证提取物为纯dna，结果不满足则说明含有rna和蛋白质杂质，需要重新提取；
s5、荧光定量pcr，取大肠杆菌dna2μl，10μmol/l的引物a和引物b各3μl，10μmol/l的探针p0.5μl，2×taqmanuniversalmastermix10μl，再加入ddh2o补充至25μl，混合均匀后转移到加热箱中进行加热，其加热保温过程为：先在60℃环境中保温1min，之后使用100℃加热5-6min，之后转到88℃加热5min，最后采用70℃保温1min，进行60个循环，在58℃进行单点荧光检测；
s6、采用双标准曲线法，对样品检测的ct值进行实验结果分析：
a、无ct值且无扩增曲线，表示样品中不含大肠杆菌；
b、ct值≤35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中含大肠杆菌；
c、当ct值＞35.0，则该样品做重复实验；重复实验结果无ct值则该样品中不含大肠杆菌；若重复实验结果有ct值，则该样品中含大肠杆菌。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。