一种筛查癌症脑转移的试剂盒的制作方法

文档序号:12794148阅读:434来源:国知局

本发明属于分子生物学领域,具体涉及一种筛查癌症脑转移的试剂盒。



背景技术:

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,在恶性肿瘤的发病率及死亡率中,肺癌分别占13.0%和19.4%,居恶性肿瘤第一位。且受中国人口老龄化、吸烟人群年轻化等因素的影响,肺癌患者的人群基数仍在上升。脑转移(brainmetastases)是肺癌最常见的并发症,随着肺癌发病率的上升、肺癌病人生存期的延长,肺癌脑转移的发生率日渐升高,约17%~57%的肺癌患者在疾病进程中出现脑转移,尤其是肺腺癌发生脑转移的几率更高。肺癌脑转移占颅内转移瘤的40%~70%。

肺癌脑转移恶性程度高,发展迅速,预后差,如果不进行积极治疗或治疗方案选择不当患者生存期仅为1-2个月,经过及时治疗可大大延长患者寿命并提高生存质量。因此,对于早期的肺癌患者,脑转移的早期筛查和诊断至关重要。

长链非编码rna(longnoncodingrna,lncrna)是一类转录本长度大于200个核苷酸的非编码rna分子,lncrna因缺乏完整的开放阅读框而不能编码蛋白质。目前许多研究表明,lncrna是一类具有重要生物学功能的rna,参与基因组印记、染色体沉默、染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种调控过程,在细胞分化和发育、基因转录和翻译、遗传和表观遗传等生命活动中发挥重要的调控作用。

lnc-mmp2-2是一种长链非编码rna,位于第16号染色体chr16:55366267-55366879,hg19,基因序列长度为613bp。

目前lnc-mmp2-2的功能尚未见报道。



技术实现要素:

发明人对癌症脑转移进行了详细研究,发现了长链非编码rnalnc-mmp2-2可以作为其分子标志物。其中,长链非编码rnalnc-mmp2-2在脑组织中的表达水平与肺癌脑转移呈正相关。因此,通过检测肺癌患者脑组织中长链非编码rnalnc-mmp2-2的表达水平,可以预测待检肺癌患者脑转移的风险,为开展相应的预防及治疗措施做好准备。

据此,本发明提供了一种癌症脑转移筛查试剂盒及长链非编码rnalnc-mmp2-2在癌症脑转移筛查中的用途。

本发明提供了一种筛查癌症脑转移的试剂盒,它包括任选的用于检测长链非编码rnalnc-mmp2-2表达水平的试剂。

其中,所述检测长链非编码rnalnc-mmp2-2表达水平的试剂为原位杂交、pcr检测方法用试剂。

其中,所述试剂盒是筛查肺癌脑转移的试剂盒。

进一步的,所述试剂盒是筛查肺腺癌脑转移的试剂盒。

其中,所述试剂是用于检测脑组织中长链非编码rnalnc-mmp2-2表达水平的试剂。

本发明还提供了检测长链非编码rnalnc-mmp2-2表达水平的试剂在制备筛查癌症脑转移的试剂中的用途。

其中,所述检测长链非编码rnalnc-mmp2-2表达水平的试剂为原位杂交、pcr检测方法用试剂。

其中,所述癌症脑转移是指肺癌脑转移。

进一步的,所述癌症转移是指肺腺癌脑转移。

其中,所述试剂是用于检测脑组织中长链非编码rnalnc-mmp2-2表达水平的试剂。

本发明通过检测长链非编码rnalnc-mmp2-2的表达水平,可以判断肺癌患者与疑似肺癌脑转移患者的长链非编码rnalnc-mmp2-2表达水平差异,进而筛查待检肺癌患者脑转移的风险:若lnc-mmp2-2的表达水平高,则肺癌脑转移的风险高,若lnc-mmp2-2的表达水平低,则肺癌脑转移的风险低,可用于临床肺癌脑转移的辅助诊断。

显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1lnc-mmp2-2表达水平比较

a:正常肺组织、原位肺癌组织及肺癌脑转移组织中lnc-mmp2-2原位杂交染色,荧光探针为fam标记(绿色),dapi(蓝色)为细胞核染料。

b:lnc-mmp2-2原位杂交染色进行半定量分析,统计学分析表明肺癌脑转移组织明显高于正常肺组织及原位肺癌组织(p=0,0156)。

具体实施方式

实施例1长链非编码rnalnc-mmp2-2表达水平与肺癌脑转移患者的关系

一、实验材料

肺腺癌病程组织芯片微阵列(xt14-051):购自上海芯超生物科技有限公司,含正常肺组织19例、原位肺腺癌组织(非转移)14例和肺腺癌脑转移组织11例;

fam-lncrna-mmp2-2核酸探针由上海歌凡生物科技有限公司设计合成,序列为:5’-fam-accctaggctgcaggctcctgctttgggct-3’;

原位杂交试剂盒(c004)购自上海歌凡生物科技有限公司,试剂盒包含:10x蛋白酶k、预杂交液、乙酸酐、三乙醇胺水溶液ph8.0、20xsscph4.5、20xsscph7.5;

其他自备试剂(甘氨酸、甲酰胺、盐酸、二甲苯、30%h2o2)均为分析纯购自成都科龙化工试剂厂;

depc水及dapi染料、防淬灭封片剂均购自碧云天生物技术有限公司(上海);

荧光显微镜(dm4000b)购自莱卡公司(德国)。

二、实验方法

1芯片常规脱蜡和水化:

脱蜡前将组织芯片60℃烘烤20min,二甲苯ⅰ10min,二甲苯ⅱ10min,100%乙醇5min,95%乙醇5min,75%乙醇5min,depc水5min。

2杂交步骤:(实验中的所有水试剂均用depc水配制)

2.1制作湿盒:用5×ssc(5ml)+甲酰胺(5ml)置于湿盒内.。

2.2组织芯片值于湿盒内,30%h2o21份+9份纯甲醇混合液室温处理10min。depc水洗3×1min。

2.30.2mol/l盐酸滴于组织上,常温15min,用depc水洗2×1min。

2.41×蛋白酶k覆盖组织,分子杂交仪中37℃20min。

2.50.2%甘氨酸洗液洗1min,终止蛋白酶k,pbs洗2×1min。

2.64%多聚甲醛固定组织10min,pbs洗3×1min。

2.7乙酸酐ph8.0室温洗5min×2次。乙酸酐溶液配制:每5ml三乙醇胺水溶液中加12.6ul乙酸酐,现用现配。pbs洗5×1min。

2.85×sscph7.5室温洗2×1min。

2.9预杂交液覆盖组织,65℃预杂交1h。

2.10500ng/mlfam-lncrna-mmp2-2探针覆盖切片,密封湿盒,恒温65℃黑暗反应48h,2×sscph7.5,室温洗1×1min。

2.11甲酰胺加4×sscph4.51:1混合液在65℃洗3×20min。pbs洗5×1min。

2.12dapi染核,pbs洗3×5min。滴加防淬灭剂,盖盖玻片,荧光显微镜观察拍照。

3、数据处理

拍照后对lnc-mmp2-2荧光染色进行半定量分析,其中,

荧光强度为:阴性:0;弱阳性:1;阳性:2;强阳性:3,

阳性百分比为:0%:0;0-25%:1;25%-50%:2;50%-75%:3;75%-100%:4。

半定量评分=荧光强度x阳性百分比,

半定量得分为0-12。

使用graphpad5.0对各组半定量评分进行统计学分析,p<0.05为有统计学意义。

三、实验结果

不同组织的lnc-mmp2-2表达结果见图1。

由图1可见,正常肺组织中,lnc-mmp2-2表达得分为5.0000±0.4382,原位肺癌组织(即非转移的肺癌组织)中lnc-mmp2-2表达得分为6.0000±0.5774,二者的lnc-mmp2-2含量相当,差异不显著。肺癌脑转移组织中lnc-mmp2-2表达得分为10.0000±1.1550,说明lnc-mmp2-2在肺癌脑转移组织中表达量显著升高,与正常组织和原位肺癌组织相比,lnc-mmp2-2表达水平差异具有统计学意义(p<0.05)。

由以上结果可以看出,与正常人群和原位肺癌患者相比,肺癌脑转移患者的lnc-mmp2-2表达水平显著升高(p<0.05),说明肺癌脑转移与lnc-mmp2-2表达水平呈正相关,lnc-mmp2-2的高表达会显著提高肺癌脑转移的可能性,因此,可以通过检测待检肺癌患者的脑组织lnc-mmp2-2的表达水平,预测待检肺癌患者脑转移的风险,以开展相应的预防及治疗措施。

实施例2本发明检测长链非编码rnalnc-mmp2-2表达水平的试剂盒的组成及其使用方法

1、试剂盒的组成

fam-lncrna-mmp2-2核酸探针,序列为:

5’-fam-accctaggctgcaggctcctgctttgggct-3’;

原位杂交用:10x蛋白酶k、预杂交液、乙酸酐、三乙醇胺水溶液ph8.0、20xsscph4.5、20xsscph7.5。

depc水及dapi染料、防淬灭封片剂。

2、试剂盒的使用方法

将待检样本脑组织,按照原位杂交方法检测lncrna-mmp2-2的表达水平。

对疑似转移的肺癌患者,可分别取脑部异常部位组织、肺部组织,比较lncrna-mmp2-2表达水平,进而评价其肺癌脑转移的可能性,作为临床肺癌脑转移的辅助诊断手段。

综上,本发明通过检测长链非编码rnalnc-mmp2-2的表达水平,可以判断肺癌患者与疑似肺癌脑转移患者的长链非编码rnalnc-mmp2-2表达水平差异,进而筛查待检肺癌患者脑转移的风险:若lnc-mmp2-2的表达水平高,则肺癌脑转移的风险高,若lnc-mmp2-2的表达水平低,则肺癌脑转移的风险低,可用于临床肺癌转移的辅助诊断,为患者采取相关的治疗措施或者决策提供有效的依据,临床应用前景良好。

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