一种肺炎支原体恒温检测试剂盒的制作方法

本发明属生物技术领域，涉及一种核酸恒温扩增技术，尤其涉及一种不依赖于高能能量分子的用于检测肺炎支原体的恒温扩增技术及试剂盒。

背景技术：

肺炎支原体（mycoplasmapneumoniae，mp）是引起人类呼吸道感染的重要致病菌之一，主要通过呼吸道飞沫以气溶胶微粒的形式传播。肺炎支原体大约每隔4-5年就会发生一次流行，以秋冬季发病为主，可引发非典型肺炎、支气管炎、气管炎等，最容易出现在处于婴幼儿时期和青少年期，发病率以青少年最高，有大约20%-25%的儿童肺炎和10%的成人肺炎是由肺炎支原体引起的，还会引发其他系统的肺外并发症，如心肌炎、肾炎、心包炎、脑干炎、脑膜炎等。

据统计，大约每年约10万成人因为感染肺炎支原体而住院治疗。肺炎支原体的临床症状不明显，甚至根本无症状，若有也只是头痛、咽痛、发热、咳嗽等一般的呼吸道症状，但也有个别死亡报道。因此，快速、准确诊断肺炎支原体感染对于治疗很重要。

目前由于治疗肺炎支原体的特效药物以及相关的预防疫苗还没有上市，所以即时检测及定期检测肺炎支原体具有预防和指导临床治疗的积极意义。常规的诊断方法有：elisa法和分离培养法。elisa法是一种将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术，其特异性强，因为抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间，而两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。但其干扰因素较多（如温度、时间），重复性不好；且容易受到自身抗体、嗜异性抗体等干扰，易出现假阳性。分离培养法是最经典的诊断肺炎支原体的方法，但缺点在于操作时间长，需要配备专业技术人员在专业的实验室中进行检测，操作复杂，耗时长，无法做到现场即时检测，不适合临床样本的大批量处理及检测。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种肺炎支原体恒温检测试剂盒，主要解决现行技术操作复杂、耗时、技术要求高等问题。本发明试剂盒不依赖于atp、磷酸肌酸等高能能量分子，仅需在恒温条件下即可进行核酸的扩增。

本发明所采取的技术方案是：一种肺炎支原体恒温检测试剂盒，包括反应液、启动液、反应酶系、上游引物和下游引物。其特征在于：所述的反应酶系的成分包括单链结合蛋白、重组酶、肺炎支原体特异性引物（上游引物和下游引物）等，其中，重组酶为不依赖于能量分子的重组酶。

一种肺炎支原体恒温检测试剂盒，其反应液成分包括：

tris-缓冲液20mm-100mm

kcl20mm-80mm

(nh4)2so40mm-100mm

甜菜碱0m-2m

tritonx-1000%-1%

peg1%-20%

dmso0%-20%

bsa0mg/ml-1mg/ml

优选的，tris-缓冲液可选自tris-h2so4、tris-乙酸、tris-hcl中的任意一种或多种，tris-缓冲液的ph为7.0～9.0。

一种肺炎支原体恒温检测试剂盒，其特征在于：其启动液成分包括：

mg²⁺5mm~20mm

优选的，mg²⁺来自于硫酸镁、乙酸镁、氯化镁中的任意一种或多种。

一种肺炎支原体恒温检测试剂盒，其反应酶系成分包括：

dntps150um-500um

聚合酶bsu10-100u

单链结合蛋白200-700ng/ul

重组酶（e.colirect）100-500ng/ul

上游引物100-300nm

下游引物100-300nm

聚合酶、单链结合蛋白和重组酶的用量可以根据需要调整其添加量，或通过预实验确定其用量。

优选的，一种肺炎支原体恒温检测试剂盒，其反应液具体组成成分如下：

tris-hcl（ph=8.3）50mm

kcl60mm

(nh4)2so410mm

甜菜碱1m

tritonx-1000.1%

peg5%

dmso6%

bsa0.1mg/ml。

优选的，一种肺炎支原体恒温检测试剂盒，其启动液具体组成成分如下：

氯化镁10mm

优选的，一种肺炎支原体恒温检测试剂盒，其反应酶系具体组成成分如下：

dntps200um

聚合酶bsu100ng/ul

单链结合蛋白262ng/ul

重组酶（e.colirect）360ng/ul

上游引物200nm

下游引物200nm

一种肺炎支原体恒温检测试剂盒其特异性引物序列如下：

上游引物1：

agaacttgaaggtcaagatgttacttgatcaac（seqidno：1）

下游引物1：

gttttagacctaaatttgcaaaactttcgtaaa（seqidno：2）

优选的，一种肺炎支原体恒温检测试剂盒采用的重组酶选自e.colirect蛋白；λ噬菌体β蛋白；啤酒酵母sepι/stpβ；啤酒酵母dpa蛋白；啤酒酵母stpα蛋白；粟酒裂殖酵母p¹⁴⁰/exoǁ蛋白以及rrpι、hpp-ι、v-sep、icp8蛋白。优选的，一种肺炎支原体恒温检测试剂盒采用的重组酶为不依赖于能量分子的重组酶。

优选的，恒温扩增的温度为35～42℃，优选扩增温度为37℃。

本发明的有益效果：

①本发明采取的扩增方式是恒温扩增方式，相对于传统的检测培养方法，扩增用时短，特异性好，检测过程更快捷。

②本发明的恒温扩增体系，不依赖于atp、磷酸肌酸等高能能量分子，相对现有的恒温扩增体系，其组成更为简单，成本更为低廉，使用更为方便。

③本发明的恒温扩增体系可以对肺炎支原体核酸序列实现扩增，扩增速度快且稳定，可以在15min以内完成扩增反应，扩增的灵敏度和准确度高，不易出现错配，扩增效果好。

附图说明

图1至图3依次分别为实施例1至实施例3的电泳结果图，图中电泳结果图的标号对应实施例中反应管的标号。

具体实施方式

一种肺炎支原体恒温检测试剂盒，包括反应液、启动液、反应酶系、上游引物和下游引物，各成分的具体组分如下：

一种肺炎支原体恒温检测试剂盒，其反应液具体组成成分如下：

tris-hcl（ph=8.3）50mm

kcl60mm

(nh4)2so410mm

甜菜碱1m

tritonx-1000.1%

peg5%

dmso6%

bsa0.1mg/ml

一种肺炎支原体恒温检测试剂盒，其启动液具体组成成分如下：

氯化镁10mm

一种肺炎支原体恒温检测试剂盒，其反应酶系具体组成成分如下：

dntps200um

聚合酶bsu100ng/ul

单链结合蛋白262ng/ul

重组酶（e.colirect）360ng/ul

上游引物200nm

下游引物200nm

重组酶为不依赖于能量分子的重组酶。

作为上述反应试剂的进一步改进，所使用的tris-hcl的ph为8.3。

聚合酶为恒温扩增反应中常用的聚合酶，优选为bsu或klenow。重组酶选自e.colirect蛋白；λ噬菌体β蛋白；啤酒酵母sepι/stpβ；啤酒酵母dpa蛋白；啤酒酵母stpα蛋白；粟酒裂殖酵母p¹⁴⁰/exoǁ蛋白以及rrpι、hpp-ι、v-sep、icp8蛋白。

作为上述方法的进一步改进，恒温扩增的温度为37℃。

一种肺炎支原体恒温检测试剂盒其特异性引物序列如下：

上游引物1：

agaacttgaaggtcaagatgttacttgatcaac（seqidno：1）

下游引物1：

gttttagacctaaatttgcaaaactttcgtaaa（seqidno：2）。

下面结合具体的实验，进一步说明一种肺炎支原体恒温检测试剂盒的优势，但并非限制本发明。

实验样本来源：

以外购肺炎支原体经放大培养后提取得到的核酸溶液作为样本；

以外购金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、嗜血流感菌经放大培养后提取得到的核酸溶液作为特异性实验的样本；

以混合感染肺炎支原体-金黄色葡萄球菌、肺炎支原体-肺炎双球菌、肺炎支原体-嗜血流感菌经放大培养后提取得到的核酸溶液作为混合感染实验的样本；

以灭菌纯水为阴性对照样本。

实施例1（灵敏度实验）：

将肺炎支原体核酸按照10倍、100倍、1000倍、10000倍稀释，将稀释后的核酸依次标记为样本1、样本2、样本3、样本4，其浓度分别是10ng/ul、1ng/ul、0.1ng/ul、0.01ng/ul，用灭菌水作为阴性对照。取5个200ul反应管，依次标记为反应管1~5，分别加入20ul反应液、5ul反应酶系到反应管1~5中，在反应管1中加入2ul样本1，在反应管2中加入2ul样本2，依次类推，反应管5加入2ul灭菌水，最后用灭菌水将体系补足到45ul，混匀后再分别加入5ul启动液。

选择恒温水浴锅提供反应所需要的恒温环境，设置恒温水浴锅温度为37℃，反应时间为30min。反应结束后，从反应管1~5中分别取10ul产物，用2%的琼脂糖凝胶进行电泳，结果如图1。

实施例2（特异性实验）：

将肺炎支原体核酸、金黄色葡萄球菌核酸、肺炎双球菌核酸、嗜血流感菌核酸依次标记为样本1、样本2、样本3、样本4，其浓度均为10ng/ul。取4个200ul反应管，依次标记为反应管1~4，分别加入20ul反应液、5ul反应酶系到反应管1~4中，在反应管1中加入2ul样本1，在反应管2中加入2ul样本2，依次类推，最后用灭菌水将体系补足到45ul，混匀后再分别加入5ul启动液。

选择恒温水浴锅提供反应所需要的恒温环境，设置恒温水浴锅温度为37℃，反应时间为30min。反应结束后，从反应管1~4中分别取10ul产物，用2%的琼脂糖凝胶进行电泳，结果如图2。

实施例3（混合感染实验）：

本实施例将肺炎支原体-金黄色葡萄球菌、肺炎支原体-肺炎双球菌、肺炎支原体-嗜血流感菌核酸依次标记为样本1、样本2、样本3，其浓度均为10ng/ul。取4个200ul反应管，依次标记为反应管1~4，分别加入20ul反应液、5ul反应酶系到反应管1~4中，在反应管1中加入2ul样本1，在反应管2中加入2ul样本2，在反应管3中加入2ul样本3，反应管4加入2ul灭菌水，最后用灭菌水将体系补足到45ul，混匀后再分别加入5ul启动液。

选择恒温水浴锅提供反应所需要的恒温环境，设置恒温水浴锅温度为37℃，反应时间为30min。反应结束后，从反应管1~4中分别取10ul产物，用2%的琼脂糖凝胶进行电泳，结果如图3。

结论：

1.从图1的结果可以看出，肺炎支原体核酸浓度在10ng/ul、1ng/ul、0.1ng/ul在200bp处有清晰单一的目的条带，浓度0.01ng/ul有较弱单一的目的条带，说明本发明试剂盒，灵敏度高，扩增效果好。

2.从图2的结果可以看出，仅在样本1即肺炎支原体核酸在200bp处有扩增条带，其余样本无非特异性条带，说明本发明试剂盒扩增的特异性好，能准确的区分所检测的目的菌与其他菌。

3.从图3的结果可以看出，只有混合感染样本1~3在200bp处有扩增条带，说明样本中不同核酸对本发明试剂盒的检测不造成干扰，说明本发明试剂盒特异性好，稳定性高。

综上，本发明试剂盒的扩增效果好，特异性强，稳定性强，灵敏度高，检测过程更快捷。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效试剂变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

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<110>广州和实生物技术有限公司

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