球形棕囊藻的培养方法与流程

本发明涉及赤潮藻——球形棕囊藻，尤其是涉及其在20l大体积环境中稳定培养的球形棕囊藻的培养方法。

背景技术：

赤潮(redtide)又称有害藻华，是指在某一海域内,海洋中的浮游微藻、原生动物或细菌等在适宜的环境条件下大量繁殖或聚集，引起水质变坏、海水变色的海洋生态异常现象[1]。赤潮作为一种全球性的水污染，它不仅给海洋环境、海洋渔业和海水养殖造成严重危害，给世界经济带来了无法估量的损失，而且威胁人类的生存[2]。我们只有在充分了解赤潮的成因、赤潮对人类的危害、赤潮对世界经济的影响等诸多方面以后，才能更好防止赤潮的发生[2]。

1.赤潮成因

赤潮爆发是一种具有长远历史的生态现象，但近些年随着我国工业的发展，这种现象发生开始变得更加频繁。

沿海的工业、农业、水产养殖及生活污水的过度排放，大量的废水污水随径流汇集到江河湖海中，促使近海海水水体氮、磷等大量营养盐类激增，造成了近海海水水体的富营养化和海域水体的环境污染；当营养盐达到一定浓度，加上20～30℃的适宜海水温度及不同的光照强度，就会使得不同赤潮生物不断增长和繁殖；此外，海水盐度为27‰～30‰，也是引发赤潮的重要条件；海区地理位置、地理特征也是爆发赤潮的影响因素，如浅海区内弯都是赤潮多发的海域[3]。

并非满足了以上条件就一定能形成赤潮，适宜在该环境下生长的藻类也是必不可少的，能够引起赤潮的藻类种类繁多。有260种海洋浮游生物能生成赤潮,不同海区不同环境条件下,赤潮爆发时的优势藻、规模数量各不相同[4]。

2.球形棕囊藻及其培养

glennf.cota[5]等在文献中描述到球形棕囊藻是一种不同寻常的浮游植物，它能引发的大规模赤潮，它复杂的生活史，和它特别的理化性质都注定了其不同寻常。该种浮游植物能在非常广的温度和盐度范围生长，从赤道到极地都有其身影。黄思明[6]等描述到球形棕囊藻赤潮是我国东南沿海典型的高发赤潮藻种之一，球形棕囊藻在赤潮爆发过程中会产生大量的胶质、糖和溶血毒素，同时消耗大量溶解氧，造成水产品的大量死亡；而且其释放的二甲基丙磺酸(dmsp)和二甲基硫醚(dms)对海洋生态环境产生较大的影响。由此可见，对球形棕囊藻的防治是很有必要的。

沈萍萍[7]等的研究表明，球形棕囊藻具有一个比较复杂的异型生活史,介于两种不同的细胞形态之间:群体和单细胞。单细胞又有几种不同的形式:具有鞭毛的细胞,不动细胞,小游动细胞等。在实验室三角瓶中培养时，球形棕囊藻的生长周期很长，一般大于30天。王艳[8]等的研究表明磷是球形棕囊藻生长的首要影响因子，硝酸盐也是影响球形棕囊藻生长速率的重要影响因子，氮磷比例同样影响球形棕囊藻的生长；此外，不同株系的球形棕囊藻对硝酸盐的需求有很大差别。fe、微量元素以及维生素对球形棕囊藻的生长影响不明显，但在某些条件下fe不足会限制藻的光和作用，维生素等能影响藻的生物量。故在球形棕囊藻培养中，氮磷等大量元素的添加量直接影响藻的生长情况。

传统方法仅适用于无菌、小体积环境下培养藻种，在20l大体积有菌环境中培养很困难。逐级放大培养球形棕囊藻，获得大体积高密度藻液，有利于我们后期模拟赤潮爆发过程，揭示其发生机制，为研发球形棕囊藻的调控技术提供了重要的技术支持。

参考文献：

[1]汪艳涛,高强,姜少慧.赤潮灾害监测预报与减灾对策研究进展[j].中国渔业经济,2013(04):161-167.

[2]秦志高.海洋中的赤潮现象及其防治对策[j].南通航运职业技术学院学报,2005(03):46-48.

[3]侯静,胡成丽.浅谈近年我国赤潮的发生概况及防治措施[j].现代交际,2014(06):98.

[4]苟钊训,任春艳.赤潮的成因及其预报初探[j].聊城大学学报(自然科学版),2003(04):82-85.

[5]cota,g.f.,smith,w.o.,mitchell,b.g.photosynthesisofphaeocystisinthegreenlandsea[j].limnologyandoceanography,1994,39(4):948-953.

[6]黄思明,尹平河,玲,赵.一株芽孢杆菌对球形棕囊藻的溶藻效果[j].暨南大学学报(自然科学与医学版),2013,23(3):337-342.

[7]沈萍萍,吕颂辉.球形棕囊藻的生长特性及生活史研究[j].水生生物学报,2000,24(6):635-643.

[8]王艳,齐雨藻,李韶山.球形棕囊藻生长的营养需求研究[j].水生生物学报,2007,31(1):24-29.

技术实现要素：

本发明的目的在于提供球形棕囊藻的培养方法。

本发明包括以下步骤：

1)将培养到对数期的有菌球形棕囊藻藻液接入新鲜无菌f/2培养基中，在含f/2的三角瓶中接入藻种，培养；

2)将步骤1)中的600ml藻液全部接入含4l无菌f/2培养基的5l三角瓶中培养到对数期；

3)将步骤2)中的4.6l藻液全部接入含10l处理后海水的已消毒养藻缸中，向其中加入营养盐：10ml溶液1，5ml溶液2，1ml溶液3；在温度20℃，光照2000～3000lux，光照周期12h/12h，通气量为9l/min条件下培养，早晚各监测一次波长为440/680nm处的荧光值，荧光强度100对应细胞个数1000个/μl；

4)生长一天后，向步骤3)养藻缸中添加处理后海水6l，以及与步骤3)等量的营养盐，早晚各监测一次波长440/680nm处的荧光值；

5)每天向养藻缸中添加20ml溶液1；早晚各监测一次波长440/680nm处藻液的荧光值，直到长至所需细胞浓度。

在步骤1)中，所述对数期可为10天，所述在含f/2的三角瓶可在含400mlf/2的1l三角瓶中接入200ml藻种；所述培养的条件可在温度20℃，光照强度1400～1500lux，光照周期12h/12h条件下培养10天。

在步骤2)中，所述培养的条件可在温度20℃，光照4000lux，光照周期12h/12h下培养到对数期10天。

在步骤3)中，所述处理后海水的获得方法可为：将实验室ph为7.9～8.1、盐度为25％～30‰的陈海水用2μm膜过滤，每50l海水添加3ml的8％naclo液体处理过夜，添加1.2gna2s2o3解氯2h，获得处理后海水。

所述消毒养藻缸的获得方法可为：

(1)将藻缸清洗干净后，用0.8％naclo对藻缸进行多次喷雾，等待1天，得养藻缸；

(2)将步骤(1)所述养藻缸用自来水清洗后，再次进行喷雾0.8％naclo处理；

(3)在接藻前，用清水冲洗步骤(2)所述养藻缸内部，再喷雾75％乙醇消毒，待缸晾干后，用75％乙醇消毒后的塑料膜覆盖养藻缸。

在步骤4)中，所述营养盐溶液的制备方法可为：

(1)溶液1：称取nano3150g，nah2po410g，定容至1l蒸馏水中，标准添加量为10ml/20l；

(2)溶液2：称取na2edta·2h2o8.72g，cl3·6h2o6.3g，uso4·5h2o0.02g，znso4·7h2o0.04g，cocl2·6h2o0.02g，cl2·4h2o0.36g，namoo4·2h2o0.012g，定容至500ml蒸馏水中，标准添加量为5ml/20l；

(3)溶液3：称取vb10.2g，vb7(生物素)1mg，vb121mg，定容至100ml蒸馏水中，标准添加量1ml/20l。

本发明通过常规的1l和5l密闭无菌三角瓶逐级放大培养获得稳得的球形棕囊藻藻种，将该藻种接入20l体系，在光照强度为2000～3000lux，光照周期12h/12h，温度为20℃，盐度30‰，ph为8，通气量为9l/min，n、p过量的条件下培养。在环境消毒良好的情况下培养7～10天即可获得20l体系中具有相应细胞浓度的球形棕囊藻藻液。所述藻液能在较大体系中获得，对后期大规模模拟赤潮爆发提供可能。为杀藻物质处理赤潮藻提供了更大的模拟环境，对了解赤潮爆发的原因提供更多的理论依据，在藻类大规模稳定培养和赤潮治理方面具有广泛应用价值。

本发明在20l体系中的培养方法，所述球形棕囊藻密度达1000个/μl，颜色呈棕褐色，生长状态良好。

附图说明

图1为大量元素加倍对藻生长的影响。在图1中，横坐标表示时间，纵坐标表示荧光强度。

图2为溶液2(fe，cu等元素)和溶液3(维生素)添加频次对藻生长的影响。在图2中，横坐标表示时间，纵坐标表示荧光强度。

图3为光照对藻生长的影响。在图3中，横坐标表示时间，纵坐标表示荧光强度。

图4为环境及容器消毒对藻生长的影响。在图4中，横坐标表示时间，纵坐标表示荧光强度。

具体实施方式

实施例1：n，p对球形棕囊生长的影响

1)在光照3300lux，光照周期12h/12h，温度20℃，消毒彻底的透明玻璃缸中培养球形棕囊藻。

2)表1给出营养盐添加量，其中处理组的溶液1(n，p)添加量加倍，对照组照常添加，按照表1所述方式，每天分别向对照组和和处理组添加营养盐，其中对照组添加10ml的溶液1，处理组添加20ml的溶液1。

表1

3)每天检测藻液在440/680nm处的荧光值，连续监测1周以上。

4)如图1可见，溶液1(n，p)的加倍添加可以使藻继续生长。

实施例2：fe，cu及维生素等对藻生长的影响

1)在光照3300lux，光照周期12h/12h，温度20℃，消毒彻底的透明玻璃缸中培养球形棕囊藻。溶液1按表1所示处理组的量添加，溶液2(fe，cu等)和溶液3(维生素)在对照组每天供给，实验组仅在养藻第一天供给。

2)每天检测藻液在440/680nm处的荧光值，连续监测8天。

3)由图2可以看出，只需补充一次fe，cu及维生素就维持球形棕囊藻细胞增长。

实施例3：光照对藻生长的影响

1)在营养充足，温度20℃，消毒彻底，光照周期为12h/12h的透明玻璃缸中培养球形棕囊藻。

2)将步骤1中的藻分别放置于光照强度为3300lux光照强度下作为实验组，将剩余藻缸置于2200lux光照强度下作为对照组。

3)每天检测不同藻缸在440/680nm处的荧光值，连续监测10天以上。

4)从图3可以明显看出，光照强度较低的对照组藻同等条件下生长缓慢。

实施例4：藻缸及环境消毒

1)清洗干净养藻缸后，用0.8％naclo对养藻缸进行喷雾，晾干，用自来水冲洗干净，再次用0.8％naclo进行喷雾处理。

2)将上述养藻缸在紫外灯下照射0.5h处理，接入藻种前用清水冲洗养藻缸内部，并喷雾75％乙醇消毒，待缸晾干后使用。

3)对照组仅用自来水将藻缸冲洗干净，晾干。

4)本次实验全部使用75％消毒的全新塑料膜覆盖藻缸，并且每天用0.8％naclo对消毒组养藻环境进行处理。

5)正常培养球形棕囊藻，并每天检测藻液在440/680nm处的荧光值，连续监测6天以上，生长情况如图4所示。可见未彻底消毒的环境会导致藻死亡。

实施例5：荧光值为250时藻的状态

1)在营养充足，光照强度为3300lux，光照周期12h/12h，温度为20℃，通气量9l/min，消毒彻底的透明玻璃缸中培养球形棕囊藻。

2)培养一周后，藻的荧光值为250时，颜色呈棕色，生长状态良好。

本发明属于定鞭金藻门，棕色，直径为3～5μm的球形赤潮藻类。通过2μm滤膜过滤，浓度为8％的液体氯酸钠消毒和硫代硫酸钠解氯的方法处理海水，将藻种接入其中；增大营养盐添加量特别是n、p添加量，且每天加入；培养过程中定期清理周边环境，并将消毒后的透明塑料膜覆盖于养藻缸上，用浓度为0.8％的次氯酸钠溶液对周边环境进行喷雾消毒，每天两次。在光照强度为2000～3000lux，光照周期12h/12h，温度为20℃，盐度30‰，ph为8，通气量9l/min的条件下培养。通过1l体系，5l体系，到20l体系的逐级放大培养，得到所需密度球形棕囊藻藻液。球形棕囊藻逐级放大培养，获得大体积，高密度稳定球形棕囊藻藻液，有利于我们大规模模仿赤潮爆发，为赤潮治理提供更大体积的模拟环境。所述球形棕囊藻逐级放大培养方法在赤潮模拟和防治上均有重要意义。