一株传染性胸膜肺炎放线杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及一株传染性胸膜肺炎放线杆菌及其应用。

背景技术：

传染性胸膜肺炎放线杆菌(actinobacilluspleuropneumoniae,app)是引起猪传染性胸膜肺炎(porcineinfectionpleuropneumonia)的病原，是一种猪的高度接触性传染性呼吸道疾病，主要表现为爆发性流行，以纤维素性、出血性、坏死性肺炎为特征，发病率在8.5％～100％之间，死亡率在0.4％～100％之间，是当前育肥猪和种猪死亡的主要原因之一。因此传染性胸膜肺炎放线杆菌的防治对于养猪业的健康发展具有重大的意义。

胸膜肺炎放线杆菌血清型多达15种，且目前还有很多不能定型的临床分离菌株，各血清型之间缺乏有效的交叉免疫保护，不同国家、地区和猪场流行的优势血清型又不尽相同，因此，app的分离鉴定和分型在该病的防治中尤为重要。国内流行的血清型主要是1，2，3，5，7型，app外毒素在致病与免疫中起着重要作用，app一共有4种外毒素，即毒素apxⅰ、apxii、apxⅲ和apxⅳ，而且毒素apxⅰ和apxii在app毒力方面起着关键作用。不同血清型分泌的外毒素不一样。血清1型能同时分泌毒素apxⅰ、apxii和apxⅳ，是所有血清型毒株中毒力最强、免疫原性最好的毒株，同时也是我国流行的一种优势血清型毒株。目前，亟需一种新的具有较好免疫原性的菌株制备的疫苗。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一株传染性胸膜肺炎放线杆菌及其应用，该菌株毒力强，制备的疫苗免疫性好。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一株传染性胸膜肺炎放线杆菌，所述的传染性胸膜肺炎放线杆菌为胸膜肺炎放线杆菌(actinobacilluspleuropneumoniae)hnapp1，保藏编号：cgmccno：13333，保藏日期：2016年11月22日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

所述的传染性胸膜肺炎放线杆菌为传染性胸膜肺炎放线杆菌1型。

一种传染性胸膜肺炎放线杆菌在制备传染性胸膜肺炎放线杆菌灭活疫苗方面的应用。

所述的传染性胸膜肺炎放线杆菌灭活疫苗中，传染性胸膜肺炎放线杆菌菌量为1×10⁹cfu/ml。

所述的传染性胸膜肺炎放线杆菌灭活疫苗的制备方法为：将所述的传染性胸膜肺炎放线杆菌依次经过培养、收获和灭活得到疫苗原液后，加入佐剂即得疫苗。

所述的佐剂为氢氧化铝。

所述的传染性胸膜肺炎放线杆菌灭活疫苗的制备方法为：将传染性胸膜肺炎放线杆菌株hnapp1接种到tsb液体培养基，置于37℃摇床中培养，18h后收取培养物，测定浓度，调整培养物中的菌数为2×10⁹cfu/ml，加入甲醛至终浓度为0.2％，于37℃灭活12h；灭活后的培养物按体积比1:1加入氢氧化铝佐剂，混合制得传染性胸膜肺炎放线杆菌灭活疫苗。

本发明的有益效果：

1、本发明中的菌株hnapp1分离自发生典型呼吸困难急性死亡的育肥猪的心脏，在tsa固体培养基上分离时无其它细菌生长，只有传染性胸膜肺炎放线杆菌生长，在tsb液体培养基中增殖滴度高，达10⁹cfu/ml以上。

2、本发明中的菌株hnapp1对保育猪具有较强的致病力，引起保育猪发病死亡，具有良好的免疫原性。

3、根据本发明中的菌株hnapp1制备的疫苗对猪的传染性胸膜肺炎放线杆菌病具有较好的保护效果。

附图说明

图1为菌株hnapp1菌落形态。

图2为菌株hnapp1菌体革兰氏染色100×显微镜下形态。

图3为菌株hnapp1的pcr鉴定结果，图中的marker为dl2000bp，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，100bp；1，4为阴性对照；2为引物app3，app4对1型传染性胸膜肺炎放线杆菌标准株的扩增结果，3为引物app3，app4对菌株hnapp1的扩增结果；5为引物app1，app2对1型传染性胸膜肺炎放线杆菌标准株的扩增结果；6为引物app1，app2对菌株hnapp1的扩增结果。从图中可以看出，5和6为传染性胸膜肺炎放线杆菌通用引物扩增，片段为377bp，2，3为传染性胸膜肺炎放线杆菌1型引物扩增片段，大小为959bp，证明扩增片段为目的片段，符合预期设计大小。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1、传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离和鉴定

1.1病料采集

病料来自于2016年11月在河南省汝州市某大型养猪场发生重症肺炎呼吸困难急性死亡的5月龄育肥猪。

1.2培养基的制备

tsb液体培养基：将tsb肉汤粉(trypticsoybroth，胰蛋白胨大豆肉汤)30g，溶于1000ml超纯水中，115℃灭菌15min，加胎牛血清50ml、无菌1％nad(nicotinamideadeninedinucleotide，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，辅酶ⅰ)1ml。

tsa固体培养基：将tsa琼脂粉(trypticsoyagar，胰蛋白胨大豆琼脂)40g，溶于1000ml超纯水中，115℃灭菌15min，加胎牛血清50ml、无菌1％nad(根据需要添加)1ml；于4℃保存备用。

1.3细菌的分离培养

无菌采集病猪的心血接种于含有nad的tsa固体培养基上，37℃恒温培养箱中培养24h，长出一致的圆形凸起、半透明、光滑、湿润的，直径大小为1～1.5毫米的菌落，45°折射光下观察具有明显的金红带蓝色荧光(见图1)。纯化并接种于不含nad的tsa固体培养基上。在不含nad的tsa培养基上不能生长。革兰氏染色(见图2)，该菌为革兰氏阴性菌，球杆菌、小杆菌、部分形成丝状的菌体，命名为菌株hnapp1。

1.4菌株的鉴定

1.4.1设计引物

根据传染性胸膜肺炎放线杆菌apxiv基因的序列设计一对通用引物，用于传染性胸膜肺炎放线杆菌的扩增，引物序列如下：

app1：5’-gctcaccaacgtttgctcat-3’(seqidno.1)

app2：5’-ggggacgtaactcggtgatt-3’(seqidno.2)

扩增片段大小为377bp。

同时根据传染性胸膜肺炎放线杆菌荚膜cps1b基因的序列设计一对传染性胸膜肺炎放线杆菌1型的特异性引物，用于传染性胸膜肺炎放线杆菌1型的扩增，引物序列如下：

app3：5’-ctggagtaattacggcgactattcc-3’(seqidno.3)

app4：5’-aggagaagctagtagtacttgcattttc-3’(seqidno.4)

扩增片段大小为959bp。

1.4.2pcr鉴定

按照dna提取试剂盒的操作步骤提取出菌株hnapp1的dna，分光光度计测定浓度为100μg/ml，进行pcr鉴定。同时，设置1型传染性胸膜肺炎放线杆菌标准株为阳性对照，设置副猪嗜血杆菌4型标准株为阴性对照。

pcr扩增反应体系为25μl：10×缓冲液2.5μl，2.5mm(each)dntpsmix0.5μl，10μm/l通用引物app1，app2各1μl，5u/μlrtaq1μl，100μg/mldna模板1μl，加入ddh2o至25μl。

反应条件：95℃预变性5min，进入循环：95℃1min，57℃1min，72℃30s，共35个循环，最后72℃延伸10min，pcr产物4℃保存。

扩增产物分别进行电泳，每孔加样10μl，1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察结果。结果扩增出377bp片段(见图3)，测序与传染性胸膜肺炎放线杆菌8392株apxiva基因(genbankno:af188867)100％同源，测序结果如下，证明菌株hnapp1为传染性胸膜肺炎放线杆菌(actinobacilluspleuropneumoniae)。

ggggacgtaactcggtgattgatgccggtgcgggtaatgatacggttaatggcggtaatggcgatgacaccctcatcggcggcaaaggtaatgatattctaagaggtggctacggtgcggacacctatatctttagcaaaggacacggacaggatatcgtttatgaagataccaataatgataaccgcgcaagagatatcgacaccttaaaatttactgatattaatttatccgaactttggtttagccgagaaaataacgatttgattattaaatcattattaagtgaggataaagtcacggttcaaaattggtattcacaccaagatcataaaatagaaaatattcgtttatcgaatgagcaaacgttggtgagc(seqidno.5)

1.4.3血清型鉴定

参照1.4.2方法，用传染性胸膜肺炎放线杆菌1型的特异性引物app3，app4扩增，结果扩增出959bp大小片段(见图3)，测序与1型传染性胸膜肺炎放线杆菌4074株(genbankno：af518558)100％同源，证明菌株hnapp1为1型传染性胸膜肺炎放线杆菌。

1.5毒力试验

试验动物为2月龄断奶健康的保育猪8只。试验动物分为两组，对照组4只，试验组4只。将hnapp1接种tsb液体培养基，37℃摇床培养18h后，测定菌体浓度，连续10倍稀释涂布固体平板，低倍镜下活菌计数，计算原液菌体浓度，为2.8×10⁹cfu/ml，再调整至10⁸cfu/ml，试验组动物通过滴鼻感染3ml传染性胸膜肺炎放线杆菌液体培养物，对照组动物通过气管内接种3ml灭菌的tsb液体培养基。注射后连续观察2周，观察并记录其发病数和死亡数等情况。

试验组动物在接种传染性胸膜肺炎放线杆菌12h后表现出呼吸困难等症状，体温升高，耳部、腹部及臀部发绀，最后卧地不起，肌肉抽搐，窒息死亡，死前口鼻流出带泡沫的血液。第2天死亡1头，2天后死亡3头。对照组动物在试验期间食欲、精神、体温均正常。试验结束后剖杀试验组动物，同时剖杀4头对照组动物。采集病料，进行传染性胸膜肺炎放线杆菌分离。试验组剖检心肺纤素性渗出，心包粘连，肺紫红色，切面多汁，血色液体流出，气管、支气管充满泡沫状、血性粘液。对照组剖检均未发生明显的病理变化，对照组的4份病料均未分离到传染性胸膜肺炎放线杆菌，试验组的4份病料中均分离到传染性胸膜肺炎放线杆菌，pcr鉴定结果与hnapp1一致。

实施例2、疫苗的制备、安全性和效力试验

2.1疫苗的制备

将传染性胸膜肺炎放线杆菌株hnapp1接种到tsb液体培养基，置于37℃摇床中培养，18h后收取培养物，测定浓度，调整培养物中的菌数为2×10⁹cfu/ml，加入甲醛至终浓度为0.2％，于37℃灭活12h。灭活后的培养物按体积比1:1加入氢氧化铝佐剂，混合制得传染性胸膜肺炎放线杆菌灭活疫苗。

2.2疫苗的安全性试验：

选取2月龄健康保育猪10头，分为2组，每组5头。疫苗组：颈部肌肉注射4ml本疫苗；对照组：颈部肌肉注射4ml灭菌生理盐水。测定动物体温，观察临床表现，共观察2周。观察期间，疫苗组和对照组的保育猪在整个观察期间呼吸、食欲、精神状态都正常，注射部位无炎症，说明本发明的灭活疫苗安全性良好。

2.3疫苗的效力试验

选取2月龄健康仔猪30头，分为6组，每组5头。具体为：疫苗1-4组：每组分别注射本疫苗0.5ml、1ml、1.5ml和2ml，第5组为未免疫组，第6组为健康对照组，注射2ml灭菌生理盐水。疫苗组和健康对照组3周后二免注射同等剂量的疫苗或灭菌生理盐水。二免后14天各组用10⁹cfu的hnapp1菌液采取滴鼻攻毒。观察仔猪的临床表现，并每日测定体温，共观察2周。对死亡猪肺脏等器官进行传染性胸膜肺炎放线杆菌分离培养。

观察结果：疫苗组与未免疫组有明显的差异，攻毒后第二天，未免疫组的仔猪开始出现临床症状，体温升高，呼吸困难，第三天开始出现死亡，死前口鼻流血，四天内共死亡5头。剖检未免疫组死亡猪胸腔和腹腔有积液，并有纤维素性渗出物，心包粘连。肺脏肿大出血，气管充满血性泡沫物。健康对照组的仔猪均未发病。而疫苗组中，0.5ml疫苗组的5头仔猪中有2头出现临床症状和病例变化；1ml疫苗组的5头仔猪中有1头出现临床症状和病例变化；1.5ml和2ml疫苗组的5头仔猪均没有发病。免疫攻毒保护情况见下表。

注：“—”表示不适用。

由上表可以看出，本疫苗的最小免疫保护剂量为0.5ml含菌量为1×10⁹cfu/ml。说明本发明的灭活苗具有良好的保护效果。

以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>河南省农业科学院畜牧兽医研究所

<120>一株传染性胸膜肺炎放线杆菌及其应用

<160>5

<170>patentinversion3.5

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<213>人工序列

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<213>胸膜肺炎放线杆菌（actinobacilluspleuropneumoniae）

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