本发明涉及熊果酸衍生物、熊果酸衍生物的制备方法及其在抗肿瘤领域的用途。
背景技术：
熊果酸(ursolicacid，ua)，又名乌索酸、乌苏酸，属五环三萜类化合物，化学名3(β)-3-hydroxyurs-12-en-28-oicacid，其相对分子量为456.68，分子式为c30h48o3，是一种广泛分布于植物资源中的活性化合物。药理学研究表明，ua具有抗病毒、抗菌、抗肿瘤、抗骨质疏松、抗氧化、抗炎、治疗糖尿病和保肝等多种功效。ua水溶性差，缺乏靶标特异性，限制了其临床应用。
熊果酸的化学结构：
ua具有广谱的抗癌活性，研究表明，ua发挥抗肿瘤作用的机制包括：诱导肿瘤细胞凋亡和分化，抑制侵袭、扩增和血管生成，促进化疗曾敏作用，诱导细胞周期阻滞和自噬等。文献：(cn102558279b)、(孟艳秋等，齐墩果酸衍生物的合成及抗肿瘤活性的研究，药学学报2011,46(10):1215-1220)和(ming-chuanliuetal,synthesisandcytotoxicityofnovelursolicacidderivativescontaininganacylpiperazinemoiety,eurjmedchem,2012,(58),128-135)报道了熊果酸或齐墩果酸与1,2-二溴乙烷或1,3-二溴丙烷反应生成溴代乙醇酯或丙醇酯衍生物，再与伯胺或肿胺经sn2反应得到一系列衍生物。1,2-二溴乙烷或1,3-二溴丙烷与ua的28-cooh反应时缺乏选择性，会生成大量副产物，得到的溴代乙醇酯或溴代丙醇酯衍生物与伯胺或仲胺反应时，收率较低。孟艳秋等报道的文献中，齐墩果酸溴代乙醇酯衍生物与仲胺反应收率均低于10％。
技术实现要素：
本发明目的在于，以熊果酸为先导化合物，设计合成出一系列具有更好抗肿瘤活性的新型熊果酸衍生物。
本发明以熊果酸得到的新化合物，其结构通式为ⅰ、ⅱ所示：
其中r1、r2和r3如表1、表2所示：
表1通式ⅰ所代表的化合物ⅰ-1～ⅰ-22
表2通式ⅱ所代表的化合物ⅱ-1～ⅱ-8
本发明的另一目的在于，提供通式为ⅰ、ⅱ的熊果酸衍生物的制备方法。本发明的反应流程是通过下列步骤完成的，其中，阿拉伯数字2～24代表反应的化合物，如2即为化合物2，代表3-乙酰氧基熊果酸，9代表3-氧代熊果酸，17代表2,3-二肟熊果酸，化合物2～24在下文中不再赘述解释。
(1)熊果酸与乙酸酐反应得到3-乙酰氧基熊果酸(2)，化合物2分别与2-氯乙醇、3-氯-1-丙醇、4-氯-1-丁醇反应得到相应的化合物3～5；化合物3～5分别与甲基磺酰氯反应得到相应磺酸酯衍生物6～8；化合物6～8分别与哌嗪反应得到相应化合物ⅰ-1～ⅰ-3；化合物6～8分别与高哌嗪反应得到相应化合物ⅰ-4～ⅰ-6；
(2)化合物ⅰ-1分别与溴苄、4-氟溴苄反应得到化合物ⅰ-7和ⅰ-8；
(3)熊果酸与氯铬酸吡啶盐(pcc)反应得到3-氧代熊果酸(9)，化合物9分别与2-氯乙醇、3-氯-1-丙醇、4-氯-1-丁醇反应得到相应化合物10～12；化合物10～12分别与甲基磺酰氯反应得到相应磺酸酯衍生物13～15；化合物13～15分别与哌嗪反应得到相应化合物ⅰ-9～ⅰ-11；化合物13～15分别与高哌嗪反应得到相应化合物ⅰ-12～ⅰ-14；
(4)化合物ⅰ-9分别与溴苄和4-氟溴苄反应得到化合物ⅰ-15和ⅰ-16；
(5)化合物ⅰ-3、ⅰ-4、ⅰ-5、ⅰ-6、ⅰ-7、ⅰ-8经碱性条件水解后得到相应化合物ⅰ-17、ⅰ-18、ⅰ-19、ⅰ-20、ⅰ-21、ⅰ-22；
(6)分别将化合物ⅰ-9～ⅰ-14、ⅰ-17～ⅰ-20的粗品溶解在无水乙醇中，用浓盐酸调节ph≤3制备成相应产物的盐酸盐，抽滤，滤饼经蒸馏水洗涤过滤后，再用乙醇或乙酸乙酯超声浸渍洗涤1～3遍，抽滤即可得到相应产物的盐酸盐纯品，将产物的盐酸盐分散在无水乙醇中，加碱调节至ph≥7，减压浓缩，经萃取、干燥即可得到ⅰ-9～ⅰ-14、ⅰ-17～ⅰ-20纯品；
(7)3-氧代熊果酸(9)与亚硝酸异戊酯反应得到2-肟-3-氧代熊果酸(16)，化合物16与盐酸羟胺反应生成2,3-二肟熊果酸(17)，化合物17在乙醇中与氢氧化钠和次氯酸钠反应得到化合物18；化合物18分别与2-氯乙醇、3-氯-1-丙醇、4-氯-1-丁醇反应得到相应化合物19～21；化合物19～21分别与甲基磺酰氯反应得到相应磺酸酯衍生物22～24；化合物22～24分别与哌嗪反应得到相应化合物ⅱ-1～ⅱ-3；化合物22～24分别与高哌嗪反应得到相应化合物ⅱ-4～ⅱ-6；化合物ⅱ-1分别与溴苄和4-氟溴苄反应得到化合物ⅱ-7和ⅱ-8。
其中化合物3～15为合成通式ⅰ系列目标化合物过程的中间产物，如下所示，
其中，它们的相关基团r1、r2如表3所示：
表3通式ⅰ代表的中间体3～15
其中化合物16、17为通式ⅱ系列化合物合成过程中的中间产物，结构如下所示：
其中化合物18～24为通式ⅱ系列目标化合物合成过程中的中间产物，如下所示：
表4通式ⅱ代表的中间体18～24
本发明的再一目的在于，提供通式为ⅰ、ⅱ的熊果酸衍生物的用途。通式为ⅰ、ⅱ的熊果酸衍生物用于制备抗肿瘤药物的用途；进一步优选，通式为ⅰ、ⅱ的熊果酸衍生物用于hela和mnk45肿瘤细胞的抑制用途。
本发明的优点在于通式i、ⅱ的一系列熊果酸新衍生物，药理学实验表明相比现有技术，它们对hela细胞和mnk45细胞具有更显著的抗增殖能力，同时具有更高的收率，尤其重要的是本发明的熊果酸新衍生物水溶性好，适于临床应用。
具体实施方式
按照上述内容，在不脱离本发明上述基本技术思想的前提下，根据本领域的普通技术知识和惯用手段，对其内容还可以有多种形式的修改、替换或变更。下面通过具体实施例，对本发明的实施内容再进一步详细说明，但它们不是对本发明的限定。凡是基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
化合物ⅰ-1的合成：
于50ml茄形瓶中加入ua(2.0g,4.38mmol)，溶解于15ml吡啶中，控温0℃～10℃，缓慢滴加乙酸酐(1.0ml,10.58mmol)，滴加完毕后室温搅拌反应14h，tlc(环己烷/丙酮＝3:1)检测显示反应完全。将反应液倒入60ml冰水中，有固体析出，抽滤，滤饼以100ml乙酸乙酯溶解，并依此用1mol/l盐酸、蒸馏水、饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥过夜，减压浓缩，真空干燥得3-乙酰氧基-ua(2)2.02g，收率92.5％。
于50ml茄形瓶中加入化合物2(1.16g,2.33mmol)，以15mldmf溶解，加入2-氯乙醇(0.58g,7.20mmol)，碳酸钾(0.49g,3.55mmol)，60℃油浴中搅拌反应1h，tlc(环己烷/丙酮＝3:1)检测显示原料完全消失，停止反应。将反应液倒入50ml冰水中，有大量白色固体析出，抽滤，滤饼以100ml乙酸乙酯溶解，依此用蒸馏水、饱和氯化钠水溶液洗涤(两遍)，无水硫酸钠干燥过夜，减压浓缩、真空干燥得1.20g产物(3)，收率94.8％。
于50ml茄形瓶中加入化合物3(1.2g,2.21mmol)，以10ml吡啶溶解，控温0～10℃，缓慢滴加甲基磺酰氯(0.52ml,6.72mmol)，室温搅拌反应100min，tlc(环己烷/丙酮＝3:1)检测显示反应完全。将反应液倒入50ml冰水中，抽滤，滤饼以80ml乙酸乙酯溶解，并依次用1mol/l盐酸、蒸馏水、饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥过夜，减压浓缩、真空干燥得1.28g产物(6)，收率98.3％。
于50ml茄形瓶中加入化合物6(0.5g,0.806mmol)，以8mldmf溶解，加入无水哌嗪(0.6g,6.97mmol)，无水碳酸钾(0.16g,1.16mmol)80℃油浴中反应30min，tlc(环己烷/丙酮＝3:1或二氯甲烷/甲醇＝10:1)检测显示反应完全。将反应液倒入40ml冰水中，有白色固体析出，抽滤，滤饼用100ml乙酸乙酯溶解，并依次用蒸馏水、饱和氯化钠水溶液洗涤(两遍)，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析纯化，氯仿洗脱，得0.41g化合物ⅰ-1，为白色粉末，收率83.3％。mp:80.1-82.9℃。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ5.21(1h,s,h-12),4.52–4.44(1h,m,h-3),4.16–4.04(2h,m,ch2),3.10(4h,s,hinpiperazine),2.72(4h,s,hinpiperazine),2.63(2h,t,j＝5.6hz,ch2),2.18(1h,d,j＝12.5hz,h-18),2.04(3h,s,ch3),1.06(3h,s,ch3),0.93(6h,d,j＝5.8hz,2×ch3),0.85(9h,d,j＝4.9hz,3×ch3),),0.72(3h,s,ch3)。
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实施例2
化合物ⅰ-4的合成：
参照实施例1中化合物ⅰ-1的合成方法，但是以高哌嗪替代无水哌嗪，得黄白色粉末，总收率70.2％。mp:76.5-78.0℃。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ5.22(1h,s,h-12),4.53–4.44(1h,m,h-3),4.16(2h,s,ch2),3.38(4h,s,hinhomopiperazine),3.20(2h,s,ch2),2.97(4h,d,j＝24.4hz,hinhomopiperazine),2.04(3h,s,ch3),1.06(3h,s,ch3),0.94(6h,d,j＝3.8hz,2×ch3),0.85(9h,d,j＝4.6hz,3×ch3),0.72(3h,s,ch3)。
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实施例3
化合物ⅰ-8的合成：
于10ml鸡心瓶中加入化合物ⅰ-1(60mg,0.098mmol)，以2mldmf溶解，加入碳酸钾(17mg,0.123mmol)，4-氟溴苄(0.02ml,0.161mmol)，60℃油浴中反应30min，tlc(二氯甲烷/甲醇＝20:1)检测显示反应完全。自然冷却后以50ml乙酸乙酯、30ml水萃取，有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤两遍，无水硫酸钠干燥，制备薄层板纯化(二氯甲烷/甲醇＝20:1)，得产物29.8mg(ⅰ-8)，为黄白色粉末，收率42.3％，mp:140.0-141.8℃。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.76–7.58(2h,m,arh),7.12(2h,t,j＝8.2hz,arh),5.16(1h,s,h-12),4.51–4.43(1h,m,h-3),4.08(2h,s,ch2),2.73–3.90(10h,m,ch2and4×ch2inpiperazine),2.09(1h,d,j＝11.3hz,h-18),2.04(3h,s,ch3),1.04(3h,d,j＝7.4hz,ch3),0.92(6h,d,j＝10.4hz,2×ch3),0.88–0.81(9h,m,3×ch3),0.65(3h,d,j＝13.5hz,ch3)。
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实施例4
化合物ⅰ-9的合成：
于500ml茄形瓶中加入ua(10.0g,21.9mmol)，以300ml二氧六环溶解，加入pcc(11.8g,54.7mmol)室温搅拌，反应5h后tlc(石油醚：乙酸乙酯＝1:2v/v)显示原料消失，停止反应。加入含亚硫酸钠(4.2g,33.3mmol)的水溶液35ml，搅拌1h反应体系变为墨绿色，将其倒入500ml冰水中，有固体析出，抽滤，滤饼以乙酸乙酯溶解，并依次用蒸馏水、饱和氯化钠水溶液洗涤有机相，有机相用无水硫酸钠干燥过夜，过滤，减压浓缩，硅胶柱层析纯化(石油醚(60-90℃)：乙酸乙酯＝3:1)，得白色粉末3-氧代熊果酸(化合物9)8.06g，收率81.0％。以化合物9为原料，参照化合物ⅰ-1的合成方法获得化合物ⅰ-9，为白色粉末，总收率56.0％，mp:144.4-146.8℃。
1hnmr(400mhz,cdcl3)：δ5.24(1h,s,h-12),4.18–4.04(2h,m,ch2),3.19(4h,s,hinpiperazine),2.81(4h,s,hinpiperazine),2.65(2h,t,j＝5.4hz,ch2),2.59–2.47(1h,m,h-2),2.37(1h,d,j＝18.9hz,h-2),2.23–2.14(1h,m,h-18),1.08(6h,s,2×ch3),1.03(6h,s,2×ch3),0.94(3h,d,j＝5.5hz,ch3),0.85(3h,d,j＝6.3hz,ch3),0.77(3h,s,ch3)。
13cnmr(101mhz,cdcl3)δ218.04,177.42,138.33,125.48,61.20,56.39,55.33,53.06,49.91,48.20,47.52,46.82,43.72,42.27,39.60,39.38,39.15,38.95,36.83,36.77,34.29,32.65,30.70,28.06,26.67,24.30,23.56,21.62,21.24,19.69,17.23,17.13,15.36。
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实施例5
化合物ⅰ-17的合成：
于100ml茄形瓶中，加入化合物ⅰ-3粗品1.5g，溶解于42ml甲醇/水(v/v＝5:1)中，加入氢氧化钠(0.39g,9.75mmol)，30℃搅拌反应8h，tlc(二氯甲烷/甲醇＝10:1)检测显示原料完全消失。减压浓缩，加入150ml无水乙醇溶解，滴加浓盐酸并搅拌至ph≤3，有大量白色固体析出，抽滤，并用200ml蒸馏水冲洗，得白色滤饼。滤饼用100ml无水乙醇超声浸渍洗涤后抽滤(3遍)，可得到白色粉末(化合物ⅰ-17的盐酸盐纯品)，将其置于250ml茄形瓶中，加入150ml乙醇，超声分散，滴加饱和氢氧化钠溶液，并搅拌，至反应体系由浑浊变澄清透明，减压浓缩，加入150ml乙酸乙酯，并依次用蒸馏水(两遍)、饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥过夜，减压浓缩、真空干燥得白色粉末(ⅰ-17)1.0g，总收率约56％，mp:100.0-102.5℃。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ5.21(1h,s,h-12),4.06–3.91(2h,m,ch2),3.21(5h,m,h-3and4hinpiperazine),2.70(4h,s,hinpiperazine),2.41(2h,t,j＝7.0hz,ch2),2.20(1h,d,j＝11.2hz,h-18),1.07(3h,s,ch3),0.98(3h,sch3),0.93(3h,d,j＝5.8hz,ch3),0.90(3h,s,ch3),0.84(3h,d,j＝6.4hz,ch3),0.77(3h,s,ch3),0.73(3h,s,ch3)。
13cnmr(101mhz,cdcl3)δ177.08,137.70,125.01,78.49,63.27,56.99,54.68,52.38,49.31,47.56,47.00,43.16,41.55,39.02,38.55,38.37,38.24,38.10,36.45,36.26,32.55,30.15,27.65,27.47,26.70,25.81,23.72,23.04,22.79,22.66,20.69,17.80,16.63,16.54,15.17,14.99。
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实施例6
化合物ⅰ-18的合成：
参照化合物ⅰ-17的合成方法，以ⅰ-4替代ⅰ-3，得黄白色粉末，总收率58.7％，mp:189.2-192.0℃。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ5.22(1h,s,h-12),4.14–4.02(2h,m,ch2),3.27–2.78(9h,h-3and4×ch2inhomopiperazine),2.18(1h,d,j＝12.5hz,h-18),1.07(3h,s,ch3),0.98(3h,s,ch3),0.93(3h,d,j＝5.7hz,ch3),0.91(3h,s,ch3),0.84(3h,d,j＝6.4hz,ch3),0.77(3h,s),0.73(3h,s)。
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实施例7
化合物ⅱ-1的合成：
于50ml茄形瓶中加入化合物9(1.0g,2.2mmol)，以20ml叔丁醇溶解，加入叔丁醇钾(1.23g,10.98mmol)、亚硝酸异戊酯(1.24g,10.58mmol)，室温搅拌2.5h，tlc(环己烷/丙酮＝3:1)检测，显示原料完全消失。减压浓缩，加入100ml乙酸乙酯溶解，有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤两遍，无水硫酸钠干燥过夜，过滤，减压浓缩，硅胶柱层析纯化(石油醚(60-90℃)：乙酸乙酯＝5:1)，得2-肟-3-氧代熊果酸(16)970mg，收率75.0％。
于25ml茄形瓶中加入化合物16(550mg,1.14mmol)，以6ml吡啶溶解，加入盐酸羟胺(237mg,3.4mmol)，110℃反应2h。将反应液倒入50ml冰水中，有淡粉红色固体析出，抽滤，滤饼用100ml乙酸乙酯溶解，并依次用1mol/l盐酸、蒸馏水、饱和氯化钠水溶液洗涤有机相，有机相用无水硫酸钠干燥过夜，过滤，减压浓缩、真空干燥得2,3-二肟熊果酸(17)550mg，为淡粉红色粉末，收率96.8％。于100ml茄形瓶中加入化合物17(550mg,1.14mmol)，以40ml无水乙醇溶解，加入氢氧化钠(120mg,3mmol)，滴加次氯酸钠溶液2ml，室温搅拌2min，tlc(环己烷/丙酮＝2.5:1)检测显示反应完全。减压浓缩，残余物用适量乙酸乙酯溶解，并依次用蒸馏水、饱和氯化钠水溶液洗涤(两遍)，无水硫酸钠干燥过夜，过滤，滤液45℃下减压浓缩，经真空干燥得白色粉末502mg(化合物18)，收率88.7％，以化合物18为原料，参照化合物ⅰ-1的合成方法获得ⅱ-1，硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝15:1)得白色粉末，总收率49.2％。mp:134.1-136.8℃。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ5.29(1h,s,h-12),4.12(2h,t,j＝5.7hz,ch2),3.07(4h,d,j＝23.0hz,hinpiperazine),2.64(4h,d,j＝4.1hz,hinpiperazine),2.62(2h,d,j＝5.8hz,ch2),2.24(1h,d,j＝11.1hz,h-18),1.41(3h,s,ch3),1.33(3h,s,ch3),1.09(3h,s,ch3),0.94(3h,d,j＝5.7hz,ch3),0.91(3h,s,ch3),0.86(3h,d,j＝6.3hz,ch3),0.79(3h,s,ch3)。
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实施例8
合成的熊果酸新衍生物的抗肿瘤活性
37℃、5％co2条件下常规培养hela和mnk45肿瘤细胞，用0.25％胰酶消化后，配制成一定浓度的单细胞悬液。根据细胞生长速度的差异，按4000个/孔接种于96孔板，每孔加入细胞悬液100μl。24h后，加入浓度为10μm的化合物和cisplatin及相应溶剂对照的完全培养基。每孔加100μl(dmso终浓度＜0.1％)，每组设3个平行孔，于37℃继续培养72h后，弃上清。每孔加入100μl含0.5mg/mlmtt的完全培养基，继续培养4h，弃上清后，每孔加入150μldmso溶解mtt甲瓒沉淀，微型振荡器振荡混匀后，酶标仪在参考波长450nm，检测波长570nm条件下测定光密度值(od)，以溶剂对照处理的肿瘤细胞为对照组，用以下公式计算每种化合物作用下不同肿瘤细胞的抑制率。
取对数生长期的肿瘤细胞，用0.25％胰酶消化后，配制成一定浓度的单细胞悬液。根据细胞生长速度的差异，按4000个/孔接种于96孔板，每孔加入细胞悬液100μl。24h后，加入含不同浓度化合物及相应溶剂对照的完全培养基，每孔加100μl(dmso终浓度＜0.1％)，每种受试化合物设8个剂量组，每组设3个平行孔，于37℃继续培养72h后，弃上清。每孔加入100μl含0.5mg/mlmtt的完全培养基，继续培养4h，弃上清后，每孔加入150μldmso溶解mtt甲瓒沉淀，微型振荡器振荡混匀后，酶标仪在参考波长450nm，检测波长570nm条件下测定光密度值(od)。以溶剂对照处理的肿瘤细胞为对照组，计算出不同浓度所对应的抑制率后，利用统计分析软件graphpadprism6绘制细胞生长抑制率曲线，通过曲线拟合得到函数计算抑制率在50％时对应的化合物浓度即为其对该肿瘤细胞的半数抑制浓度(ic50)。相同条件下测定化合物对不同细胞的ic50值，每个细胞株重复三次取平均值。抗肿瘤活性结果见表5
表5熊果酸及其结构修饰物对hela和mnk45肿瘤细胞的抑制活性
表5中，a:化合物浓度为10μm时测得的抑制率；b:化合物的半数有效浓度；c:化合物的半数有效浓度大于10μm；d:顺铂为阳性对照药。