一种利用荧光分子印迹聚合物检测十溴二苯醚的方法与流程

本发明属于十溴二苯醚分析检测技术领域，具体涉及一种利用荧光分子印迹聚合物检测十溴二苯醚的方法。

背景技术：

持久性有机污染物（pops）是一类具有高毒、持久、生物积累性及远距离迁移性的有机物。多溴二苯醚属于新增的持久性有机污染物家族中的一种，由于不正当的处理已造成了全球性的危害。十溴二苯醚（dbdpo）是一种较为常见的多溴二苯醚，用途广泛，主要用作添加型阻燃剂，但是对其进行燃烧处理会产生二噁英等剧毒物质，还会干扰甲状腺的分泌引起生物性别错乱对人体造成很大危害。

检测十溴二苯醚残留方法中比较常见的是气相色谱-质谱联用法，其它还有电子轰击低分辨率或高分辨率质谱法和电子俘获-电离质谱法。然而这些方法存在样品前处理复杂，选择性差，仪器昂贵，检测时间长等缺点。因此，开发具有简便、高效及高选择性的分析技术很有必要。

近年来，分子印迹技术（molecularimprintingtechnique,mit）作为一种新的检测方法被提出并得到应用。mit的特点在于可专门针对特定目标分子即模板分子特异性识别和选择性吸附，解决了传统方法中选择性差的缺点。基于分子印迹技术合成的分子印迹聚合物具有制备简单、抗恶劣环境能力强、稳定性好(耐酸碱、高温、高压及有机溶剂)、使用寿命长、易保存、造价低廉等特点。荧光光谱法又称荧光分光光度法或荧光分析法，当试样接受了某一波长的光紫外光或可见光照射，分子即吸收了紫外或可见光的辐射能量，其电子能级跃迁至激发态，之后又以辐射的形式释放能量，使分子回到基态，在这个过程中分子从激发态回到基态发出的辐射就是荧光。荧光的一个特点是一般只发生在有π电子共扼的平面结构或刚性结构的分子中。π电子共扼程度越大或者是分子平面度越大，荧光的强度也越大。因此，分子荧光光谱可以有效测试带有π电子共扼结构的分子的浓度，而实现高灵敏度检测。

将高度灵敏的荧光分析法与高度选择性的分子印迹聚合物相结合，利用荧光信号弥补分子印迹聚合物缺乏信号传导的缺陷，且合成的荧光性分子印迹聚合物兼具抗干扰、高选择性和高灵敏度的优点，是一种极具应用潜力的快速检测技术。荧光分子印迹聚合物对目标物的检测是通过目标分析物特异性吸附到荧光性分子印迹聚合物的识别位点上，引起荧光强度的改变而实现。相比传统的检测方法，结合荧光光谱分析法和分子印迹技术检测具有操作简单、灵敏，高效和低检测限，对设备的要求低等特点，是一种极具应用潜力的快速检测技术。

结合分子印迹技术和荧光光谱分析法用于吸附和识别研究的专利和文献报道较多，其中用于检测pops的专利或文献报道甚少。中国发明专利(cn104237182a）公开一种锰掺杂的硫化锌量子点印迹传感器的制备方法，该法利用一种硅氧烷对所得的mn-zns量子点进行乙烯基改性为辅助单体，以甲基丙烯酸为功能单体，通过两步聚合制备一种能够识别2,6-二氯苯酚的磷光分子印迹聚合物。结合分子印迹技术和荧光光谱分析法用于检测十溴二苯醚的文献尚未见报道。

目前报道的荧光分子印迹聚合物或传感器大多是以量子点（如cdte）和有机染料(如罗丹明类)作为荧光检测信号，通过包埋和吸附的方式引入分子印迹聚合物体系中，造成这些荧光材料具有本身的局限性，比如化学稳定性不高，荧光强度不高及不稳定，此外还具有毒性问题，这些将限制它们在检测领域的应用。基于化学发光的荧光分子印迹聚合物除了克服了以上缺点外，还具备合成步骤简单，可实时性检测的优势，在药物分析、环境分析和食品分析等方面的广阔应用前景越来越受到人们的关注。然而，到目前为止荧光功能单体数量较少，价格较贵，设计合成过程复杂，开发合成新型高效的荧光功能单体迫在眉睫。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种利用荧光分子印迹聚合物检测十溴二苯醚的方法。该方法首先根据模板分子的结构，设计并合成荧光性含芘功能单体以及选择甲基丙烯酸羟乙酯作为共聚功能单体，接着利用两种功能单体的共聚物作为前体制备一种新型荧光分子印迹聚合物，该荧光分子印迹聚合物荧光寿命长，量子产率高，光稳定性强，stokes位移大。以该荧光分子印迹聚合物作为识别元件也是探测元件直接快速、高效、特异性识别目标物，减少样品前处理过程，并利用荧光光谱分析法作为检测方法，具有耗时少，费用低等优点。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种利用荧光分子印迹聚合物检测十溴二苯醚的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）合成荧光性功能单体-芘甲基丙烯酸甲酯（pymma）

在圆底烧瓶中，加入芘甲醇，随后加入新蒸馏的溶剂四氢呋喃和三乙胺，通氮气除氧气后封口，将圆底烧瓶置于冰浴中，逐滴加入甲基丙烯酰氯，回流反应过夜，经蒸发溶剂和过硅胶柱以提纯粗产物，得到纯的淡黄色pymma；

（2）合成识别十溴二苯醚的荧光分子印迹聚合物（dbdpo-fmip）

在圆底烧瓶中，加入新蒸馏的四氢呋喃溶剂和乙腈致孔剂，随后分别加入十溴二苯醚（dbdpo），步骤（1）制备的pymma，甲基丙烯酸羟乙酯（hema）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（edgma），通氮气除氧气3次，加入引发剂偶氮二异丁腈（aibn），在回流温度条件下反应一定时间，产物经离心后洗涤并干燥，得到含十溴二苯醚的交联共聚物，接着用混合溶液洗涤-离心循环数次以脱除十溴二苯醚模板分子，直到用紫外光谱法检测不到十溴二苯醚的特征吸收峰，最后，经在真空干燥箱中干燥，得到荧光分子印迹聚合物（dbdpo-fmip），dbdpo-fmip被保存在干燥器中待用；

（3）检测十溴二苯醚

将一定量步骤（2）制得的dbdpo-fmip加入到一系列已知浓度的十溴二苯醚目标物溶液中，混合液体经振荡一定时间使之吸附平衡，在一定测试条件下，用荧光分光光度计测量混合液体的荧光强度，并以荧光发射波长为横坐标，荧光强度为纵坐标绘制dbdpo-fmip对不同浓度dbdpo的荧光响应曲线，选择几种模板分子的结构类似物，作为对比物质，参与dbdpo-fmip特异性识别的研究。

上述步骤（1）中所述的芘甲醇、三乙胺和甲基丙烯酰氯摩尔比为：1:1-3:1-3。

上述步骤（1）中所述将所得粗产物经过硅胶柱提纯，展开剂为乙酸乙酯和石油醚，乙酸乙酯和石油醚的v/v=1:5-20。

上述步骤（2）中所述的十溴二苯醚与四氢呋喃溶剂比例为：0.1mmol:50-65ml。

上述步骤（2）中所述的dbdpo、pymma、hema和edgma摩尔比为：1:0.4-0.8:3.6-7.2:20-200。

上述步骤（2）中所述的混合溶液为乙腈和四氢呋喃，乙腈和四氢呋喃v/v=1:10-50。

上述步骤（2）中所述洗涤时间为10-180min，优选120min。

上述步骤（3）中所述的dbdpo-fmip与十溴二苯醚模板分子的比例为1mg:2.5-50ml。

上述步骤（3）中所述荧光分光光度计的测试条件为：λ激发=340nm，扫描范围为350-600nm，扫描速度：500nm/min，狭缝宽度5-15nm。

上述步骤（3）中所述的模板分子的结构类似物为：二苯醚，二溴二苯醚，五溴二苯醚，八溴二苯醚，十溴二苯乙烷或十溴二苯胺

具体地税，本发明采用以下技术方案：

一种利用荧光分子印迹聚合物检测十溴二苯醚的方法，包括以下步骤：

（1）合成荧光性功能单体芘甲基丙烯酸甲酯（pymma）

在圆底烧瓶中，加入芘甲醇，随后加入新蒸馏的溶剂四氢呋喃和三乙胺，通氮除氧后封口，将圆底烧瓶置于冰浴中，逐滴加入甲基丙烯酰氯，回流反应过夜。经蒸发溶剂、过硅胶柱提纯粗产物，得到纯的淡黄色pymma。

（2）合成十溴二苯醚–荧光分子印迹聚合物（dbdpo-fmip）

在圆底烧瓶中，加入新蒸馏的溶剂四氢呋喃和致孔剂乙腈，随后加入十溴二苯醚（dbdpo），pymma，甲基丙烯酸羟乙酯（hema）和乙二醇二甲基丙烯酸酯。通氮气除氧气3次，加入引发剂偶氮二异丁腈（aibn），在回流条件下反应。产物经离心后洗涤并干燥。最终将得到的含十溴二苯醚的交联聚合物用混合溶液离心洗涤-离心循环数次以脱除模板分子，直到用紫外光谱法上检测不到十溴二苯醚的特征吸收峰（吸收峰波长251.5nm)。最后，经在真空烘箱中干燥，得到荧光分子印迹聚合物（dbdpo-fmip）。dbdpo-fmip被保存在干燥器中待用。

（3）检测十溴二苯醚

将一定量步骤1（2）制得的dbdpo-fmip加入到一系列已知浓度的十溴二苯醚目标物溶液中，混合液体经振荡一定时间使之吸附平衡。在一定测试条件下，检测混合液体的荧光强度，并以荧光发射波长为横坐标，荧光强度为纵坐标绘制dbdpo-fmip对不同浓度dbdpo的荧光响应曲线。选择几种结构类似物，作为对比物质，参与dbdpo-fmip特异性识别的研究。

在本发明方法中，步骤（1）中所述的芘甲醇、三乙胺和甲基丙烯酰氯摩尔比为：1:1-3:1-3；其中所述将所得粗产物过硅胶柱子提纯，展开剂为乙酸乙酯和石油醚（v/v=1:10）

在本发明方法中，步骤（2）中所述的十溴二苯醚与四氢呋喃溶剂比例为：0.1mmol:55-65ml；其中所述dbdpo，pymma，hema和edgma摩尔比为：1:0.4-0.8:3.6-7.2:20-50；其中所述聚合反应在65-75℃条件下聚合24-48h。其中所述混合溶液为乙腈和四氢呋喃（v/v=1:10），其中所述洗涤时间为10-180min，优选120min。

在本发明方法中，步骤（3）中所述的dbdpo-fmip与模板分子溶液比例为：1mg:5ml；其中所述目标物溶液的浓度为：0、2、4、6、8、10、20、30、60和100μm；其中所述振荡吸附时间为10-240min，优选180min；其中所述荧光分光光度计的测试条件为：λ激发=340nm，扫描范围从350-600nm，扫描速度：500nm/min，狭缝宽度5-15nm；其中所述结构类似物为二苯醚和二溴二苯醚等。

本发明对应的荧光性非分子印迹聚合物的制备方法类似于如上所述的分子印迹聚合物的合成方法，但不加模板分子十溴二苯醚。

本发明提供的利用荧光分子印迹聚合物检测十溴二苯醚的方法，其优点在于：

（1）本发明选择十溴二苯醚为模板分子，合成pymma荧光功能单体，引入hema作为功能性共聚单体制备出新型的dbdpo-fmip，其制备方法和吸附机理示意图见图1，与传统方法相比，该法能实现对pops的“类特异性”吸附。

（2）本发明以芘的衍生物（pymma）作为荧光性功能单体，制备出量子产率高，荧光寿命长，光稳定性能优异的荧光性分子印迹聚合物。

（3）本发明结合分子印迹技术的高选择性和特异性与荧光光谱分析法的高灵敏度，提出一种简单，灵敏，高效的新方法用于检测持久性有机污染物-十溴二苯醚，极具应用潜力。

本发明用于快速检测十溴二苯醚。

附图说明

图1为本发明一种利用荧光分子印迹聚合物检测十溴二苯醚的方法的机理示意图。

图2为本发明所制备的荧光功能单体芘甲基丙烯酸甲酯的核磁氢谱图。

图3为本发明所制备的非分子印迹聚合物、分子印迹聚合物和未洗脱模板的印迹聚合物的傅里叶红外光谱图。

图4为本发明制备的荧光分子印迹聚合物荧光强度的时间稳定性示意图。

图5为本发明所采用的以十溴二苯醚为模板分子制备的荧光分子印迹聚合物吸附不同浓度模板分子前后的荧光强度随波长的变化曲线。

图6为本发明所采用的以十溴二苯醚为模板分子制备的荧光分子印迹聚合物对模板分子十溴二苯醚的荧光强度响应曲线。

图7为本发明所采用的以十溴二苯醚为模板分子制备的荧光分子印迹聚合物对不同模板分子相似物-二苯醚（dpe）和二溴二苯醚（dbdpe）的选择性检测结果示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细描述

本发明利用荧光分子印迹聚合物检测十溴二苯醚，其机理见图1，与传统方法相比，该法能实现快速，灵敏，高选择性吸附十溴二苯醚，且合成新型的荧光分子印迹聚合物具有良好的光稳定性能，量子产率高和荧光寿命长等特点。

实施例1

（1）荧光性功能单体-芘甲基丙烯酸甲酯（pymma）的合成

在250ml圆底烧瓶中，加入2.0g芘甲醇，随后加入80.0ml新蒸馏的溶剂四氢呋喃和3.6ml三乙胺，通氮除氧后封口，将圆底烧瓶置于0℃冰浴中，逐滴加入2.5ml甲基丙烯酰氯。将圆底烧瓶置于恒温水浴振荡器中振荡，回流反应15h。蒸发溶剂，过硅胶柱子[乙酸乙酯:石油醚（v:v）=1:10]，得到淡黄色产物。如图2所示，从核磁氢谱图可知，所制备的荧光功能单体为pymma。

（2）十溴二苯醚荧光分子印迹聚合物的合成

在100ml圆底烧瓶中，加入55ml新蒸馏的溶剂四氢呋喃和10ml致孔剂乙腈，随后分别加入0.1015g十溴二苯醚、0.0240gpymma、0.04mlhema和30.92mledgma。通氮除氧3次，加入0.0024g偶氮二异丁腈，在75℃下回流反应24h。产物离心后洗涤、干燥。将得到的含十溴二苯醚的交联聚合物用乙腈和四氢呋喃混合液（v:v=1:10）浸泡1.5h，重复8次。离心-洗涤数次以脱除模板分子，直到用紫外光谱法检测不到十溴二苯醚的特征吸收峰（特征吸收波长λ=251.5nm）。产物在真空干燥箱中干燥，得到识别十溴二苯醚的荧光分子印迹聚合物（dbdpo-fmip）。如图3所示，从傅里叶红外光谱图可知，证实荧光分子印迹聚合物的形成。

（3）对应的荧光性非分子印迹聚合物(fnip)的制备方法类似如上步骤（2）的合成方法，但不加十溴二苯醚。

实施例2

（1）荧光性功能单体-芘甲基丙烯酸甲酯（pymma）的合成

在250ml圆底烧瓶中，加入2.0g芘甲醇，随后加入80.0ml新蒸馏的溶剂四氢呋喃和5.4ml三乙胺，通氮除氧后封口，将圆底烧瓶置于0℃冰浴中，逐滴加入3.8ml甲基丙烯酰氯。将圆底烧瓶置于恒温水浴振荡器中振荡，回流反应12h。蒸发溶剂，过硅胶柱（乙酸乙酯:石油醚=1:10），得到淡黄色产物。

（2）十溴二苯醚荧光分子印迹聚合物的合成

在100ml圆底烧瓶中，加入60ml新蒸馏的溶剂四氢呋喃溶剂和10ml致孔剂乙腈，随后加入0.1015g十溴二苯醚，0.0360gpymma，0.06mlhema和1.64mledgma。通氮除氧3次，加入0.0036g偶氮二异丁腈，在70℃下回流反应36h。产物离心后洗涤干燥。将得到的十溴二苯醚的交联聚合物用乙腈和四氢呋喃混合液（v:v=1:10），洗涤1.5h，重复8次。离心洗涤数次，脱除模板分子，直到紫外光谱上检测不到十溴二苯醚的峰（λ=251.5nm），最后，产物在真空干燥箱中干燥，得到检测十溴二苯醚的分子印迹聚合物。并在干燥器中保存。

（3）对应的荧光性非分子印迹聚合物(fnip)的制备方法类似如上步骤（2）的合成方法，但不加十溴二苯醚。

实施例3

（1）荧光性功能单体-芘甲基丙烯酸甲酯（pymma）的合成：

在250ml圆底烧瓶中，加入2.0g芘甲醇，随后加入80.0ml新蒸馏的溶剂四氢呋喃和9.0ml三乙胺，通氮除氧后封口，将圆底烧瓶置于0℃冰浴中，逐滴加入6.2ml甲基丙烯酰氯。将圆底烧瓶置于恒温水浴振荡器中，回流反应8h。蒸发溶剂，过硅胶柱（乙酸乙酯：石油醚=1:10），得到淡黄色产物。

（2）十溴二苯醚荧光分子印迹聚合物的合成：

在100ml圆底烧瓶中，加入65ml新蒸馏的溶剂四氢呋喃溶剂和10ml致孔剂乙腈，随后加入0.1015g十溴二苯醚，0.0480gpymma，0.08mlhema和2.4mledgma。通氮除氧3次，加入0.0048g偶氮二异丁腈，在65℃下回流反应48h。产物离心后洗涤干燥。将得到的十溴二苯醚的交联聚合物用乙腈和四氢呋喃混合液（v:v=1:10），洗涤1.5h，重复8次。离心洗涤数次，脱除模板分子，直到紫外光谱上检测不到十溴二苯醚的峰（λ=251.5nm），最后，产物在真空干燥箱中干燥，得到检测十溴二苯醚的荧光分子印迹聚合物。并在干燥器中保存。

（3）对应的荧光非分子印迹聚合物(fnip)的制备方法类似如上步骤（2）的合成方法，但不加十溴二苯醚。

实施例4

将1mg实施例1或实施例2或实施例3制得的dbdpo-fmip和fnip分别分散于5ml四氢呋喃溶液中，置于振荡器上室温振荡过夜后，用荧光分光光度计检测悬浮液的荧光强度，作为空白（blank）荧光强度，并与dbdpo-fmip和fnip吸附模板分子结构类似物后的荧光强度作对比。

将1mg实施例1或实施例2或实施例3制得的dbdpo-fmip分散于5ml四氢呋喃溶液中，置于振荡器上室温振荡，每隔10min，用荧光分光光度计检测60min内该悬浮液的荧光强度如图4所示，dbdpo-fmip的荧光强度基本不发生改变。结果表明，本发明所制备的荧光分子印迹聚合物（dbdpo-fmip）具有很好的稳定性。

实施例5

将1mg实施例1或实施例2或实施例3制得的dbdpo-fmip分别分散于5ml不同浓度十溴二苯醚的四氢呋喃溶液（模板分子浓度分别为0、2、4、6、8、10、20、30、60和100μm）中，置于振荡器上室温振荡过夜后，用荧光分光光度计检测这些悬浮液的荧光强度。以荧光发射波长为横坐标，荧光强度为纵坐标绘制得到dbdpo浓度对dbdpo-fmip的荧光强度的影响如图5所示，图5中曲线由下至上分别是不同浓度十溴二苯醚（0、2、4、6、8、10、20、30、60、100μm）存在下的荧光物质的荧光光谱，随着dbdpo浓度的升高，悬浮液的荧光强度随之增强，表明本发明所制备的荧光分子印迹聚合物（dbdpo-fmip）具有很好的光学检测十溴二苯醚的能力。

实施例6

将1mg实施例1或实施例2或实施例3制得的dbdpo-fmip分别分散于5ml不同浓度十溴二苯醚的四氢呋喃溶液（模板分子浓度分别为0、2、4、6、8、10、20、30、60和100μm）中，置于振荡器上室温振荡过夜后，用荧光分光光度计检测这些悬浮液的荧光强度。以浓度[c]为横坐标，相对荧光强度（f/f0）为纵坐标，绘制荧光分子印迹聚合物对模板分子十溴二苯醚的荧光强度响应曲线（见图6，相关系数为0.996，最低检测限0.061μm）。结果表明，本发明所制备的荧光分子印迹聚合物（dbdpo-fmip）具有很好的光学检测十溴二苯醚的能力。

实施例7

将1mg实施例1或实施例2或实施例3制得的dbdpo-fmip加入5ml浓度为20μm的二苯醚（dpe,模板分子的结构类似物）四氢呋喃溶液中，置于振荡器上室温振荡过夜后，然后用荧光分光光度计检测该悬浮液的荧光强度。

实施例8

将1mg实施例1或实施例2或实施例3制得的dbdpo-fmip加入5ml浓度为20μm的二溴二苯醚（dbdpe,模板分子的结构类似物）四氢呋喃溶液中，置于振荡器上室温振荡过夜后，然后用荧光分光光度计检测该悬浮液的荧光强度。

将实施例5、实施例7和实施例8中的荧光强度作图如图7所示。结果显示，与模板分子的结构类似物相比，dbdpo-fmip识别模板分子十溴二苯醚后，荧光强度增加最大，说明本发明所制备的荧光分子印迹聚合物对模板分子十溴二苯醚具有特异性识别能力。意味着本发明所制备的荧光分子印迹聚合物对十溴二苯醚有明显的专一识别性，荧光强度增加效果高于其它类似物。

上述的具体实施方式是对本发明申请的进一步详细说明，但本发明权利要求保护的范围并不局限于实施方式中所描述的范围，凡采用等同替换或等效变形的技术方案，均落在本发明权利要求的保护范围。