本发明属于生物
技术领域：
：，具体涉及ctip抑制剂的新用途及一种精准的基因组dna片段编辑方法。
背景技术：
：：自从人类基因组计划(humangenomeproject)和dna元件百科全书(encyclopediaofdnaelements)项目的完成，科学家们分析和鉴定了大量的基因组中的基因和dna调控元件[1,2]。在基因表达调控中起重要作用的dna调控元件包括启动子、增强子、沉默子和绝缘子等。然而，多数调控元件的功能并没有得到实验的验证和阐明[2-8]。探索基因和dna调控元件的功能，可以通过遗传学dna片段编辑来进行研究。早期的基因编辑和基因功能修饰是通过基因转座和转基因实现的[9-14]。伴随测序技术的发展，反向遗传学被应用于对基因组进行特定的突变[15,16]。特别是依赖于同源重组的基因打靶小鼠迅速地被应用到科学研究中[15,17,18]。此外，在小鼠和斑马鱼中dna片段的反转和重复被应用于去研究特定的基因组结构变化[19-24]。近几年，源于细菌和古菌的ⅱ型成簇规律间隔短回文重复系统[clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(crispr)/crispr-associatednuclease9(cas9)，crispr/cas9]是新兴基因组编辑技术[25-27]，由于它设计简单和操作方便，迅速地被应用到真核基因组编辑。我们利用crispr/cas9系统在人细胞系和小鼠中实现了dna片段遗传编辑(删除、反转和重复)[28]。通过cas9和两个sgrnas在基因组中进行两个位点靶向断裂，在ctip等蛋白参与的修复系统作用下可以实现dna片段的删除、反转(倒位)、重复、易位和插入(如果提供供体)等[29-32]。这一dna片段编辑的遗传操作，能够用来研究原钙粘蛋白和珠蛋白的基因表达调控和三维基因组结构[28,31-33]。具体的说，针对目dna片段设计两个sgrnas(single-guidernas,sgrnas)，在sgrnas的介导下spcas9(来自streptococcuspyogenes)能够在pam(protospaceradjacentmotif)位点上游对dna双链进行切割，形成dna双链断裂，在细胞自身修复系统下实现dna片段的遗传编辑。在dna片段编辑接头连接处，我们发现存在一定比例的dna片段精准连接(即两个sgrnas所在位点的pam上游3bp处切割断裂的dna接头直接连接)，同时也存在不精准的连接(连接处存在碱基的删除和插入)。目前可以通过crispr/cas9系统实现dna片段的编辑，但是对于深入研究特定dna区段的精准功能，有效地实现dna片段的精准遗传编辑包括删除、反转(倒位)、重复、易位和插入的方法还有待发现。技术实现要素：为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供ctip抑制剂的新用途及一种精准的基因组dna片段编辑方法。为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：本发明的第一方面，提供ctip抑制剂在基因组dna片段编辑中的用途。优选地，所述ctip抑制剂用于提高基因组dna片段编辑的精准率。优选地，所述ctip抑制剂用于提高基因组dna片段编辑后连接接头的直接连接率。所述基因组dna片段编辑后连接接头的直接连接是指连接接头处不存在碱基的删除和插入。所述提高是指与未采用ctip抑制剂时相比。所述基因组dna片段编辑包括但不限于：基因组dna片段的删除、反转或倒位、重复、易位和插入。所述基因组dna片段编辑可以是体内的，亦可以是体外的。所述ctip抑制剂是指对于ctip具有抑制效果的化合物。对于ctip具有抑制效果包括但不限于：抑制ctip活性，抑制ctip的磷酸化，或者抑制ctip基因的转录、剪接、翻译、修饰或任何形式的活性表达。所述ctip抑制剂可为sirna、shrna、sgrna、抗体、小分子化合物等。本发明的第二方面，提供ctip抑制剂在制备基因组dna片段编辑产品中的用途。优选地，所述ctip抑制剂作为提高基因组dna片段编辑的精准率的有效成分。优选地，所述ctip抑制剂作为提高基因组dna片段编辑后连接接头的直接连接率的有效成分。所述基因组dna片段编辑包括但不限于：基因组dna片段的删除、反转或倒位、重复、易位和插入。所述提高是指与未采用ctip抑制剂时相比。所述ctip抑制剂是指对于ctip具有抑制效果的化合物。对于ctip具有抑制效果包括但不限于：抑制ctip活性，抑制ctip的磷酸化，或者抑制ctip基因的转录、剪接、翻译、修饰或任何形式的活性表达。所述ctip抑制剂可为sirna、shrna、sgrna、抗体、小分子化合物等。所述基因组dna片段编辑产品，包括有效量的ctip抑制剂及至少一种能够对基因组dna片段进行编辑的基因组编辑工具。所述基因组dna片段编辑产品必然包含ctip抑制剂，并以ctip抑制剂作为提高基因组dna片段编辑的精准率或提高基因组dna片段编辑后连接接头的直接连接率的有效成分。所述基因组dna片段编辑产品中发挥提高基因组dna片段编辑后连接接头的精准连接率作用的有效成分可仅为ctip抑制剂，亦可包含其他起到类似功用的化学品。所述能够对基因组dna片段编辑进行干预的物质可为sirna、shrna、sgrna、抗体、小分子化合物等。本发明对所述基因组编辑工具没有特殊的限制，只要能够产生dna双链断裂即可。例如，所述基因组编辑工具可选自但不限制于crispr/cas9、crispr/cpf1、crispr/c2c1、telen、zfn、i-scei及相应基因组编辑工具改造优化的衍生系统等。本发明的一些实施方式中，例举了采用包括针对目的dna片段的sgrnas及cas9的crispr/cas9系统对目的dna片段进行编辑。使用时候，可以同步地或顺序地给予有效量的ctip抑制剂及至少一种能够对基因组dna片段进行编辑的工具。亦即，所述ctip抑制剂可以在待编辑对象接受基因组dna片段编辑前、中、后阶段向待编辑对象施用。所述基因组dna片段编辑的方式包括但不限于：突变、删除、反转或倒位、重复、易位和插入。本发明的第三方面提供一种基因组dna片段编辑方法，所述方法利用基因组编辑工具对待编辑的基因组dna片段进行编辑时，使用ctip抑制剂对ctip进行抑制。对基因组dna片段进行编辑的方式包括但不限于：突变、删除、反转或倒位、重复、易位和插入。对基因组dna片段进行编辑可采用现有技术中的基因组dna片段编辑工具进行，例如本发明一些实施方式中所例举的针对目的dna片段的sgrnas及cas9的crispr/cas9。此外，还可以采用crispr/cpf1、crispr/c2c1、telen、zfn、i-scei及相应基因组编辑工具改造优化的衍生系统等对基因组dna片段进行编辑。优选地，所述ctip抑制剂用于提高基因组dna片段编辑的精准率。优选地，所述ctip抑制剂用于提高基因组dna片段编辑后连接接头的直接连接率。所述提高是指与未采用ctip抑制剂时相比。所述基因组dna片段编辑方法可以是体内的，亦可以是体外的。所述ctip抑制剂可以在待编辑对象接受基因组dna片段编辑前、中、后阶段向待编辑对象施用。本发明的一些实施方式中，例举了采用包括针对目的dna片段的sgrnas及cas9的crispr/cas9系统对目的dna片段进行编辑之前、中、后分别施用ctip抑制剂，均能够有效提供目的dna片段编辑的精准率。具体地，能够有效提高基因组dna片段删除后连接接头的精准连接率。所述ctip抑制剂是指对于ctip具有抑制效果的化合物。对于ctip具有抑制效果包括但不限于：抑制ctip活性，抑制ctip的磷酸化，或者抑制转录、剪接、翻译、修饰或任何形式的活性表达。所述ctip抑制剂可为sirna、shrna、sgrna、抗体、小分子化合物等。如本发明实施例1所例举的ctip抑制剂可以是包含针对ctip的sgrnas(seqidno.5～8所示)与spcas9的crispr-cas9系统。如本发明实施例3所列举所述ctip抑制剂也可选自小分子化合物3-ap。所述的对象可以是任意物种。所述对象包括原核生物、真菌、植物和动物。例如，所述的对象可以是哺乳动物或所述哺乳动物的细胞。所述哺乳动物的细胞可为离体的哺乳动物的细胞。所述哺乳动物可选自但不限于人、小鼠、大鼠、兔子、猴子、猪、牛、羊、狗。所述的对象还可以是农业相关植物，真菌类，蘑菇，灵芝，鱼类，养殖类动物等。本发明的第四方面，提供一种基因组dna片段编辑产品，包括有效量的ctip抑制剂及至少一种能够对基因组dna片段进行编辑的工具。所述基因组dna片段编辑产品必须包含ctip抑制剂，并以ctip抑制剂作为提高基因组dna片段编辑的精准率或提高基因组dna片段编辑后连接接头的精准连接率的有效成分。所述基因组dna片段编辑产品中发挥提高基因组dna片段编辑后连接接头的精准连接率作用的有效成分可仅为ctip抑制剂，亦可包含其他起到类似功用的化学品。所述能够对基因组dna片段编辑进行干预的工具可为sirna、shrna、sgrna、抗体、小分子化合物等。本发明的一些实施方式中，例举了采用包括针对目的dna片段的sgrnas及cas9的crispr/cas9系统对目的dna片段进行编辑。使用时候，可以同步地或顺序地给予有效量的ctip抑制剂及至少一种能够对基因组dna片段进行编辑的工具。亦即，所述ctip抑制剂可以在待编辑对象接受基因组dna片段编辑前、中、后阶段向对象施用。所述基因组dna片段编辑包括但不限于：基因组dna片段的突变、删除、反转或倒位、重复、易位和插入。ctip抑制剂还可以改变单位点编辑时碱基突变特征，所述突变包括碱基的加入和删除。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明经过广泛而深入的研究发现，抑制ctip的表达，能够提高基因组dna片段删除后连接接头的精准连接效率，提高基因组dna片段编辑后连接接头的精准连接比例。本发明可以实现精准的基因组dna片段编辑，可以更好地研究特定dna区段的精准功能，并且本发明所涉及的方法更为简单，操作容易，效率更高。附图说明图1a：加入了靶向ctip基因的sgrnas与针对stm位点的sgrnas、人源化spcas9质粒共同转染人胚肾hek293t细胞，stm位点的删除片段连接接头的精准连接结果。图1b：加入了靶向ctip基因的sgrnas与针对hs51位点的sgrnas、人源化spcas9质粒共同转染人胚肾hek293t细胞，hs51位点的删除片段连接接头的精准连接结果。图1c：加入了靶向ctip基因的sgrnas与针对β-globinlocus位点的sgrnas、人源化spcas9质粒共同转染人胚肾hek293t细胞，β-globinlocus位点的删除片段连接接头的精准连接结果。图1d：筛选得到的2个ctip基因突变细胞系中ctip基因敲除情况。图1e：ctip基因敲除的细胞系与正常hek293t细胞相比，stm位点dna片段删除接头的精准连接情况。图1f：ctip基因敲除的细胞系与正常hek293t细胞相比，hs51位点dna片段删除接头的精准连接情况。图1g：ctip基因敲除的细胞系与正常hek293t细胞相比，β-globinlocus位点dna片段删除接头的精准连接情况。图1h：正常hek293t细胞、ctip-#14和ctip-#27突变细胞系中，3-ap对stm位点的dna片段删除精准连接的情况。图1i：正常hek293t细胞、ctip-#14和ctip-#27突变细胞系中，3-ap对hs51位点的dna片段删除精准连接的情况。具体实施方式本发明经过广泛而深入的研究发现，抑制ctip的活性，能够提高基因组dna片段编辑后连接接头的精准连接效率，提高基因组dna片段编辑后连接接头的精准连接比例。ctipctip，又称为rbbp8，其22-45氨基酸是与mrn复合物(mre11-rad50-nbs1)的连接区域，它和c端的650-897氨基酸共同快速识别并与mrn复合物相互结合作用，定位于受损dna序列上完成损伤修复过程。ctip抑制剂ctip又称为rbbp8，其22-45氨基酸是与mrn复合物(mre11-rad50-nbs1)的连接区域，它和c端的650-897氨基酸共同快速识别并与mrn复合物相互结合作用，定位于受损dna序列上完成损伤修复过程。ctip抑制剂是指对于ctip具有抑制效果的化合物。对于ctip具有抑制效果包括但不限于：抑制ctip活性，抑制ctip的磷酸化，或者抑制ctip基因的转录、剪接、翻译、修饰或任何形式的活性表达。所述ctip抑制剂包括但不限于sirna、shrna、sgrna、抗体、小分子化合物。如本发明实施例1所例举的ctip抑制剂可以是针对ctip基因的crispr/cas9系统，所述针对ctip基因的crispr/cas9系统包括靶向ctip基因的sgrnas(seqidno.5～8所示)以及负责对ctip基因进行切割的cas9核酸酶。如本发明实施例3所列举所述ctip抑制剂还可以是能够抑制ctip活性的小分子化合物3-ap。此外，小分子化合物roscovitine(rosc)也可以抑制ctip活性。抑制ctip活性是指使ctip活性下降。优选地，相比于抑制前，ctip活性降低至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，最佳的降低至少90％。抑制ctip磷酸化可抑制ctip参与的靶向修复。抑制ctip的基因转录或表达是指：使ctip的基因不转录，或降低ctip的基因的转录活性，或者使ctip的基因不表达，或降低ctip的基因的表达活性。本领域技术人员还可以使用常规方法对ctip基因转录或表达进行调节，如基因敲除、基因沉默，干扰rna等。ctip的基因转录或表达的抑制可以通过qpcr或rna-seq及westernblot等技术方法检测表达量验证。优选地，与野生型相比，ctip基因转录或表达降低至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，又佳的降低至少90％，可能最佳地ctip基因完全没有表达。此外，也可采用本领域常规的技术来抑制ctip基因的翻译、修饰或任何形式的活性表达来起到抑制ctip活性的作用。小分子化合物本发明中指由几个或几十个原子组成，分子质量在1000以下的化合物。3-ap(3-aminopyridine-2-carboxaldehydethiosemicarbazone)是一种核糖核苷酸还原酶小分子抑制剂，有文章报道，3-ap通过抑制ctip蛋白磷酸化抑制ctip参与的基因修复。roscovitine(rosc)是细胞周期蛋白依赖性激酶(cdk)抑制剂，可作为ctip抑制剂。精准的基因组dna片段编辑方法本发明的精准基因组dna片段编辑方法，其利用基因组编辑工具对待编辑的基因组dna片段进行编辑时，使用ctip抑制剂对ctip进行抑制。所述ctip抑制剂可以在待编辑对象接受目的dna片段删除前、中、后阶段向待编辑对象施用。所述的对象可以是任意物种。所述对象包括原核生物、真菌、植物和动物。例如，所述的对象可以是哺乳动物或所述哺乳动物的细胞。所述哺乳动物的细胞可为离体的哺乳动物的细胞。所述哺乳动物可选自但不限于人、小鼠、大鼠、兔子、猴子、猪、牛、羊、狗。所述的对象还可以是农业相关植物，真菌类，蘑菇，灵芝，鱼类，养殖类动物等。基因组dna片段编辑产品本发明的基因组dna片段编辑产品，包括有效量的ctip抑制剂及至少一种能够对基因组dna片段进行编辑的工具。所述能够对基因组dna片段编辑进行干预的工具可为sirna、shrna、sgrna、抗体、小分子化合物。本发明的一些实施方式中，例举了采用包括针对目的dna片段的sgrnas及cas9的crispr/cas9系统作为基因组dna片段删除产品，对目的dna片段进行删除。使用时候，可以同步地或顺序地给予有效量的ctip抑制剂及至少一种能够对基因组dna片段进行编辑的工具。亦即，所述ctip抑制剂可以在对象接受基因组dna片段删除产品进行目的dna片段删除前、中、后阶段向对象施用。ctip抑制剂还可以改变单位点编辑时碱基突变特征，所述突变包括碱基的加入和删除。所述的对象可以是任意物种。所述对象包括原核生物、真菌、植物和动物。例如，所述的对象可以是哺乳动物或所述哺乳动物的细胞。所述哺乳动物的细胞可为离体的哺乳动物的细胞。所述哺乳动物可选自但不限于人、小鼠、大鼠、兔子、猴子、猪、牛、羊、狗。所述的对象还可以是农业相关植物，真菌类，蘑菇，灵芝，鱼类，养殖类动物等。在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本
技术领域：
：技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
技术领域：
：的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本
技术领域：
：常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。实施例1转染针对ctip基因的sgrnas能够提高dna片段删除后的精准连接效率1.stm位点和ctip基因的sgrnas质粒构建(1)购买引物从上海桑尼生物科技有限公司购买分别针对stm位点(β-globinre1)和ctip基因的sgrnas靶向序列的有5’悬挂端“accg”和“aaac”可以互补配对的正反向脱氧寡核苷酸。正反向脱氧寡核苷酸：β-globinre1sgrna1f：accgattgttgttgccttggagtg(seqidno.1)β-globinre1sgrna1r：aaaccactccaaggcaacaacaat(seqidno.2)β-globinre1sgrna2f：accgctggtcccctggtaacctgg(seqidno.3)β-globinre1sgrna2r：aaacccaggttaccaggggaccag(seqidno.4)ctipsgrna1f：accggagcagagcagcggggcaa(seqidno.5)ctipsgrna1r：aaacttgccccgctgctctgctc(seqidno.6)ctipsgrna2f：accgttgcccaaagattccccag(seqidno.7)ctipsgrna2r：aaacctggggaatctttgggcaa(seqidno.8)。(2)获得互补配对的带有悬挂端的双链dna1)用ddh2o将脱氧寡核苷酸溶解至100μm，并稀释至20μm；2)将正反脱氧寡核苷酸加入如下反应体系：反应条件：95℃水浴，5min，然后打开水浴锅盖子温度降至60℃左右，盖上盖子冷却至室温。(3)酶切pgl3-u6-sgrna-pgk-purovector1)用bsai限制性内切酶酶切载体质粒，反应体系如下：反应条件：37℃，1.5小时；2)胶回收纯化dna酶切片段，按照胶回收试剂盒(axygen)说明纯化。(4)连接酶切后的载体与带有悬挂端的双链dna连接体系如下：反应条件：室温反应1.5小时。(5)转化连接产物用stbl3感受态转化连接产物，在含氨苄抗生素(amp，100mg/l)lb平板培养过夜，37℃。(6)挑取单克隆测序1)从氨苄抗生素lb平板上挑取单菌落，lb(amp，100mg/l)液体培养过夜。2)质粒提取，按照质粒小抽试剂盒(axygen)说明提取。3)提取后的质粒送上海桑尼生物科技有限公司测序。(7)测序成功质粒进行中抽1)测序成功的质粒用stbl3感受态重新转化，在含amp(100mg/l)的lb平板培养过夜。2)上午挑取单菌落在2mllb(amp，100mg/l)液体培养基中培养8小时，然后转接到200mllb(amp，100mg/l)液体培养基中培养过夜。3)收集细菌，按照质粒中抽试剂盒(qiagen)说明提取质粒。2.人源化cas9质粒制备1)人源化cas9质粒从北京大学席建中实验室获得。2)用stbl3感受态重新转化，在lb平板(amp，100mg/l)培养过夜。3)上午挑取单菌落在2mllb(amp，100mg/l)液体培养基中培养8小时，然后转接到200mllb(amp，100mg/l)液体培养基中培养过夜，进行质粒中抽。3.用lipofectamine2000进行细胞转染1)hek293t细胞培养在培养瓶中，在37℃，含有5％co2细胞培养箱中培养，待其长至培养瓶80～90％。2)将长好的细胞在12孔板中用dmem完全无抗培养基(加入10％胎牛血清，无青链霉素双抗)进行铺板，过夜培养。3)待12孔板中的细胞长至80～90％时，将制备好的人缘化cas9质粒(800ng)、stm位点的sgrnas质粒(各600ng)和ctip基因的sgrnas质粒(各600ng)通过lipofectamine2000进行细胞转染，每个样品各两个重复。4)转染后两天，收集细胞，用基因组提取试剂盒(genomicdnapurificationkit,promega)提取基因组。4.制备高通量测序文库在dna片段预期删除接头的精准连接位点(pam上游3bp处cas9切割后接头直接相连)上游大约30bp处设计引物，然后将引物5’端加上带有barcode的illumina的测序接头，下游引物可以设计在远离拼接位点一些的位置并加上illumina的测序接头，从生工生物工程(上海)有限公司引物合成后进行pcr扩增，然后使用罗氏pcr纯化试剂盒(productno.:11732676001)进行纯化，dna产物溶解在10mmtris-hclbuffer(ph＝8.5)，等量混合后形成库，进行pe150第二代高通量测序。5.高通量测序数据处理高通量测序完成后，使用linux程序将样品的测序结果从文库中通过barcode分出来，保存在各自的文件夹，然后进行bwa-mem比对，比对后的序列通过varscan2程序(v2.3.9)分析dna片段的插入和删除突变，varscan2程序参数如下：针对stm位点，利用高通量测序引物对dna片段删除事件进行pcr扩增，进行高通量测序分析删除事件的dna末端连接情况，根据测序结果统计dna片段删除连接接头精准和不精准情况。研究表明，如图1a所示，和对照组相比，加入了靶向ctip基因的sgrnas与针对stm位点的sgrnas、人源化spcas9质粒共同转染人胚肾hek293t细胞，干扰了ctip基因表达，stm位点的删除片段连接接头的精准连接比例明显提高(与对照组比精准连接比例提高25.33％)，并且在连接接头处的精准连接效率大大提高(与对照组比精准连接效率提高20.29％)。同时参照上述方法，对于另外一个hs51re1(hs51位点)dna遗传编辑片段，结果如图1b所示，和对照组相比，加入了靶向ctip基因的sgrnas与针对hs51位点的sgrnas、人源化spcas9质粒共同转染人胚肾hek293t细胞，干扰了ctip基因表达，hs51位点的删除接头连接处精准的连接比例也有明显的提高(与对照组比精准连接比例提高12.56％)，并且在连接接头处的精准连接效率大大提高(与对照组比精准连接效率提高10.85％)。此外，选取的另一个β-globin位点(β-globinlocus)dna遗传编辑片段，结果如图1c所示，和对照组相比，加入了靶向ctip基因的sgrnas与针对β-globinlocus位点的sgrnas、人源化spcas9质粒共同转染人胚肾hek293t细胞，干扰了ctip基因表达，β-globin位点的删除接头连接处精准的连接比例也有明显的提高(与对照组比精准连接比例提高12.62％)，并且在连接接头处的精准连接效率大大提高(与对照组比精准连接效率提高12.71％)。针对上述不同位点的sgrnas靶向序列：β-globinre1sgrna1：gattgttgttgccttggagtg(seqidno.9)β-globinre1sgrna2：gctggtcccctggtaacctgg(seqidno.10)hs51re1sgrna1：gccacacatccaaggctgac(seqidno.11)hs51re1sgrna2：gagatttggggcgtcaggaag(seqidno.12)β-globinlocussgrna1：ggagatggcagtgttgaagc(seqidno.13)β-globinlocussgrna2：ctaggggtcagaagtagttc(seqidno.14)针对上述不同位点的的高通量引物：hiseq-hstm-del-af1:aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatcttgcttagagccaggactaattgc(seqidno.15)hiseq-hstm-del-2r:caagcagaagacggcatacgagatagtcaagtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctcagctctgcctgaaaggagtc(seqidno.16)hiseq-hhs51-del-af:atgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatctgcaaggagatccgtgtcgtc(seqidno.17)hiseq-hhs51-del-br:caagcagaagacggcatacgagatttgactgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatcttttttggctaacaacatagtgcttc(seqidno.18)hiseq-glob-del-af2:aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatctggttagcggcttgctcaattc(seqidno.19)hiseq-glob-del-br1:caagcagaagacggcatacgagatatcacggtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatcttcttcagccatcccaagactc(seqidno.20)综上所述，ctip是在nhej(non-homologousend-joining)系统中对dna断裂末端进行切割的重要辅助蛋白，转染了靶向ctip基因sgrnas的细胞干扰了ctip基因表达，以致抑制了该蛋白功能，从而在dna断裂后修复复合物对dna末端进行切割的能力降低。通过crispr/cas9系统用两个sgrnas靶向细胞修复系统中负责切割dna双链的ctip基因和针对目的dna片段的两个sgrnas共同作用，能够有效提高目的dna片段删除接头处精准连接的比例和效率。实施例2细胞系中ctip突变能够有效提高目的dna片段删除的精准连接效率1.通过crispr系统获得ctip突变的细胞系1)hek293t细胞培养在培养瓶中，待其长至培养瓶80～90％，将长好的细胞在12孔板中用dmem完全无抗培养基进行铺板，过夜培养。待12孔板中的细胞长至80～90％时，将制备好的人源化cas9质粒(800ng)和ctip位点的sgrnas质粒(各600ng)通过lipofectamine2000进行细胞转染。2)转染后48小时的细胞加入puromycin(2μg/ml)进行四天药物筛选，然后在新鲜培养基中培养八天，收集细胞，将均匀分散的细胞进行细胞计数，然后稀释到一定数目种到96孔板中(每孔只有一个细胞)，培养6天后只有一个细胞团的孔板继续加培养液再培养8天。3)收集部分细胞用ctip筛选引物鉴定dna片段编辑情况，剩余细胞继续培养。ctip基因筛选引物：cr-ctip1-1f：gtactacttctgggtctcccgc(seqidno.21)cr-ctip1-1r：cactacactgcaggtgctcacc(seqidno.22)cr-ctip2-1f：catgaatggagactgtgtgatgg(seqidno.23)cr-ctip2-1r：caaactttcacgtggacgtagag(seqidno.24)2.用lipofectamine2000进行ctip突变细胞系转染hek293t细胞和ctip突变细胞培养在培养瓶中，待其长至培养瓶80～90％，将长好的细胞在12孔板中用dmem完全无抗培养基进行铺板，过夜培养。待12孔板中的细胞长至80～90％时，将制备好的人源化cas9质粒(800ng)和stm位点的sgrnas质粒(各600ng)通过lipofectamine2000进行细胞转染，每个样品各两个重复。转染后两天，收集细胞，用基因组提取试剂盒(genomicdnapurificationkit,promega)提取基因组。3.制备高通量测序文库方法与实施例1中相同。4.高通量测序数据处理方法与实施例1中相同。如上所述，将转染了cas9质粒和针对ctip基因的sgrnas的hek293t细胞进行单克隆化，通过ctip基因筛选引物进行pcr筛选。在96个单克隆细胞中，筛选得到2个ctip基因敲除的细胞系，即ctip-#27和ctip-#14(如图1d所示)。接下来，在这两个ctip基因敲除的细胞系和正常hek293t细胞中，均转染针对stm位点的sgrnas、cas9质粒，转染48小时后收集基因组dna，利用高通量测序引物对靶向位点进行pcr扩增，建库进行高通量测序。结果如图1e所示，这两个ctip基因敲除的细胞系与正常hek293t细胞相比，stm位点dna片段删除接头的精准连接效率有效提高(分别提高17.02％和21.45％)，然而，对插入突变影响较小。在这两个ctip基因敲除的细胞系和正常hek293t细胞中，均转染针对hs51位点的sgrnas、cas9质粒，转染48小时后收集基因组dna，利用高通量测序引物对靶向位点进行pcr扩增，建库进行高通量测序。结果如图1f所示，这两个ctip基因敲除的细胞系与正常hek293t细胞相比，hs51位点dna片段删除接头的精准连接效率有效提高(分别提高8.63％和7.83％)，然而，对插入突变影响较小。在这两个ctip基因敲除的细胞系和正常hek293t细胞中，均转染针对β-globin位点的sgrnas、cas9质粒，转染48小时后收集基因组dna，利用高通量测序引物对靶向位点进行pcr扩增，建库进行高通量测序。结果如图1g所示，这两个ctip基因敲除的细胞系与正常hek293t细胞相比，β-globin位点dna片段删除接头的精准连接效率有效提高(分别提高12.58％和13.75％)，然而，对插入突变影响较小。综上所述，细胞系中ctip基因突变后可以有效地提高目的dna片段删除接头处精准连接的效率。实施例33-ap提高dna片段删除的精准连接效率1.在stm位点用lipofectamine2000进行细胞系转染将hek293t细胞和ctip突变细胞在12孔板中用dmem完全无抗培养基进行铺板，过夜培养。待12孔板中的细胞长至80～90％时，去除培养基，加入含有dmso或不同浓度的0.2μm，0.4μm，0.8μm，1.6μm的3-ap(sml0568，sigma)的dmem完全无抗培养基，将制备好的人源化cas9质粒(800ng)和针对stm位点的sgrnas(各600ng)通过lipofectamine2000进行细胞转染。24小时后，去除培养基，加入dmem完全双抗培养基(加入10％胎牛血清和1％青链霉素双抗)，再过24小时，收集细胞，用基因组提取试剂盒(genomicdnapurificationkit,promega)提取基因组，每个样品各两个重复。2.制备高通量测序文库方法与实施例1中相同。3.高通量测序数据处理方法与实施例1中相同。3-ap(3-aminopyridine-2-carboxaldehydethiosemicarbazone)是一种核糖核苷酸还原酶小分子抑制剂，有文章报道，3-ap通过抑制ctip蛋白磷酸化抑制ctip介导的同源重组修复[34]。在正常hek293t细胞、ctip-#14和ctip-#27突变细胞系中，在含有dmso(对照)或不同浓度(0.2μm，0.4μm，0.8μm，1.6μm)的3-ap(sigma)的培养基培养条件下，转染cas9质粒和针对stm位点的sgrnas质粒，24小时后，收集细胞提取基因组。用高通量测序引物进行pcr扩增获得stm位点的dna片段删除接头片段，等分子量混合后形成库，进行高通量测序。结果如图1h所示，对于正常的hek293t细胞，加入0.2～0.8μm的3ap就可以提高dna片段删除的精准连接比例；在ctip-#14细胞系中，伴随3-ap浓度的增加，dna片段删除的精准连接比例不断增加；在ctip-#27细胞系中，伴随3-ap浓度增加到0.4μm，dna片段删除的精准连接比例就不再增加；ctip-#27和ctip-#14细胞系中的精准连接比例均高于正常的hek293t细胞中；这也是与前面的实验结果相符合。此外，ctip-#27细胞系中的精准连接比例高于ctip-#14细胞细胞系中的精准连接比例。在ctip突变的细胞系中，加入低浓度的3-ap就可以提高dna片段删除的精准连接比例。在正常hek293t细胞、ctip-#14和ctip-#27突变细胞系中，在含有dmso(对照)或不同浓度(0.2μm，0.4μm，0.8μm，1.6μm)的3-ap(sigma)的培养基培养条件下，转染cas9质粒和针对hs51位点的sgrnas质粒，24小时后，收集细胞提取基因组。用高通量测序引物进行pcr扩增获得hs51位点的dna片段删除接头片段，等分子量混合后形成库，进行高通量测序。结果如图1i所示，对于正常的hek293t细胞，加入0.2～0.8μm的3ap就可以提高dna片段删除的精准连接比例；在ctip-#14细胞系中，伴随3-ap浓度的增加，dna片段删除的精准连接比例不断增加；在ctip-#27细胞系中，伴随3-ap浓度增加到0.4μm，dna片段删除的精准连接比例就不再增加；ctip-#27和ctip-#14细胞系中的精准连接比例均高于正常的hek293t细胞中；这也是与前面的实验结果相符合。此外，ctip-#27细胞系中的精准连接比例高于ctip-#14细胞细胞系中的精准连接比例。在ctip突变的细胞系中，加入低浓度的3-ap就可以提高dna片段删除的精准连接比例。综上所述，3-ap可以显著提高目的dna片段删除的精准连接比例。本申请的参考文献如下：1.stamatoyannopoulos,ja.(2012).whatdoesourgenomeencode？genomeres,22:1602-1611.2.theencodeprojectconsortium.(2012).anintegratedencyclopediaofdnaelementsinthehumangenome.nature,489:57-74.3.banerji,j,lolson,andwschaffner.(1983).alymphocyte-specificcellularenhancerislocateddownstreamofthejoiningregioninimmunoglobulinheavychaingenes.cell,33:729-740.4.zhang,t,phaws,andqwu.(2004).multiplevariablefirstexons:amechanismforcell-andtissue-specificgeneregulation.genomeres,14:79-89.5.neph,s,etal.(2012).anexpansivehumanregulatorylexiconencodedintranscriptionfactorfootprints.nature,489:83-90.6.shen,y,etal.(2012).amapofthecis-regulatorysequencesinthemousegenome.nature,488:116-120.7.thurman,re,etal.(2012).theaccessiblechromatinlandscapeofthehumangenome.nature,489:75-82.8.delaat,wanddduboule.(2013).topologyofmammaliandevelopmentalenhancersandtheirregulatorylandscapes.nature,502:499-506.9.mcclintock,b.(1950).theoriginandbehaviorofmutablelociinmaize.procnatlacadsciusa,36:344-355.10.mcclintock,b.(1984).thesignificanceofresponsesofthegenometochallenge.science,226:792-801.11.brinster,rl,etal.(1981).somaticexpressionofherpesthymidinekinaseinmicefollowinginjectionofafusiongeneintoeggs.cell,27:223-231.12.harbers,k,djahner,andrjaenisch.(1981).microinjectionofclonedretroviralgenomesintomousezygotes:integrationandexpressionintheanimal.nature,293:540-542.13.gordon,jw,etal.(1980).genetictransformationofmouseembryosbymicroinjectionofpurifieddna.procnatlacadsciusa,77:7380-7384.14.palmiter,rd,etal.(1982).dramaticgrowthofmicethatdevelopfromeggsmicroinjectedwithmetallothionein-growthhormonefusiongenes.nature,300:611-615.15.capecchi,mr.(2005).genetargetinginmice:functionalanalysisofthemammaliangenomeforthetwenty-firstcentury.natrevgenet,6:507-512.16.carroll,d.(2014).genomeengineeringwithtargetablenucleases.annurevbiochem,83:409-439.17.smithies,o,etal.(1985).insertionofdnasequencesintothehumanchromosomalbeta-globinlocusbyhomologousrecombination.nature,317:230-234.18.thomas,krandmrcapecchi.(1986).introductionofhomologousdnasequencesintomammaliancellsinducesmutationsinthecognategene.n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技术领域：
：的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。sequencelisting<110>上海交通大学<120>ctip抑制剂的新用途及一种精准的基因组dna片段编辑方法<130>171283<160>24<170>patentinversion3.3<210>1<211>24<212>dna<213>artificial<220><223>β-globinre1sgrna1f<400>1accgattgttgttgccttggagtg24<210>2<211>24<212>dna<213>artificial<220><223>β-globinre1sgrna1r<400>2aaaccactccaaggcaacaacaat24<210>3<211>24<212>dna<213>artificial<220><223>β-globinre1sgrna2f<400>3accgctggtcccctggtaacctgg24<210>4<211>24<212>dna<213>artificial<220><223>β-globinre1sgrna2r<400>4aaacccaggttaccaggggaccag24<210>5<211>23<212>dna<213>artificial<220><223>ctipsgrna1f<400>5accggagcagagcagcggggcaa23<210>6<211>23<212>dna<213>artificial<220><223>ctipsgrna1r<400>6aaacttgccccgctgctctgctc23<210>7<211>23<212>dna<213>artificial<220><223>ctipsgrna2f<400>7accgttgcccaaagattccccag23<210>8<211>23<212>dna<213>artificial<220><223>ctipsgrna2r<400>8aaacctggggaatctttgggcaa23<210>9<211>21<212>dna<213>artificial<220><223>β-globinre1sgrna1<400>9gattgttgttgccttggagtg21<210>10<211>21<212>dna<213>artificial<220><223>β-globinre1sgrna2<400>10gctggtcccctggtaacctgg21<210>11<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>hs51re1sgrna1<400>11gccacacatccaaggctgac20<210>12<211>21<212>dna<213>artificial<220><223>hs51re1sgrna2<400>12gagatttggggcgtcaggaag21<210>13<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>β-globinlocussgrna1<400>13ggagatggcagtgttgaagc20<210>14<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>β-globinlocussgrna2<400>14ctaggggtcagaagtagttc20<210>15<211>81<212>dna<213>artificial<220><223>hiseq-hstm-del-af1<400>15aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatcttg60cttagagccaggactaattgc81<210>16<211>85<212>dna<213>artificial<220><223>hiseq-hstm-del-2r<400>16caagcagaagacggcatacgagatagtcaagtgactggagttcagacgtgtgctcttccg60atctcagctctgcctgaaaggagtc85<210>17<211>77<212>dna<213>artificial<220><223>hiseq-hhs51-del-af<400>17atgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatctgca60aggagatccgtgtcgtc77<210>18<211>89<212>dna<213>artificial<220><223>hiseq-hhs51-del-br<400>18caagcagaagacggcatacgagatttgactgtgactggagttcagacgtgtgctcttccg60atcttttttggctaacaacatagtgcttc89<210>19<211>79<212>dna<213>artificial<220><223>hiseq-glob-del-af2<400>19aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatctgg60ttagcggcttgctcaattc79<210>20<211>85<212>dna<213>artificial<220><223>hiseq-glob-del-br1<400>20caagcagaagacggcatacgagatatcacggtgactggagttcagacgtgtgctcttccg60atcttcttcagccatcccaagactc85<210>21<211>22<212>dna<213>artificial<220><223>cr-ctip1-1f<400>21gtactacttctgggtctcccgc22<210>22<211>22<212>dna<213>artificial<220><223>cr-ctip1-1r<400>22cactacactgcaggtgctcacc22<210>23<211>23<212>dna<213>artificial<220><223>cr-ctip2-1f<400>23catgaatggagactgtgtgatgg23<210>24<211>23<212>dna<213>artificial<220><223>cr-ctip2-1r<400>24caaactttcacgtggacgtagag23当前第1页12当前第1页12