黄瓜－酸黄瓜异附加系材料的鉴定方法与流程

一、技术领域

本发明公开了黄瓜-酸黄瓜异附加系材料的鉴定方法，有利于开展黄瓜育种研究，属于植物生物技术领域。

二、技术背景

黄瓜(cucumissativusl.，2n＝2x＝14)属于葫芦科(cucurbitaceae)甜瓜属(cucumis)物种，是世界性的重要蔬菜作物。黄瓜遗传基础非常狭窄，种内缺乏重要抗性基因，现有的栽培品种对病害、高低温逆境等生物和非生物胁迫普遍较为敏感，因此通过种间杂交转移利用野生资源的抗性性状对于黄瓜改良尤其重要(dijkhuizenetal.，1994；staubetal.，2005)。

黄瓜近缘野生资源丰富，所属的甜瓜属包含50多种野生物种(sebastianetal.，2010)。但因物种的分化(黄瓜是该属唯一染色体基数为7的物种，其它物种染色体基数均为12)，黄瓜与野生近缘种间杂交成功的报道迄今仅有一例：chen等于2000年首次成功实现黄瓜与近缘野生种---酸黄瓜(c.hystrixl.，2n＝2x＝24)的种间杂交，并进一步染色体加倍获得种间异源四倍体c.hytivuschen&kirkbride(2n＝4x＝38)，为黄瓜的种间改良开创了新途径。酸黄瓜携带有多种抗病抗逆性状，如抗线虫、蔓枯病、霜霉病、耐弱光等(曹清河etal.，2005；陈劲枫etal.，2001)。前期基于该种间异源四倍体，通过连续回交，获得了多份包括异源三倍体和渐渗系等异染色体系材料(chenetal.，2003；孟佳丽等，2012)。

然而，充分有效地挖掘野生酸黄瓜基因组有用信息需要借助于更多特定的材料，异附加系由于将酸黄瓜染色体附加到黄瓜遗传背景的不同个体中，可为酸黄瓜有用基因的遗传解析及相关研究提供优良的材料。

传统的鉴定异附加系外源染色体的方法主要包括形态学、细胞学c分带、生化标记法(如同工酶)等(谭光轩，2008；董凤高等，1992)。荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization，fish)结合分子标记技术的发展为附加系外源染色体的鉴定提供了直观而有力的手段(anetal.，2015)。

目前，关于黄瓜-酸黄瓜异附加系材料附加酸黄瓜染色体的鉴定方法未见报道。因酸黄瓜染色体特异性探针的缺乏，我们利用黄瓜染色体着丝粒特异的重复序列typeiii作为探针与附加系材料的中期染色体进行杂交，根据杂交信号的有无，成功的鉴定出黄瓜-酸黄瓜异附加系材料中附加的酸黄瓜染色体及其数目。

三、

技术实现要素：

技术问题

本发明利用黄瓜染色体着丝粒特异重复序列typeiii的荧光原位杂交技术鉴定了黄瓜-酸黄瓜异附加系材料中附加的酸黄瓜染色体及其数目，是针对以往附加系材料鉴定方法的繁琐等不足以及缺乏的酸黄瓜染色体特异的识别标记，发明了一种仅通过黄瓜着丝粒特异重复序列typeiii的荧光原位杂交(fish)即可快速识别出附加的酸黄瓜染色体及其数目。

技术方案

本发明所提供的黄瓜-酸黄瓜异附加系材料的鉴定方法，其实施方案如下：

1)甜瓜属异源三倍体黄瓜比二倍体栽培黄瓜提早一个月种植，使二者花期相遇；

2)以甜瓜属异源三倍体黄瓜为母本，二倍体栽培黄瓜为父本杂交，3朵雄花授一朵雌花；

3)杂交授粉35-40天后，采收发育成熟果实中的种子；

4)将杂交获得的种子催芽播种，待苗子长大后，取好的根尖于0.002m的8-羟基喹啉溶液中25℃预处理3h，以富集中期分裂细胞，再放入体积比为3∶1的e∶g(乙醇∶冰醋酸)固定液中固定至少24小时，备用；

5)采用缺刻平移法将黄瓜染色体着丝粒特异的重复序列typeiii用digoxigenin-11-dutp(购自roche公司)标上探针，具体操作根据探针标记试剂盒说明，备用；

6)采用4％纤维素酶和2％果胶酶混合液，酶解黄瓜-酸黄瓜异附加系材料根尖，利用火焰干燥法制作黄瓜染色体制片，镜检，挑选染色体分散度高的制片，备用；

7)将20μl杂交混合液(含有50ng标记好的typeiii探针、50％去离子甲酰胺，2×ssc，10％硫酸葡聚糖)杂交到黄瓜-酸黄瓜异附加系材料中期染色体上，反应12h后，2×ssc洗片，加上带有荧光基团的抗digoxigenin抗体进行反应1h，高严谨条件洗脱后，dapi进行染色体的复染，利用荧光显微镜检测信号，依据染色体荧光信号的有无，鉴定附加的酸黄瓜染色体及附加染色体的数目。

有益效果

本发明与现有技术相比，具有如下优点和积极效果：

1)利用黄瓜染色体着丝粒特异重复序列typeiii的荧光原位杂交技术鉴定了黄瓜-酸黄瓜异附加系材料中附加的酸黄瓜染色体及其数目，与现有技术相比，具有直观性，充分提高了试验效率。

2)现有的鉴定附加系材料的方法，主要利用细胞学c分带、生化标记法(如同工酶)等，在特定的一些物种中如小麦、棉花等作物的附加系鉴定中较多的应用基因组荧光原位杂交技术(gish)。在黄瓜-酸黄瓜异附加系材料的鉴定中，细胞学c分带、生化标记法(如同工酶)等方法操作繁琐。与之相比利用黄瓜染色体着丝粒特异重复序列typeiii作为探针来鉴定附加系材料，直观、明确、简单。

3)在材料准备方面，制作分散度高的片子，这样可以使杂交上去的探针信号更加清晰，更容易识别染色体数目，加快了实验进程。

4)作为探针的黄瓜染色体着丝粒特异重复序列typeiii，在染色体上拷贝数多，信号容易凸显，使得目标探针信号在染色体上清晰可辨。

四、附图说明

图1：黄瓜着丝粒特异的探针typeiii鉴定的附加1条酸黄瓜染色体的黄瓜-酸黄瓜异附加系材料，红色标记的着丝粒特异的探针typeiii信号清晰。

图2：黄瓜着丝粒特异的探针typeiii鉴定的附加2条酸黄瓜染色体的黄瓜-酸黄瓜异附加系材料，红色标记的着丝粒特异的探针typeiii信号清晰。

图3：黄瓜着丝粒特异的探针typeiii鉴定的附加3条酸黄瓜染色体的黄瓜-酸黄瓜异附加系材料，红色标记的着丝粒特异的探针typeiii信号清晰。

图4：黄瓜着丝粒特异的探针typeiii鉴定的附加5条酸黄瓜染色体的黄瓜-酸黄瓜异附加系材料，红色标记的着丝粒特异的探针typeiii信号清晰。

五、具体实施方式

本发明黄瓜-酸黄瓜异附加系材料的鉴定方法的实施程序包括：

1)附加系材料的创制：甜瓜属异源三倍体黄瓜比二倍体栽培黄瓜提早一个月种植，使二者花期相遇；以甜瓜属异源三倍体黄瓜为母本，二倍体栽培黄瓜为父本杂交，3朵雄花授一朵雌花；杂交授粉35-40天后，采收发育成熟果实中的种子；

2)材料的准备：将杂交获得的种子催芽播种，待苗子长大后，取好的根尖于0.002m的8-羟基喹啉溶液中25℃预处理3h，以富集中期分裂细胞，再放入体积比为3∶1的e∶g(乙醇∶冰醋酸)固定液中固定至少24小时，备用；

3)探针的制备：黄瓜染色体着丝粒特异重复序列typeiii探针的标记采用缺刻平移法。根据探针标记试剂盒说明，用digoxigenin-11-dutp(购自roche公司)将重复序列typeiii标上探针，备用。

4)酶解根尖：利用4％纤维素酶和2％果胶酶混合溶液，于37℃酶解根尖约1h，后将酶解好的根尖固定于上述固定液中备用。

5)制片：取出酶解好的其中一个根尖，放在干净的载玻片上用镊子敲碎，再加上100μl的固定液，在酒精灯上烧片干燥制片。

6)探针的杂交：杂交液总体系为20μl，将探针杂交液(含有50ng标记好的基因组dna探针、50％去离子甲酰胺，2×ssc，10％硫酸葡聚糖)于90℃变性6min，冰浴10min；载玻片于80℃的70％去离子甲酰胺中变性1min30s，以70％、90％、100％系列冰乙醇脱水各5min，晾干，将变性的探针杂交液滴于变性后的玻片上，封片，置杂交盒37℃杂交过夜。

7)信号的放大：将杂交后的片子放入2×ssc溶液中浸泡至封片脱落，放入2×ssc中，摇床震荡洗涤10min，转入42℃的2×ssc中洗涤15min，再放入2×ssc中洗涤10min，1×tnt洗涤10min，取出后直接滴加罗丹明偶联的抗地高辛抗体(购自roche公司)，于37℃温育40min-1h，使信号放大。

8)信号的检测：在室温风干的制片上加入含有抗荧光淬灭剂的dapi，盖玻片封片后，染色体制片在避光的条件下，用olympusbx51荧光显微镜观察杂交信号。

9)附加染色体的鉴定：用photometricssensysccd(chargecoupleddevice)1400e照相装置和metamorph4.6.3(universalimagingcrop)软件获取图像，依据信号的有无，和染色体数目鉴定附加系材料。