本发明属于动物细胞系领域，具体涉及建立流感病毒感染细胞模型的方法
背景技术
实验动物树鼩，分类上属哺乳纲，有胎盘类，灵长目，树鼩科；分布在热带和亚热带，如我国云南、广西等。树鼩已被应用于多种病毒学研究，包括eb病毒、疱疹病毒、甲型肝炎病毒，乙型肝炎病毒，单纯疱疹病毒，登革病毒，hiv病毒，轮状病毒腺病毒、肝炎病毒以及呼吸道合胞病毒。此外，它作为一种体小、繁殖快、较价廉的灵长类动物，具有经济易行性的优势。2013年其全基因组首次由中国科学家发布，更显示了树鼩作为感染疾病动物模型巨大潜力。目前也有使用树鼩能作为流感病毒大动物实验模型的报道。
然而，动物实验模型存在动物个体间差异；每次的研究都需要一批的动物，造价往往较大；体内模型对于机理的研究并没有细胞模型那么方便。因此，很有必要利用树鼩的原代细胞建立一种流感病毒感染细胞模型的方法，从而更方便准确的研究流感病毒的致病机制和分析评价药物对流感病毒抑制。而目前为止，尚未有关于利用树鼩原代细胞建立流感病毒感染细胞模型的方法的报道。
技术实现要素：
为了克服现有技术缺失，本发明提供了一种利用树鼩原代细胞建立流感病毒感染细胞模型的方法，以便更准确、快速、经济的研究流感病毒的致病机制和分析评价药物对流感病毒抑制。
为了解决上述问题，本发明按以下技术方案予以实现的：
一种利用树鼩原代细胞建立流感病毒感染细胞模型的方法，包括以下步骤：
(1)树鼩原代细胞的培养：树鼩原代细胞在经过酶消化处理后，离心；将细胞放入动物细胞培养基中，进行细胞培养；
(2)感染树鼩原代细胞：步骤(1)获得的树鼩原代细胞用pbs进行洗涤，去除所述动物细胞培养基；加入含有流感病毒a/pr/8/34(h1n1)的无血清培养基，进行病毒培养3-4天。
优选的，所述树鼩原代细胞，包括树鼩气管原代细胞、树鼩肺原代细胞和树鼩肾髓质原代细胞中的至少一种。
优选的，所述酶消化处理包括以下步骤：将灌有酶解消化液的树鼩气管取出，浸泡于含400u/ml青链霉素的pbs，在温度为37℃条件下，消化22-26小时；和/或，将树鼩肺器官剪碎，加入酶解消化液，在温度为37℃条件下，消化44-52小时；和/或，除去树鼩肾器官的肾皮质层，留肾髓质层，并剪碎肾髓质层，加入酶解消化液，在温度为37℃条件下，消化44-52小时。
优选的，所述酶解消化液为含300-500u/ml青链霉素、质量浓度为0.1％的胶原酶消化液。
特别优选的，所述酶解消化液为含400u/ml青链霉素、质量浓度为0.1％的胶原酶消化液。动物离体细胞培养难以避免细菌污染，使用常规有效抑菌浓度的4倍，能更有效抑制和杀灭细菌，确保细胞培养成功。选用胶原酶消化液，是因为其能让小块组织块中的细胞分离，同时对细胞伤害没有胰蛋白酶消化液大。
优选的，所述步骤(1)中细胞培养和步骤(2)的病毒培养的条件为：温度为37℃，co2体积浓度为5％。
优选的，所述步骤(1)中细胞培养的培养时间为4-5天。
优选的，所述步骤(1)中离心的条件为在转速为2500-3500rpm条件下，离心8-12分钟，去除所述消化液。
特别优选的，所述步骤(1)中离心的条件为在转速为3000rpm条件下，离心10分钟，所述消化液。
优选的，所述动物细胞培养基为含体积百分含量为20％胎牛血清的f12培养基。
优选的，所述流感病毒a/pr/8/34(h1n1)的病毒滴度为100tcid50/0.1ml。
优选的，所述无血清培养基，还含有细胞因子和tpck胰蛋白酶。tpck胰蛋白酶是用于流感病毒血凝素蛋白结构修饰的胰蛋白酶，让血凝素蛋白形成包含受体蛋白和融合蛋白结构。
优选的，所述tpck胰蛋白酶的含量为0.4-0.6μg/ml。
特别优选的，所述tpck胰蛋白酶的含量为0.5μg/ml。
本发明的有益效果：
树鼩气管原代细胞、树鼩肺原代细胞和树鼩肾髓质原代细胞均具有扩增流感病毒的作用，树鼩气管原代细胞对流感病毒a/pr/8/34(h1n1)的敏感性最强。利用树鼩原代细胞建立流感病毒感染细胞模型，不存在个体差异较大的困扰，也省去了建立动物模型对每一只动物都需要监测和评估的步骤与时间。因此，本发明对于对流感病毒的病毒学研究和探讨、评价药物对流感病毒抑制提供了一个经济省时、表现均一的感染细胞模型。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但所举实施例不作对本发明的限定。
以下实施例中所用的各种试剂均为市售商品，均为可通过商业途径购买获得。流感病毒a/pr/8/34(h1n1)购买于atcc公司，美国；树鼩购买于昆明医科大学动物实验中心。
实施例1：利用树鼩原代细胞建立流感病毒感染细胞模型
(1)树鼩原代细胞的培养：
a.树鼩气管原代细胞的培养：
将树鼩的气管暴露，用手术绳绑紧肺部与气管位置端，在口腔端的气管处注入含400u/ml青链霉素的质量浓度为0.1％的胶原酶消化液。注入后绑紧口腔端的气管，使气管内部充满胶原酶消化液，捆绑处以外的两端剪掉，取出气管。将其放入含400u/ml青链霉素pbs的培养皿中，在温度为37℃条件下，消化24小时。经过酶消化后，把密封气管一端剪开，流出胶原酶消化液与树鼩气管原代细胞，将其在转速为3000rpm条件下，离心8-12分钟，除去胶原酶消化液；加入含体积百分含量为20％胎牛血清的f12培养基混悬后，移至24孔培养板，在温度为37℃，co2体积浓度为5％的条件下，做贴壁培养，培养4天。
b.树鼩肺原代细胞的培养：
将树鼩肺器官剪碎，将其放入含400u/ml青链霉素的质量浓度为0.1％的胶原酶消化液的培养皿中，在温度为37℃条件下，消化48小时。经过酶消化后，在转速为3000rpm条件下，离心8-12分钟，除去胶原酶消化液；加入含体积百分含量为20％胎牛血清的f12培养基混悬后，移至24孔培养板，在温度为37℃，co2体积浓度为5％的条件下，做贴壁培养，培养4天。
c.树鼩肾髓质原代细胞的培养：
将树鼩的肾器官除去肾皮质层，留肾髓质层，并剪碎肾髓质层；将剪碎肾髓质层放入含400u/ml青链霉素的质量浓度为0.1％的胶原酶消化液的培养皿中，在温度为37℃条件下，消化48小时。经过酶消化后，在转速为3000rpm条件下，离心8-12分钟，除去胶原酶消化液；加入含体积百分含量为20％胎牛血清的f12培养基混悬后，移至24孔培养板，在温度为37℃，co2体积浓度为5％的条件下，做贴壁培养，培养4天。
(2)感染树鼩原代细胞：
用pbs分别洗涤一遍培养在24孔培养板中的树鼩气管原代细胞、树鼩肺原代细胞和树鼩肾髓质原代细胞，将含体积百分含量为20％胎牛血清的f12培养基去除；每孔加入0.5ml的含多种细胞因子、0.5μg/ml的tpck胰蛋白酶和病毒滴度为100tcid50/0.1ml的流感病毒a/pr/8/34(h1n1)的无血清培养基(sfm)，进行病毒培养72小时。
实施例2：细胞病毒敏感度实验
在树鼩气管原代细胞、树鼩肺原代细胞和树鼩肾髓质原代细胞进行病毒培养时，分别在24小时、48小时、72小时，三个不同时间点取出三种树鼩原代细胞的上清液，测试其病毒滴度，来判断细胞对流感病毒a/pr/8/34(h1n1)的病毒敏感性。实验结果见表1。
表1不同时间点树鼩原代细胞的上清液病毒滴度
由表1可知，在72小时后，三种树鼩原代细胞扩增的病毒均大于2lgtcid50/0.1ml(即100tcid50/0.1ml)，说明三种树鼩原代细胞对流感病毒a/pr/8/34(h1n1)均具有敏感性，且具有扩增流感病毒的作用。利用树鼩原代细胞建立流感病毒感染细胞模型可以用于研究药物对流感病毒抑制。同时，也为树鼩能作为流感病毒大动物实验模型提供依据。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。