分泌口蹄疫病毒共享型单克隆抗体10B10的杂交瘤细胞系及其应用的制作方法

本发明涉及分泌口蹄疫病毒共享型单克隆抗体10b10的杂交瘤细胞系，还涉及所述杂交瘤细胞系及其分泌的口蹄疫病毒共享型单克隆抗体10b10在口蹄疫诊断或防治中的应用，属于口蹄疫的防治领域。

背景技术：

口蹄疫病毒(footandmouthdiseasevirus,fmdv)属于小rna病毒科口蹄疫病毒属的成员，其基因组为单股正链rna，基因组rna全长约8.5kb。口蹄疫(foot-and-mouthdisease,fmd)是由口蹄疫病毒(fmdv)引起的，严重危害牛、猪、羊等多种偶蹄动物的高度接触性传染病，能够引起幼畜死亡、产奶量下降、肉食减少、肉品下降、动物的生产性能降低等，而且该病具有极强的传染性，可形成大范围流行，造成巨大的经济损失。预防和控制口蹄疫的关键是高效疫苗和准确的诊断方法的应用。

口蹄疫病毒有七个血清型，分别为o、a、c、sat1、sat2、sat3和asial，各血清型之间无交叉免疫保护。目前，中国主要流行o型、a型和asial型fmd。口蹄疫病毒的抗原结构十分复杂，不同血清型、基因型和分离株的抗原位点和抗原表位都不尽相同，存在广泛的抗原变异。因此，开发新的口蹄疫病毒共享型单克隆抗体，将对于口蹄疫的有效防控具有重要意义。

技术实现要素：

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一株分泌口蹄疫病毒共享型单克隆抗体10b10的杂交瘤细胞系以及其分泌的口蹄疫病毒共享型单克隆抗体10b10；

本发明所要解决的第二个技术问题是将上述分泌口蹄疫病毒共享型单克隆抗体10b10的杂交瘤细胞系及其分泌的单克隆抗体10b10应用于口蹄疫的诊断或防治。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先公开了一株分泌口蹄疫病毒共享型单克隆抗体10b10的杂交瘤细胞系。

本发明用灭活并纯化的a型口蹄疫毒株a/jlys/cha/2014免疫balb/c鼠，将免疫小鼠脾细胞与sp2/0细胞融合获得杂交瘤细胞。抗体阳性杂交瘤细胞经3次有限稀释法亚克隆，获得三株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞，分别命名为10b10、3c7和4g2。间接免疫荧光检测结果显示，单抗10b10与a、o、asia1型毒株均呈阳性反应，表明10b10为fmdv血清型共享性单抗；而单抗3c7和4g2仅与o型毒株均呈阳性反应，为o型毒株特异性单抗。

本发明将分泌口蹄疫病毒共享型单克隆抗体10b10的杂交瘤细胞系10b10提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：cgmccno.13841；分类命名为：分泌fmdv共享型单克隆抗体的杂交瘤细胞株。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2017年4月24日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明进一步公开了由杂交瘤细胞系10b10分泌的口蹄疫病毒共享型单克隆抗体10b10。免疫球蛋白亚类鉴定显示，单抗10b10重链类型为igg2a，轻链为κ类型；杂交瘤细胞上清和腹水的elisa抗体效价分别为1:1024和1:10⁵。微量细胞中和试验表明，单抗10b10无中和活性。相对亲和力测定结果表明，单克隆抗体10b10具有高强度的亲和力，其相对亲和力指数为5.5mol/l。单克隆抗体10b10识别的fmdvvp2蛋白的抗原表位是⁸tlledrilt¹⁶。

本实验室之前筛选获得了一株血清型共享性fmdv单抗4b2，其重链类型为igg1，轻链为κ类型；所针对的抗原表位是²kkteettlledr¹³。单抗4b2的相对亲和力指数为2.5mol/l，显示单抗4b2具有中等强度的亲和力。亲和力的强弱，是一株单抗在某种检测方法中应用效果的重要指标。本发明筛选出的各血清型共享型fmdv单抗10b10，其亲和力指数明显高于单抗4b2。因此，与单抗4b2相比，高亲和力单抗10b10在建立病毒抗原诊断及其抗体检测方法中具有更大的应用价值和潜力。

本发明在泛口蹄疫病毒抗原检测方法中，应用单抗10b10为检测单抗时的使用浓度为0.87μg/ml，而应用单抗4b2为检测单抗时的使用浓度为1.54μg/ml。可见，使用单抗10b10不但可以节约一半的成本，而且预示着也能在一定程度上提高方法的敏感性。本发明检测fmdv的敏感性试验也证实，单抗10b10检测a型和o型fmdv的敏感性比单抗4b2要高3倍左右。上述分析结果表明，本发明所述的单抗10b10是完全不同于4b2的一株新的口蹄疫病毒共享型单克隆抗体，而且比单抗4b2具有更高的应用价值。

本发明所述的分泌口蹄疫病毒共享型单克隆抗体10b10的杂交瘤细胞系或其分泌的口蹄疫病毒共享型单克隆抗体10b10能够应用于制备诊断、预防或治疗口蹄疫的试剂或药物。其中，所述口蹄疫包括由o型、a型或asia1型口蹄疫病毒引起的口蹄疫中的任意一种或多种。

本发明还公开了所述分泌口蹄疫病毒共享型单克隆抗体10b10的杂交瘤细胞系或其分泌的口蹄疫病毒共享型单克隆抗体10b10在制备口蹄疫病毒抗原或抗体检测的试剂中的应用。其中，所述口蹄疫病毒包括：o型、a型或asia1型口蹄疫病毒中的任意一种或多种。

本发明将牛多抗作为捕获抗体、纯化的单抗10b10标记hrp后作为检测抗体，分析了10b10作为检测抗体在口蹄疫病毒抗原检测中的应用效果。结果表明，单抗10b10可用于fmdv抗原的特异性检测，对a型fmdv细胞毒的最低检出量为1.05×10⁴tcid50，对o型fmdv细胞毒的最低检出量为5.9×10³tcid50。为检验单抗10b10在口蹄疫病毒抗体检测中的应用效果，本发明同时使用两株fmdv血清型共享的单抗3d9和10b10，以3d9作为包被抗体、hrp标记的10b10作为检测抗体建立固相竞争elisa方法，分别检测系列稀释的a、o和asia1型fmdv的阴性和阳性血清，计算反应的抑制百分率。结果表明，用单抗10b10建立的固相竞争elisa方法能够特异性区分三种血清型fmdv的阴性和阳性血清。以上结果证明，本发明所述的口蹄疫病毒共享型单克隆抗体10b10及分泌10b10单克隆抗体的杂交瘤细胞系，能够应用于fmdv病原诊断及抗体检测。

本发明进一步公开了一种用于口蹄疫病毒抗原检测的抗原捕获elisa试剂盒，包括：包被捕获抗体的固相载体、检测抗体、口蹄疫病毒阴性对照抗原、口蹄疫病毒阳性对照抗原、封闭液、洗涤液、底物溶液和终止液。其中，所述检测抗体为辣根过氧化物酶(hrp)标记的口蹄疫病毒共享型单克隆抗体10b10，其最佳使用浓度为0.87μg/ml；所述捕获抗体为牛抗fmdv多抗，其最佳包被浓度为2.9μg/ml。所述洗涤液为0.05％tween-20pbs(pbst)溶液；所述封闭液为5％脱脂乳pbst溶液；所述底物溶液为tmb底物溶液；所述终止液为2mh2so4。所述口蹄疫病毒包括：o型、a型或asia1型口蹄疫病毒。

本发明还公开了一种用于口蹄疫病毒抗体检测的固相竞争elisa试剂盒，包括：包被包被抗体的固相载体、检测抗体、口蹄疫病毒抗原、洗涤液、底物溶液和终止液。其中，所述检测抗体为辣根过氧化物酶(hrp)标记的口蹄疫病毒共享型单克隆抗体10b10，所述包被抗体为fmdv血清型共享的单抗3d9。所述洗涤液为ph7.4的pbst溶液；所述底物溶液为tmb底物溶液；所述终止液为2mh2so4。所述口蹄疫病毒包括：o型、a型或asia1型口蹄疫病毒。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明筛选获得一株fmdv共享型单克隆抗体10b10。间接免疫荧光检测结果表明，单抗10b10与o型、a型和asia1型口蹄疫病毒均呈特异性反应。单抗10b10具有高强度的亲和力，其相对亲和力指数为5.5mol/l，明显高于另一株血清型共享型fmdv单抗4b2。本发明所述高亲和力的口蹄疫病毒共享型单克隆抗体10b10及分泌单克隆抗体10b10的杂交瘤细胞系，在泛口蹄疫病毒抗原及其抗体的检测中具有重要的应用价值。

附图说明

图1为ifa检测单抗10b10与a型、o型、asia1型fmdv毒株的反应；其中，positivecontrol为阳性对照，cellcontrol为bhk细胞对照；

图2为单抗4b2和10b10的相对亲和力测定；

图3为用固相竞争elisa检测a、o和asia1型fmdv的强阳性、弱阳性和阴性血清的抑制百分率变化曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1fmdv各血清型毒株共享单克隆抗体的筛选和鉴定

1、材料和方法

1.1病毒、细胞、菌株和实验动物

用于ifa进行单抗特异性分析的毒株包括：afmdva/kt/58(genbankaccessionnumber:aj131665)，a/jlys/cha/2014(aj131665)，a/xjbc/cha/2010，asia1fmdvasia1/ys/cha/05(gu931682)，o/ys/cha/05(hm008917)，ofmdvo/tibet/cha/99(aj539138)，o/gd/86(aj131468)(wangh,zhaol,liw,zhoug,yul(2011)identificationofaconformationalepitopeonthevp1g-hloopoftypeasia1foot-and-mouthdiseasevirusdefinedbyaprotectivemonoclonalantibody.veterinarymicrobiology148:189-199.)；乳仓鼠肾细胞bhk-21、sp2/0骨髓瘤细胞为本发明人实验室保存；清洁级雌性balb/c小鼠购于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。mab3d9和mab4b2由本发明人实验室保存。a型、o和asia1型fmdv的高免牛血清及其离子交换层析纯化抗体，由本发明人实验室保存。

1.2主要试剂

融合剂peg/dmso(mw,1450)、hat盐(50x)、ht盐(50x)、hrp或fitc标记的羊抗鼠igg、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自sigma公司；单克隆抗体亚类鉴定试剂盒购自southernbiotech公司；l-谷氨酰胺(glutamine)、甘氨酸购自amresco公司；二甲基亚砜(dmso)、邻苯二胺(opd)、peg6000购自solarbio公司；高糖dmem干粉购自gibco公司；进口优级胎牛血清(paa)购自西班牙nalgene公司；96孔细胞培养板购自加拿大jetbiochemical公司。

1.3鼠免疫与单克隆抗体的制备

(1)将a型fmdv(a/jlys/cha/2014)接种于bhk-21细胞单层，待75％以上细胞出现病变后收毒。将收获的细胞培养液反复冻融三次，裂解细胞释放病毒。冻融后的病毒液加入1∶1000tritonx-100和4∶10000甲醛裂解与灭活48h以上，取灭活过的病毒液1ml接种bhk-21细胞盲传三代、检测灭活是否彻底。将经冻融裂解后的培养液9000rpm(beckman高速离心机，ja-10转子)、4℃离心90min，回收病毒液上清，弃去细胞沉淀；按病毒液上清的体积加入80g/l的peg6000和40g/l的nacl，室温搅拌2h至完全溶解，4℃过夜沉淀；次日将上清9000rpm、4℃离心90min，弃上清回收沉淀；用net缓冲液于低温下将沉淀轻轻重悬，29000rpm、4℃离心2h，在冰盒中用适量的net缓冲液轻轻重悬沉淀；制备15％～45％均匀线性蔗糖梯度，对病毒浓缩液进行蔗糖密度梯度超速离心，利用用紫外分光光度计检测od259值，根据公式计算146s抗原的含量。

(2)纯化的a型fmdv抗原(100μg/200ul)加等体积弗氏完全佐剂进行充分的乳化，背部皮下注射6周龄雌性balb/c小鼠；2周后进行第2次免疫，佐剂改为弗氏不完全佐剂；2周后，以不加佐剂的等量抗原进行第3次免疫。为刺激小鼠快速产生强烈的免疫反应，于融合前3d采用尾静脉和脾脏注射相结合的免疫方式进行加强免疫，使用二倍剂量的抗原。

(3)细胞融合

a)饲养层细胞的制备：细胞融合前一天进行饲养层细胞的制备，眼科剪刀、眼科镊子、平皿等试验用具用前高温干热灭菌，hat完全培养液做无菌检验。取2只balb/c小鼠摘除眼球放血，按常规方法分离阴性血清。拉颈脱臼处死小鼠，将其浸泡于75％酒精中，10min后移入超净工作台。将小鼠腹部向上固定在鼠架上，用镊子提起腹正中部皮肤，眼科剪刀横向剪一小口，切勿剪破腹膜，用剪刀和镊子上下撕开皮肤，充分暴露腹膜。用镊子轻轻提起腹膜，将10ml注射器内吸取的8-10mlhat完全培养液注入腹腔，切勿刺破脏器和肠道，注射器不要拔出，在腹腔内来回抽吸5-10次，然后用镊子按摩两侧腹部30秒左右，再进行抽吸，重复以上操作2-3次。用注射器回吸腹腔内液体。注意避开肠系膜及脂肪组织，以免堵塞针头。将从2只鼠中取出的腹腔细胞加入55mlhat培养液中，吹散混匀细胞，以100μl/孔分装于6块96孔培养板，置于37℃、5％co2培养箱中培养。

b)骨髓瘤细胞的制备：融合前36-48h，将骨髓瘤细胞扩大培养，使细胞处于对数生长期。融合当天，用15mldmem基础培养液将细胞从瓶壁上吹下，收集于50ml离心管,1000rpm离心10min。将细胞沉淀重悬置20mldmem基础培养液中，混匀。取少量骨髓瘤细胞悬液，台盼兰染色计数，备用。

c)免疫脾细胞的制备：融合前摘除小鼠眼球采血，制备阳性血清。将小鼠拉颈脱臼致死，浸泡于75％酒精中，10min后放于超净台。无菌打开腹腔，分离结缔组织并取出脾脏，将脾脏放入装有灭菌尼龙网和盛有15mldmem基础培养液的平皿中，用灭菌玻璃注射器内芯研磨脾脏，使脾细胞全部通过网孔进入平皿中。将脾细胞溶液转入50ml离心管中，加dmem基础培养液大约至30ml，混匀，1000rpm离心8min，弃上清。将细胞沉淀悬于10mldmem基础培养液中，混匀。取细胞悬液，台盼兰染色计数，备用。

d)脾细胞与骨髓瘤细胞融合：取65mlhat培养液，15ml基础dmem培养液和1ml50％peg于37℃水浴中预热，另备200ml烧杯盛有37℃的水。按5份脾细胞数加1份骨髓瘤细胞数取相应细胞悬液量，加入50ml玻璃离心管中，补加dmem基础培养液至30ml，混匀。1000rpm离心10min，弃上清，尽可能倒干。用手掌轻击离心管底部，使沉淀细胞松散均匀呈糊状。将离心管放入盛有37℃水的200ml烧杯中，一手均匀转动离心管，另一手用1ml巴氏吸管吸取37℃50％peg溶液1ml，1min内加完，静置2min。随后先慢后快地加入dmem基础培养液终止反应，37℃水浴静置10min。1000rpm离心10min，弃上清，加入65mlhat培养基，轻轻地吹散细胞，每孔0.1ml接种于已培养有饲养细胞的6块96孔培养板，置37℃、5％的co2培养箱中培养。5d后半量换液，8d后全换液，待克隆长至孔底面积1/4-1/3时取上清进行检测并换ht培养液。

1.4抗体检测elisa

用提纯的病毒抗原包被96孔板，加入100ul杂交瘤细胞培养上清，37℃温育1h后洗涤，加入1:5000稀释的hrp标记的羊抗鼠二抗，洗涤后加入底物tmb避光显色10min，于波长450nm测定吸光值。

1.5间接免疫荧光

96孔板微孔板培养bhk-21细胞至单层，接种口蹄疫病毒4×10³tcid50/孔，出现cpe之前用冷无水乙醇进行固定，加入50ul杂交瘤细胞培养上清，37℃温育40min后pbs洗涤三次，加入1:200稀释的fitc标记羊抗鼠igg抗体，37℃温育40min，洗涤后在倒置荧光显微镜下观察荧光强度。

1.6单克隆抗体的纯化

采用辛酸-饱和硫酸铵法对制备的腹水进行纯化，操作步骤简述如下：

(1)取3ml预处理过的腹水加6ml醋酸缓冲液(0.06mol，ph4.8)；腹水中加99ul辛酸室温搅拌30分钟，4℃静置2小时以上；取出11000rpm离心30分钟，弃沉淀；上清用2mol/lnaoh调ph至7.4；

(2)在4℃条件下加入饱和硫酸铵至50％饱和度，冰浴搅拌作用30分钟，4℃静置2小时以上；11000rpm离心30分钟，弃上清；沉淀溶于5mlpbs(0.1m，ph7.4)中；

(3)向沉淀悬浮物中边搅拌边加适量饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵溶液中浓度为30％-40％，冰浴搅拌作用30分钟，4℃静止2小时以上；11000rpm离心30分钟，取沉淀，将沉淀融入2mlpbs中；

(4)将沉淀悬浮液装入透析带中，在4℃用pbs透析，2小时换液一次，透析2天。透析完成后，回收透析袋中的纯化腹水，紫外分光光度计测定蛋白浓度，用sds-page进行纯度检测。

再用deae-sephadexa-50(ge公司)柱层析进一步纯化单克隆抗体，回收纯化后的单克隆抗体，紫外分光光度计测定蛋白浓度，用sds-page进行纯度检测。

1.7单克隆抗体相对亲和力测定

采用硫氰酸盐洗脱法对单克隆抗体的相对亲和力进行测定，操作步骤如下：

(1)用已经确定的最佳抗原浓度包被elisa板，每孔100μl，4℃过夜包被。

(2)pbst洗涤、脱脂乳封闭同间接elisa。洗涤后加入饱和浓度的待测单抗，每孔100μl，37℃孵育1h。

(3)洗涤后进行硫氰酸盐洗脱处理，每孔加入nascn溶液60μl，浓度依次为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5mol/l，室温静置15min，pbst洗涤4次。

(4)洗涤后加入1:5000稀释的hrp标记羊抗鼠二抗，tmb显色后用酶标仪测定od450值。

(5)结果判定：经硫氰酸盐洗脱后每种抗体与抗原结合的od450值下降至未经洗脱时od450值的50％所对应的nascn浓度，即为该抗体的相对亲和力指数，以mol/l表示。

1.8抗原捕获elisa方法的建立

1)用ph9.6的碳酸盐缓冲液包被牛多抗，4℃过夜。用0.05％tween-20pbs(pbst)洗板3次，每次3min；2)用5％脱脂乳pbst封闭酶标板，37℃1h，同上洗板；3)加待检抗原和阴阳性对照抗原，37℃1h，洗涤方法同上；4)加入hrp标记的检测单抗，37℃1h，洗涤方法同上；5)加入底物，室温避光作用10min；6)加2mh2so4(50μl/孔)终止反应，酶标仪450nm处测量吸光度a值(od450nm)。

1.9固相竞争elisa实验步骤

1)用ph9.6的碳酸盐缓冲液按使用浓度稀释包被单抗3d9于elisa板，50μl/孔，4℃过夜。次日取出elisa板，弃去液体，用ph7.4pbst洗板5次，甩干；2)用pbst稀释口蹄疫病毒抗原至使用浓度，50μl/孔，37℃温育1h，同上洗板5次；3)阴性血清，阳性血清自1:8～1:512倍比稀释，50μl/孔，加入elisa板中；4)在elisa板中立即加入用检测抗体稀释液稀释的hrp-10b10，50μl/孔，充分摇振混匀，37℃温育1h。此时，elisa板中的反应体系为100μl；5)同上洗板5次，加入底物溶液tmb，50μl/孔，室温避光15min。15min后，加入2mh2so4终止液，50μl/孔，终止反应，在酶标仪上读取od450nm值。结果判定：通过检测已知阴性和阳性血清，计算抑制百分率(percentageinhibition,pi)。

2、实验结果

2.1一株fmdv各血清型毒株共享单克隆抗体的筛选和鉴定

免疫小鼠脾细胞与sp2/0细胞融合的杂交瘤细胞，用间接elisa和ifa方法验证其培养上清中的fmdv特异性抗体，阳性判定标准为：以杂交瘤细胞培养上清对fmdv抗原的od450光吸收值与正常balb/c小鼠血清、sp2/0细胞培养上清对fmdv抗原od450值之比均大于2.1，且杂交瘤细胞上清与正常bhk-21细胞不产生荧光反应，判为阳性。抗体阳性杂交瘤细胞经3次有限稀释法亚克隆，获得三株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞，分别命名为10b10、3c7和4g2。免疫球蛋白亚类鉴定显示，单抗10b10重链类型为igg2a，轻链为κ类型。单抗3c7重链类型为igg2a，轻链为κ类型。单抗4g2重链类型为igg2b，轻链为κ类型。微量细胞中和试验表明，10b10、3c7和4g2均无中和活性。

将单抗10b10培养上清分别与感染a、o和asia1型fmdv的bhk-21细胞进行间接免疫荧光检测(图1)，结果显示，10b10与a、o、asia1型毒株均呈阳性反应，表明10b10为fmdv血清型共享性单抗。而单抗3c7和4g2仅与o型毒株均呈阳性反应，为o型毒株特异性单抗。

本发明将能稳定分泌fmdv血清型共享性单抗10b10的杂交瘤细胞系10b10提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，其微生物保藏编号为：cgmccno.13841。

2.2单克隆抗体腹水的纯化及标记

鉴于单抗10b10的血清型共享性，本发明进一步研究单抗10b10在口蹄疫病毒抗原和抗体检测中的诊断价值。将本发明制备的单抗10b10腹水，经辛酸-饱和硫酸铵方法纯化，紫外分光光度计测定10b10的浓度为6.51mg/ml。抗体10b10再经deae-sephadexa-50离子交换层析进一步纯化，用改良过碘酸钠法标记hrp。

2.3单抗10b10与单抗4b2的亲和力比较

采用硫氰酸盐(nascn)洗脱法对单克隆抗体的相对亲和力进行测定，结果如图2所示。分别用0mol/l、0.5mol/l、1.0mol/l、1.5mol/l、2.0mol/l、2.5mol/l、3.0mol/l、3.5mol/l、4.0mol/l等不同浓度的nascn对2株单抗进行洗脱，经测定，单抗4b2和10b10的相对亲和力指数分别为2.5mol/l和5.5mol/l，显示单抗4b2具有中等强度的亲和力、而单抗10b10具有高强度的亲和力。亲和力的强弱，是一株单抗在某种检测方法中应用效果的重要指标。本发明筛选出的各血清型共享型fmdv单抗10b10，其亲和力指数(5.5mol/l)明显高于本实验室之前筛选的一株血清型共享型fmdv单抗4b2(2.5mol/l)，因此可以预见，高亲和力单抗10b10在建立病毒抗原及其抗体检测方法中具有明显的优势，比4b2具有更大的应用价值和开发潜力。

2.4泛口蹄疫病毒抗原检测方法的初步建立

2.4.1包被多抗和检测单抗使用浓度的确定

对包被多抗和检测单抗10b10与4b2的使用浓度进行方正滴定，结果如表1和表2所示。当捕获牛抗fmdv多抗1:800稀释(2.9μg/ml)、hrp标记检测单抗10b10为1：2000稀释(0.87μg/ml)时，p/n比值最大；当捕获牛抗fmdv多抗1:800稀释(2.9μg/ml)、hrp标记检测单抗4b2为1：1000稀释(1.54μg/ml)时，p/n比值最大。可见，在泛口蹄疫病毒抗原检测方法中，应用单抗10b10时的使用浓度为0.87μg/ml，而应用单抗4b2时的使用浓度为1.54μg/ml，这样使用单抗10b10不但可以节约大概一半的成本、而且预示着也能在一定程度上提高方法的敏感性。

表1多抗最佳包被浓度及检测单抗10b10最佳使用浓度的方阵滴定结果

表2多抗最佳包被浓度及检测单抗4b2最佳使用浓度的方阵滴定结果

2.4.2敏感性试验

将a型fmdv细胞毒(tcid50＝10^6.5)和o型fmdv细胞毒(tcid50＝10^6.25)梯度稀释，进行elisa检测。结果如表3和表4所示。当用hrp标记的10b10作为检测单抗时，该方法对a型fmdv细胞毒的最低检出量为1.05×10⁴tcid50、对o型fmdv细胞毒的最低检出量为5.9×10³tcid50；当用hrp标记的4b2作为检测单抗时，该方法对a型fmdv细胞毒的最低检出量为3.16×10⁴tcid50、对o型fmdv细胞毒的最低检出量为1.78×10⁴tcid50。结果表明，用单抗10b10检测a型和o型fmdv的敏感性比单抗4b2要高3倍左右。

表310b10作为检测单抗的敏感性测定结果

表44b2作为检测单抗的敏感性测定结果

2.5检测泛fmdv抗体的固相竞争elisa方法的初步建立

为检验单抗10b10及其杂交瘤细胞系在口蹄疫病毒抗体检测方法中的应用价值，参照oie标准方法建立固相竞争elisa方法用于检测泛fmdv抗体，分别检测系列稀释的a、o和asia1的阴性血清和阳性血清，并计算抑制百分率。结果如图3所示，应用该固相竞争elisa方法检测fmdva、o和asia1的强阳性、弱阳性和阴性血清，其抑制百分率曲线的形状典型，能够特异性区分三种血清型fmdv的阳性血清与阴性血清。

2.6单抗10b10与单抗4b2的差异性总结

本发明人实验室已有一株针对口蹄疫病毒vp2蛋白上的血清型共享性单抗4b2，其所针对的抗原表位(²kkteettlledr¹³)也已被本实验室所鉴定；而本发明中单抗10b10识别的fmdvvp2蛋白的抗原表位是⁸tlledrilt¹⁶。单抗10b10重链类型为igg2a，轻链为κ类型；而单抗4b2重链类型为igg1，轻链为κ类型。进一步的比较分析结果表明，单抗4b2具有中等强度的亲和力，其相对亲和力指数分2.5mol/l；而单抗10b10具有高强度的亲和力，其相对亲和力指数为5.5mol/l。高强度亲和力的单抗在建立病毒抗原诊断及其抗体检测方法中具有更大的应用价值和潜力，这在本发明检测fmdv的敏感性试验中也得到了证实：将a型和o型fmdv梯度稀释，分别用单抗10b10和4b2进行elisa检测，结果表明，单抗10b10检测a型和o型fmdv的敏感性比单抗4b2要高3倍左右。上述比较分析结果均表明，本发明中的单抗10b10是完全不同于4b2的一株新的口蹄疫病毒共享型单克隆抗体，而且比4b2具有更高的应用价值。

综上所述，单抗10b10在建立泛口蹄疫病毒抗原及其抗体检测方法中具有应用价值。

sequencelisting

<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120>分泌口蹄疫病毒共享型单克隆抗体10b10的杂交瘤细胞系及其应用

<130>hlj-2001-170417a

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