3S-吲哚乙基-6S-芳香氨基酸修饰的哌嗪-2,5-二酮，其合成，活性和应用的制作方法

本发明涉及(3s,6s)-3-(aa-氨基正己酰氨基正丁基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮。涉及它们的制备方法、涉及它们的抗肿瘤活性，涉及它们的抗肿瘤转移活性,以及涉及它们的抗炎活性活性，因而本发明涉及它们在制备抗肿瘤药物，抗肿瘤转移药物和抗炎药物中的应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术

肿瘤严重威胁人类的健康。除了自身对肿瘤患者的预后恶劣之外，肿瘤并发的转移进一步恶化患者的预后。例如，超过90％以上肿瘤患者都是死于转移。由于现有抗肿瘤药物没有抗肿瘤转移作用，所以肿瘤化疗的临床疗效不理想。发明抗肿瘤转移的药物是临床的迫切需求。此前，发明人曾公开s,s-,r,r-,r,s-和s,r-四种构型的的二酮哌嗪在0.5μm浓度可抑制hcclm3(高转移人肝癌细胞)迁移和侵袭。后来发明人又公开r,r-构型的二酮哌嗪在5μmol/kg剂量下可抑制c57bl/6小鼠的肿瘤向肺转移。可是最低有效剂量为5μmol/kg。为了降低最低有效剂量，发明人对s,s-构型的二酮哌嗪的丁氨基展开了各种修饰。经过3年探索，发现用芳香侧链氨基酸(l-phe、l-tyr和l-trp)酰化的氨基正己酸酰化s,s-构型的二酮哌嗪的丁氨基不仅可使抗肿瘤转移的最低有效剂量降至0.5μmol/kg，而且可使抗肿瘤和抗炎的最低有效剂量都降至0.5μmol/kg。有效剂量降低10倍表明，这种结构修饰有突出的技术效果。根据这些发现，发明人提出了本发明。

技术实现要素：

本发明的第一个内容是提供下式的(3s,6s)-3-(aa-氨基正己酰氨基正丁基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(式中aa为l-phe残基，l-tyr残基和l-trp残基)。

本发明的第二个内容是提供(3s,6s)-3-(aa-氨基正己酰氨基正丁基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(式中aa为l-phe残基，l-tyr残基和l-trp残基)的合成方法，该方法包括：

(1)l-boc-lys(cbz)与l-trp-obzl缩合得boc-lys(cbz)-trp-obzl；

(2)boc-lys(cbz)-trp-obzl在氯化氢的乙酸乙酯溶液中脱boc得lys(cbz)-trp-obzl；

(3)lys(cbz)-trp-obzl在5％碳酸氢钠水溶液中环合生成(3s,6s)-3-(苄氧羰氨基正丁基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(1)；

(4)化合物1氢解脱苄氧羰基得到(3s,6s)-3-(氨基正丁基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(2)；

(5)化合物2与boc-氨基正己酸缩合得(3s,6s)-3-(boc-氨基正己酰氨基正丁基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(3)；

(6)化合物3在氯化氢的乙酸乙酯溶液中脱boc得到(3s,6s)-3-(氨基正己酰氨基正丁基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(4)；

(7)化合物4与boc-aa(aa为l-phe残基，l-tyr残基和l-trp残基)缩合得(3s,6s)-3-(boc-aa-氨基正己酰氨基正丁基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(5a-c)。

(8)化合物5a-c在氯化氢的乙酸乙酯溶液中脱boc得到(3s,6s)-3-(aa-氨基正己酰基丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(6a-c)。

本发明的第三个内容是评价(3s,6s)-3-(aa-氨基正己酰氨基正丁基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(式中aa为l-phe残基，l-tyr残基和l-trp残基)抑制c57bl/6小鼠抗肺癌转移活性。

本发明的第四个内容是评价(3s,6s)-3-(aa-氨基正己酰氨基正丁基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(式中aa为l-phe残基，l-tyr残基和l-trp残基)对icr小鼠炎症的抑制作用。

本发明的第五个内容是评价(3s,6s)-3-(aa-氨基正己酰氨基正丁基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(式中aa为l-phe残基，l-tyr残基和l-trp残基)对s180小鼠肿瘤生长的抑制应用。

附图说明

图1(3s,6s)-3-(aa-氨基正己酰氨基正丁基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(6a-c)的合成路线.5a和6a中aa为l-phe残基；5b和6b中aa为l-tyr残基；5c和6c中aa为l-trp残基；i)二环己基碳二亚胺(dcc),1-羟基苯并三唑(hobt),n-甲基吗啉(nmm),四氢呋喃(thf)；ii)氯化氢的乙酸乙酯溶液；iii)乙酸乙酯,5％碳酸氢钠；iv)二甲基甲酰胺(dmf),pd/c,h2。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备boc-lys(cbz)-trp-obzl

将7.7g(20mmol)boc-lys(cbz)混悬于100ml无水四氢呋喃(thf)中，在冰浴下依次往悬浮液中加2.7g(20mmol)1-羟基苯并三氮唑(hobt)及5.0g(25mmol)二环己基碳二亚胺(dcc)，然后搅拌30min。之后，加8.0g(25mmol)trp-obzl。反应化合物逐滴加入n-甲基吗啉(nmm)调节ph至9。反应混合物先在冰浴下搅拌1h，再室温搅拌12h。反应化合物过滤，滤液减压浓缩，残留物用150ml乙酸乙酯溶液溶解。得到的乙酸乙酯溶液依次用5％khso4水溶液洗3次，饱和nacl水溶液洗3次。乙酸乙酯层用无水na2so4干燥12h，过滤，滤液减压浓缩至干。得到的黄色糖浆物经硅胶柱层析纯化(ch2cl2/ch3oh,100:1)得到12.1g(88％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/e):657[m+h]⁺。

实施例2制备lys(cbz)-trp-obzl

在冰浴与搅拌下3.8g(5mmol)boc-lys(cbz)-trp-obzl与52ml氯化氢的乙酸乙酯溶液缓慢混合。得到的溶液在冰浴中搅拌5h。之后，反应混合物减压浓缩。残留物用50ml无水乙酸乙酯溶解，得到的溶液减压浓缩。该操作重复三次。残留物用无水乙醚充分洗，得到3.45g(92％)标题化合物，为黄色粉末。esi-ms(m/e):557[m+h]⁺。

实施例3制备(3s,6s)-3-(苄氧羰基丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(1)

将3.45g(6.2mmol)lys(cbz)-trp-obzl用150ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液用浓度为5％的碳酸氢钠水溶液洗三次之后，乙酸乙酯溶液室温搅拌12h使无色固体充分析出。滤出1.9g(55％)标题化合物。esi-ms(m/e):449[m+h]⁺。

实施例4制备(3s,6s)-3-氨基正丁基-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(2)

往1.9g(4.2mmol)(3s,6s)-3-(苄氧羰氨基正丁基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(1)与20ml无水n,n-二甲基甲酰胺(dmf)的溶液中加200mgpd/c，通入h2，室温搅拌反应48h。滤去pd/c，滤液减压浓缩得1.1g(83％)标题化合物，为白色粉末。esi-ms(m/e)：315[m+h]⁺。

实施例5制备boc-氨基正己酸

往2.62g(20mmol)氨基正己酸与30ml蒸馏水的溶液中加5.23g(boc)2o与30ml二氧六环的溶液，得到的反应液用浓度为2n的naoh水溶液调节ph至9。室温搅拌24h，期间不断减压抽气。反应化合物用khso4水溶液调节ph至7，减压浓缩去除二氧六环。残留的溶液继续用khso4调节ph至2。残留的溶液用100ml乙酸乙酯萃取，用无是水naso4干燥8h。过滤，滤液减压浓缩，得到4.36g(94％)标题化合物。esi-ms(m/e):232[m+h]⁺。

实施例6制备(3s,6s)-3-(boc-氨基正己酰氨基正丁基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(3)

采用实施例1的方法从0.97g(4.2mmol)boc-氨基正己酸和1.9g(3.5mmol)(3s,6s)-3-丁氨基-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(2)得到2.21g(71％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/e):528[m+h]⁺.¹h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝10.865(s,1h),8.018(s,1h),7.918(s,3h),7.586(m,2h),7.313(d,j＝8.1hz,1h),7.042(m,2h),6.952(m,1h),6.744(s,1h),4.109(m,1h),3.640(m,1h),3.228(m,1h),3.031(m,1h),2.891(m,2h),2.745(m,2h),2.004(t,j＝7.2hz,2h),1.575(m,2h),1.431(m,10h),1.118(m,3h),0.970(m,3h),0.612(m,3h)。

实施例7制备(3s,6s)-3-(氨基正己酰氨基正丁基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(4)

采用实施例3的方法从2.21g(4mmol)(3s,6s)-3-(boc-氨基正己酰氨基正丁基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(3)得到1.45g(82％)标题化合物，为无色粉末。esi-ms(m/z):428[m+h]⁺.¹hnmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝10.947(s,1h),8.056(s,1h),7.936(s,3h),7.664(s,1h),7.598(d,j＝7.8hz,1h),7.314(d,j＝8.1hz,1h),7.045(m,2h),6.906(m,1h),4.116(m,1h),3.507(m,1h),3.267(m,2h),3.059(m,1h),2.773(m,4h),2.067(t,j＝7.2hz,2h),1.574-1.463(m,4h),1.290(m,2h),0.986(m,3h),0.601(m,3h)。

实施例8制备(3s,6s)-3-(boc-phe-氨基正己酰氨基正丁基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(5a)

采用实施例1的方法从950mg(3.6mmol)boc-phe和1280mg(3mmol)(3s,6s)-3-(氨基正己酰氨基正丁基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(4)得到1015mg(50％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):675[m+h]⁺.¹hnmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝10.881(s,1h),8.051(m,1h),7.941(s,1h),7.854(m,1h),7.586(m,2h),7.309-7.179(m,10h),7.046(m,2h),6.927(m,2h),4.115(m,2h),3.863(m,1h),3.535(m,3h),3.214(m,2h),3.023(m,4h),2.732(m,5h),2.272(m,1h),2.000(t,j＝7.5hz,2h),1.469(m,2h),1.369(m,15h),1.235(m,6h),0.981(m,4h),0.612(m,3h)。

实施例9制备(3s,6s)-3-(boc-tyr-氨基正己酰氨基正丁基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(5b)

采用实施例1的方法从1011mg(3.6mmol)boc-tyr和1280mg(3mmol)(3s,6s)-3-(氨基正己酰氨基正丁基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(4)得到1150mg(56％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):691[m+h]⁺.¹hnmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝10.883(s,1h),9.170(s,1h),8.058(m,1h),7.948(m,1h),7.802(m,1h),7.587(m,2h),7.311(d,j＝7.8hz,1h),7.022(m,4h),6.949(m,1h),6.781(m,1h),6.622(m,2h),4.112(m,3h),3.997(m,1h),3.497(m,1h),3.228(m,1h),3.076(m,4h),3.038(m,3h),2.785(m,3h),2.003(t,j＝7.2hz,2h),1.454(m,2h),1.312(m,10h),1.195(m,5h),1.030(m,3h),0.566(m,3h)。

实施例10制备(3s,6s)-3-(boc-trp-氨基正己酰氨基正丁基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮((5c)

采用实施例1的方法从1090mg(3.5mmol)boc-trp和1280mg(3mmol)(3s,6s)-3-(氨基正己酰氨基正丁基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(4)得到1190mg(56％)标题化合物，为色固体。esi-ms(m/e):714[m+h]⁺.¹hnmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝10.873(m,1h),10.794(m,1h),8.030(m,1h),7.931(m,1h),7.821(m,1h),7.562(m,3h),7.311(m,2h),7.109-6.901(m,5h),6.702(m,1h),4.118(m,2h),3.500(m,1h),3.371(m,1h),3.064(m,4h),2.893(m,1h),2.842(m,2h),2.026(m,2h),1.498(m,3h),1.131(m,10h),0.981(1.198,6h),0.992(m,3h),0.857(m,2h),0.613(m,3h)。

实施例11制备(3s,6s)-3-(phe-氨基正己酰氨基正丁基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(6a)

按照实施例3的方法从337mg(0.5mmol)(3s,6s)-3-(boc-phe-氨基正己酰氨基正丁基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(5a)得到209mg(73％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/z):575[m+h]⁺；mp146-149℃；[α]d²⁵＝-25.8(c＝0.1,甲醇)；ir(kbr,cm-1):3217,3060,2930,2860,1659,1455,1328,1259,1096,742,699,¹h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝10.929(s,1h),8.389(s,1h),8.101(s,3h),7.950(s,1h),7.635(m,2h),7.350-7.222(m,6h),7.046(m,2h),6.927(m,1h),4.115(s,1h),3.914(t,j＝6.9hz,1h),3.502(s,1h),3.265(m,1h),3.018(m,5h),2.769(d,j＝6.0hz,2h),2.000(t,j＝7.2hz,2h),1.423(m,2h),1.309(m,2h),1.154(m,2h),0.981(m,3h),0.612(m,3h)。

实施例12制备(3s,6s)-3-(tyr-氨基正己酰氨基正丁基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(6b)

按照实施例3的方法从700mg(1mmol)(3s,6s)-3-(boc-tyr-氨基正己酰氨基正丁基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(5b)得到435mg(73％)标题化合物，为白色固体。esi-ms(m/z):591[m+h]⁺.mp159-160℃；[α]d²⁵＝-21.5(c＝0.1,甲醇)；ir(kbr,cm^-1):3220,3078,2935,1659,1556,1455,1328,1233,742,¹h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝10.928(s,1h),9.404(s,1h),8.423(t,j＝5.4hz,1h),8.217(s,3h),8.050(m,1h),7.943(m,1h),7.656(t,j＝5.4hz,1h),7.591(d,j＝7.8hz,1h),7.320(d,j＝8.1hz,1h),7.047(m,4h),6.954(m,1h),6.995(m,2h),4.115(m,1h),3.848(m,1h),3.502(m,1h),3.398(m,1h),3.131-2.964(m,6h),2.751(m,2h),2.016(t,j＝7.2hz,2h),1.492-1.419(m,2h),1.393-1.294(m,2h),1.163(m,2h),0.977(m,3h),0.644-0.529(m,3h).

实施例13制备(3s,6s)-3-(trp-氨基正己酰氨基正丁基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(6c)

按照实施例3的方法从450mg(0.6mmol)(3s,6s)-3-(boc-trp-氨基正己酰氨基正丁基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮((5c)得到315mg(81％)标题化合物，为无色粉末。esi-ms(m/z):614[m+h]⁺；mp172-173℃；[α]d²⁵＝-30.4(c＝0.1,甲醇)；ir(kbr,cm-1):3226,3078,2935,1661,1539,1456,1337,1236,1194,1100,1010,742,¹h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝11.065(s,1h),10.949(s,1h),8.514(s,1h),8.226(s,3h),8.063(s,1h),7.952(s,1h),7.671(m,2h),7.648(d,j＝7.8hz,1h),7.382(m,2h),7.209(s,1h),7.115-6.903(m,5h),4.118(m,1h),3.927(m,1h),3.502(m,1h),3.280-3.006(m,6h),2.773(m,2h),2.010(t,j＝6.9hz,2h),1.430(m,2h),1.309(m,2h),1.154(m,2h),0.981(s,3h),0.613(m,3h)。

实施例14测定化合物6a-c的抗肿瘤转移活性

本测定模型用lewis小鼠肺癌细胞(llc,购自atcc)接种,选用dmem培养基(含10％经灭活的胎牛血清,1×10⁵u/l青霉素和100mg/l链霉素),按照贴壁细胞培养方法每两天传代一次，富集细胞。待细胞生长状态良好并处于对数生长期时消化细胞，用生理盐水调整细胞密度至1×10⁷个/ml。胎盘蓝染色，使活细胞计数>95％。取近交系c57bl/6雄性小鼠(spf级,体重20±2g)，左手固定小鼠。用75％乙醇对小鼠右前肢腋窝皮肤消毒。右手持1ml无菌注射器往小鼠腋部皮下注射llc肿瘤细胞悬液，每只小鼠注射0.2ml。小鼠接种10天后，长出直径约4-5mm的肿瘤即为瘤源。接种10天的lewis肺癌荷瘤小鼠乙醚麻醉，脱颈椎处死。用75％乙醇浸泡10min，消毒，在超净工作台上剥离瘤体。选择生长良好的肿瘤组织在无菌平皿中剪碎，置于玻璃制造的组织匀浆器内。按瘤块重比生理盐水体积为1比3(g比ml)的比例加温度为4℃的生理盐水，轻轻研磨制成细胞悬液。细胞悬液过200目细胞筛制单细胞悬液。用生理盐水调单细胞悬液的细胞密度至1.5×10⁷个/ml。胎盘蓝染色，使活细胞计数>95％。左手固定近交系c57bl/6雄性小鼠，用75％的乙醇对小鼠右前肢腋窝皮肤消毒。右手持1ml无菌注射器于小鼠腋部皮下注射瘤细胞悬液，每只注射0.2ml。接种10天后小鼠长出直径4-5mm的肿瘤，按测得的肿瘤体积将接种小鼠随机分组。每组12只小鼠。接种肿瘤的第11天小鼠或口服公认的抗肿瘤转移肽rgds的生理盐水溶液(剂量为20μmol/kg/天)或口服化合物6a-c的生理盐水溶液(剂量为0.5μmol/kg/天)或口服化合物4的生理盐水溶液(剂量为5μmol/kg/天)或口服生理盐水(剂量为10ml/kg/天)，每天给1次药，连续给药12天，每隔两天测量并记录肿瘤体积。最后一次给药的次日测量瘤体积，乙醚麻醉脱颈椎处死，取小鼠的肿瘤称重，取小鼠的肺并计算肿瘤肺部转移的瘤节数。用t检验对数据进行统计分析。结果见表1。在0.5μmol/kg剂量下化合物6a-c不仅有效地抑制肿瘤肺转移，而且活性与剂量比它们高40倍的rgds及高10倍的化合物4没有显著性差异。这些数据表明，本发明有显著的技术效果。

表1化合物6a-c的抗肿瘤转移活性

a)与生理盐水比p<0.01；b)与生理盐水比p<0.01,与rgds及化合物4比p>0.05；c)与生理盐水比p<0.05；n＝12。

实施例15测定化合物6a-c的抗肿瘤生长活性

测定前将阿霉素,化合物4和化合物6a-c都用生理盐水溶解,用于s180小鼠给药。在无菌环境中取接种于雄性icr小鼠10天生长旺盛的s180腹水瘤液，用生理盐水稀释成(1:2)的液体充分混合，将肿瘤细胞悬液用新鲜配制的0.2％台盼蓝染色，混匀后按白细胞计数方法计数，染蓝色者为死细胞，不染色者为活细胞。按细胞浓度＝4大方格内活细胞数/4×10⁴×稀释倍数＝细胞数/ml计算细胞密度，按细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％计算细胞存活率。将存活率大于90％的瘤液用匀浆法制成密度为2.0×10⁷个/ml的细胞悬液。该细胞悬液接种于小鼠右腋皮下(0.2ml/只)，制造s180荷瘤小鼠。接种24h后s180荷瘤小鼠每日腹腔注射阿霉素的生理盐水溶液(剂量为2μmol/kg/天g)或每日口服化合物4的生理盐水溶液(剂量为5μmol/kg/天)或每日口服化合物6a-c的生理盐水溶液(剂量为0.5μmol/kg/天)。每天给药一次，连续给药12天。最后一次给药的次日测量瘤体积，乙醚麻醉脱颈椎处死，然后用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位，剪开皮肤钝性剥离肿瘤并称重。用瘤重(均值±sdg)表示疗效，数据用t检验和方差分析。结果见表2。在0.5μmol/kg剂量下化合物6a-c不仅有效地抑制肿瘤生长，而且活性与剂量比它们高10倍的化合物4没有显著性差异。这些数据表明，本发明有显著的技术效果。

表2化合物6a-c对s180小鼠肿瘤生长的影响

a)与生理盐水比p<0.05,与化合物4比p>0.05；b)与生理盐水比p<0.01,与化合物4比p>0.05；n＝12.

实施例16测定化合物6a-c的抗炎活性

因为二甲苯引起的小鼠耳肿胀被公认为急性炎症模型，所以本发明在二甲苯引起的小鼠耳肿胀模型上测定化合物6a-c的治疗作用。因为阿司匹林是治疗急性炎症的阳性药，所以本发明选择阿司匹林为阳性对照药。icr雄性小鼠(体重42±3g)在温度为22℃的环境静息2天,自由饮水和进食。之后，随机分为生理盐水组(剂量为0.2ml/只)，阿司匹林组(剂量为1.11mmol/kg)，化合物4组(剂量为5μmol/kg)及化合物6a-c组(剂量为0.5μmol/kg)，每组12只小鼠。测定时小鼠按所在组或口服生理盐水，或口服阿司匹林，或口服化合物4，或口服化合物6a-c。给药30min后,往小鼠的左耳廓均匀涂抹30μl二甲苯,2h后小鼠接受乙醚麻醉，断颈处死,剪下左右两耳,用7mm的打孔器在两耳的相同位置取圆形耳片,称重,求出两耳肿胀差值作为肿胀度。即肿胀度＝左耳圆片重量–右耳圆片重量。在0.5μmol/kg剂量下化合物6a-c不仅有效地抑制二甲苯引起的小鼠耳肿胀，而且活性与剂量比它们高10倍的化合物4没有显著性差异。这些数据表明，本发明有显著的技术效果。

表3化合物6a-c对二甲苯引起的小鼠耳肿胀的影响

a)与生理盐水比p<0.05,与化合物4比p>0.05；b)与生理盐水及化合物4比p<0.01；n＝12。