无血清培养人牙龈间充质干细胞的方法与流程

本发明涉及无血清培养人牙龈间充质干细胞的方法，属于细胞培养技术领域。

背景技术：

2009年zhang等从人牙龈组织中分离培养出一种新牙龈来源的间充质干细胞之后，多项研究发现，该细胞具有间充质干细胞的基本特性，并且生长迅速、均一、无致瘤性，经多次传代后仍保持有间充质干细胞的表型及端粒酶活性，优于骨髓来源间充质干细胞。gmscs不仅在再生医学发挥作用，而且已成为细胞免疫治疗的种子细胞，然而，目前用于gmscs培养基多为胎牛血清作为营养来源，若将其应用于人体，存在较大风险，如阮病毒感染，人体内抗牛血清蛋白的产生等，因此，迫切需要应用无血清培养基培养齿龈间充质干细胞，并保持干细胞分化及免疫调节功能，最小化疾病传播的风险。

新型内容

本发明的目的是提供无血清培养人牙龈间充质干细胞的方法。

本发明要解决的问题是目前用于gmscs培养基多为胎牛血清作为营养来源，若将其应用于人体，存在较大风险的问题。

为实现本发明的目的，本发明采用的技术方案是：

无血清培养人牙龈间充质干细胞的方法，其特征有以下步骤：

a.进行牙龈组织样本取样，样本为牙龈切除术的牙龈健康的患者，年龄20~62岁，对患者口腔进行局部麻醉，清洗口腔，用碘伏全面消毒后，做出切口标记线，角形切口，按标记线切开后，切除牙龈，将其置入10ml无菌1640rpmi培养液中，进行充分的摇晃后静止，送于实验室培养；

b.准备好材料：mesengro无血清培养基、mem-α培养基、rpmi1640培养基、谷氨酰胺、胰蛋白酶、胎牛血清、鼠抗人cd3抗体，丝裂霉素c、地塞米松、吲哚美辛、ibmx、胰岛素、抗坏血酸vitc和β-甘油磷酸钠。

获取健康成人的健康牙龈组织，用rpmi1640冲洗干净，利用终浓度2mg/ml的dispaseⅱ消化8~12h后，加终浓度4mg/ml的collagenaseⅳ在37℃温度下消化2h，获取单个核细胞，10%浓度的fbsmem-α培养基培养牙龈间充质干细胞，当细胞长至80%~90%融合后，用0.25%胰蛋白酶+0.01%edta37℃消化2min，传代培养逐渐转移至mesengro无血清完全培养基中，台盼蓝未染色细胞存活率＞95%；

d.利用facscalibur流式细胞仪鉴定牙龈间充质干细胞表型，包括hla-dr、cd29、cd33、cd34、cd73、cd105、cd90、cd86，在生长良好的牙龈间充质干细胞中加入标准的含有含地塞米松0.5umol/l、吲哚美辛100mmol/l、ibmx0.5mmol/l、胰岛素10mg/l、10%fbsmem-α培养基成分的成脂诱导剂，在第21天进行油红o染色，相差显微镜下观察脂肪小滴形成情况；加入含有含抗坏血酸vitc50ug/ml，地塞米松107mol/l，β-甘油磷酸钠10mmol/l、10%fbsmem-α培养基的矿化诱导液，第21天用0.1%茜红染色，相差显微镜下观察矿化结节形成情况。

先用紫外光照射96孔酶标板，对96孔酶标板进行杀菌处理，取对数生长期的10%fbsmem-α、mesengro无血清培养的gmscs以10³cells/孔接种于96孔板内，每孔0.1ml，24h、48h、72h、96h、108h后，每孔加入10μlcck8，继续培养2h后，酶标仪波长450nm处检测吸光度（a）值，实验重复3次；

f.将第3代10%fbsmem-α、mesengro无血清培养gmscs接种于96孔板，培养24小时，第2日取新鲜外周血10ml，利用密度1.077±0.001g/ml的淋巴细胞分离液，分离获得单个核细胞2×10⁷，将细胞重悬于10%fbsrpmi1640培养基，将贴壁的gmscs与pbmc按梯度比例共培养，梯度比例分别为gmscs：pbmc为1:1、1:5、1:25、1:50、1:100、1:200，经过mitomycin处理的apc细胞和人cd3抗体刺激3d后，将悬浮的pbmc转移至新的96孔培养板中，细胞悬液加入10μlcck-8，继续培养2h后，450nm波长下测量od值确定增殖后的pbmc量，并计算gmscs对pbmc增殖的抑制率，抑制率=[（对照组-实验组）/对照组]×100%。

本发明的优点是：应用无血清或10%fbs培养gmsc在形态上并无明显区别，均呈梭形，鱼群样生长，有明显的漩涡状，具有克隆形成能力，流式细胞仪对间充质干细胞的表面标志物检测显示，与10%fbs培养gmsc一致，无血清培养gmsc高表达cd29、cd73、cd90、cd105，而不表达cd33、cd34、cd86、hla-dr，该细胞为非造血干细胞来源，与间充质干细胞的表型一致，无血清培养gmsc成脂和成骨能力均与10%fbs培养gmsc相似，可见，无血清培养gmsc符合间充质干细胞的鉴定标准，并与10%fbs培养gmsc在形状、表型、诱导分化能力等方面一致，可用于gmsc培养。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步的说明。

图1为第3代牙龈间充质干细胞形态；

图2为第3代10%fbs或无血清培养牙龈间充质干细胞流式表型；

图3为第3代10%fbs或无血清培养牙龈间充质干细胞增殖情况，^ap<0.05

本发明无血清培养人牙龈间充质干细胞的方法，其特征有以下步骤：

a.进行牙龈组织样本取样，样本为牙龈切除术的牙龈健康的患者，年龄20~62岁，对患者口腔进行局部麻醉，清洗口腔，用碘伏全面消毒后，做出切口标记线，角形切口，按标记线切开后，切除牙龈，将其置入10ml无菌1640rpmi培养液中，进行充分的摇晃后静止，送于实验室培养；

b.准备好材料：mesengro无血清培养基、mem-α培养基、rpmi1640培养基、谷氨酰胺、胰蛋白酶、胎牛血清、鼠抗人cd3抗体，丝裂霉素c、地塞米松、吲哚美辛、ibmx、胰岛素、抗坏血酸vitc和β-甘油磷酸钠。

获取健康成人的健康牙龈组织，用rpmi1640冲洗干净，利用终浓度2mg/ml的dispaseⅱ消化8~12h后，加终浓度4mg/ml的collagenaseⅳ在37℃温度下消化2h，获取单个核细胞，10%浓度的fbsmem-α培养基培养牙龈间充质干细胞，当细胞长至80%~90%融合后，用0.25%胰蛋白酶+0.01%edta37℃消化2min，传代培养逐渐转移至mesengro无血清完全培养基中，台盼蓝未染色细胞存活率＞95%；

d.利用facscalibur流式细胞仪鉴定牙龈间充质干细胞表型，包括hla-dr、cd29、cd33、cd34、cd73、cd105、cd90、cd86，在生长良好的牙龈间充质干细胞中加入标准的含有含地塞米松0.5umol/l、吲哚美辛100mmol/l、ibmx0.5mmol/l、胰岛素10mg/l、10%fbsmem-α培养基成分的成脂诱导剂，在第21天进行油红o染色，相差显微镜下观察脂肪小滴形成情况；加入含有含抗坏血酸vitc50ug/ml，地塞米松107mol/l，β-甘油磷酸钠10mmol/l、10%fbsmem-α培养基的矿化诱导液，第21天用0.1%茜红染色，相差显微镜下观察矿化结节形成情况。

先用紫外光照射96孔酶标板，对96孔酶标板进行杀菌处理，取对数生长期的10%fbsmem-α、mesengro无血清培养的gmscs以10³cells/孔接种于96孔板内，每孔0.1ml，24h、48h、72h、96h、108h后，每孔加入10μlcck8，继续培养2h后，酶标仪波长450nm处检测吸光度（a）值，实验重复3次；

f.将第3代10%fbsmem-α、mesengro无血清培养gmscs接种于96孔板，培养24小时，第2日取新鲜外周血10ml，利用密度1.077±0.001g/ml的淋巴细胞分离液，分离获得单个核细胞2×10⁷，将细胞重悬于10%fbsrpmi1640培养基，将贴壁的gmscs与pbmc按梯度比例共培养，梯度比例分别为gmscs：pbmc为1:1、1:5、1:25、1:50、1:100、1:200，经过mitomycin处理的apc细胞和人cd3抗体刺激3d后，将悬浮的pbmc转移至新的96孔培养板中，细胞悬液加入10μlcck-8，继续培养2h后，450nm波长下测量od值确定增殖后的pbmc量，并计算gmscs对pbmc增殖的抑制率，抑制率=[（对照组-实验组）/对照组]×100%；

图3中，无血清培养gmscs增殖情况应用cck-8分别检测第3代10%fbs或无血清培养gmscs24h、48h、72h、96h、108h增殖情况，结果显示10%fbs与无血清培养gmscs在24h和48h比较两者增殖情况无明显区别，差异位为p＞0.05，无统计学意义，但是72h、96h、108h后10%fbs培养gmscs增殖明显高于无血清培养gmscs，差异位p=0.0033、0.0125、0.0133；

应用无血清或10%fbs培养gmsc在形态上并无明显区别，均呈梭形，鱼群样生长，有明显的漩涡状，具有克隆形成能力，流式细胞仪对间充质干细胞的表面标志物检测显示，与10%fbs培养gmsc一致，无血清培养gmsc高表达cd29、cd73、cd90、cd105，而不表达cd33、cd34、cd86、hla-dr，该细胞为非造血干细胞来源，与间充质干细胞的表型一致，无血清培养gmsc成脂和成骨能力均与10%fbs培养gmsc相似，可见，无血清培养gmsc符合间充质干细胞的鉴定标准，并与10%fbs培养gmsc在形状、表型、诱导分化能力等方面一致，可用于gmsc培养。