一株防治红火蚁的球孢白僵菌BbL25菌株及其应用的制作方法

本发明属于生物防治
技术领域：
。更具体地，涉及一株防治红火蚁的球孢白僵菌bbl25菌株及其应用。
背景技术：
：红火蚁solenopsisinvictaburen属于膜翅目hymenoptera蚁科formicidae切叶蚁亚科myrmicinae火蚁属solenopsis，红火蚁作为公认的危害性外来入侵物种，是一种典型的农林业害虫，对所入侵地区造成严重危害。在我国，红火蚁已经入侵台湾、广东、香港、澳门、福建、广西、湖南、海南、四川、江西、云南等11个省区。红火蚁拥有强大的破坏力和攻击性，取食植物的种子，捕食无脊椎动物，通过尾刺释放毒液叮咬人类与野生动物，咬食电子电器设备绝缘层破坏土木基础设施等。对人类健康，生物多样性，农林业生产与基础设施安全造成严重威胁。红火蚁的防治主要有物理防治、化学防治、生物防治等方法，其中施用化学杀虫剂是主要方法。但长期使用化学防治会导致红火蚁产生抗药性问题，在防治过程中需要不断加大化学药剂使用量，从而使防治成本不断提高。另外化学农药的过度使用易对土壤及其周围的非靶标生物造成危害和污染，影响环境安全与生物多样性。化学农药防治的安全性已成为限制红火蚁防治的关键因素，而开展和利用生物防治方法防治红火蚁成为一种趋势。近来国内外对红火蚁的生物防治进行了大量研究，研究包括利用天敌昆虫、捕食性螨类、寄生性线虫和病原微生物进行防治。真菌杀虫剂具有寄主范围广、对环境安全、防治害虫不产生抗药性等优点，是防治红火蚁的理想手段。有多种虫生真菌可侵染红火蚁，如玫烟色棒孢霉isariafumosorosea、黄绿绿僵菌metarhiziumflavoviride、金龟子绿僵菌metarhiziumanisoplia和球孢白僵菌beauveriabassiana、淡紫拟青霉paecilomyceslilacinus等，并已有一些相关发明专利公开：专利申请号201610656107.0公开了一株抗紫外线的高毒力金龟子绿僵菌诱变菌株mauv1(保藏编号为cctccno：m2016250)及其应用，该菌株对抗药性小菜蛾、红火蚁等害虫具有较强的侵染杀虫效果，而且抗紫外线能力强；专利申请号201510103305.x公开了一种防治红火蚁的微生物杀虫剂组合物，白僵菌和噻虫啉复配有显著的增效作用，防治效果非常好，对红火蚁具有高效、快速的优点；专利申请号201310721119.3公开了一种玫烟色棒束孢与阿维菌素油悬浮剂及其制备方法和应用，该悬浮剂主要用于小菜蛾和红火蚁等害虫的防治；专利申请号201120139109.5公开了一种诱集红火蚁感染虫生真菌的装置，防治红火蚁效果很好，其装置内植物油表面粘附的分生孢子为爪哇棒束孢菌p028菌株的分生孢子；专利申请号200810029158.6公开了一种爪哇拟青霉菌株及其应用，爪哇拟青霉对粉虱、红火蚁、斜纹夜蛾、蚜虫、小菜蛾等害虫具有很强的侵染杀虫效果；专利申请号200810029745.5公开了一种爪哇拟青霉与印楝素的复配杀虫剂，对红火蚁、斜纹夜蛾、蚜虫、粉虱和小菜蛾等害虫有很好的防治效果。还有一些关于红火蚁致病虫生真菌的研究报告，吕利华等(2011)通过测定6株不同来源的昆虫病原真菌对红火蚁的致病能力，发现了球孢白僵菌bb02、bb04菌株具较强的致病力和致死速度，是红火蚁微生物防治的优良菌株；刘晓燕等(2010)对采自广州番禺区、南沙区、惠州和深圳市等地的红火蚁虫体进行病原菌的分离与鉴定，测定发现分离物pl对红火蚁有一定致病作用；刘晓燕等(2014)通过设置17、21、25、29和33℃5个温度水平，采用喷雾法，将浓度为1×105和1×108个ml-1的白僵菌孢子悬浮液分别感染红火蚁工蚁，以测试不同温度下白僵菌菌株对红火蚁工蚁的致病力；杨佳后等(2009)在室内筛选了对红火蚁敏感的4株球孢白僵菌菌株，结果发现这4株菌在红火蚁的生物防治中具有一定的潜力；王磊等(2014)研究了不同剂量金龟子绿僵菌m09对红火蚁的毒力，结果表明红火蚁的死亡率与金龟子绿僵菌的剂量呈正相关；许齐爱等(2013)筛选到了一株防控红火蚁危害的优良生防菌株-黄绿绿僵菌菌株sm076。但是，上述致病虫生真菌防控红火蚁的效果不甚理想，而且研究都只是在室内条件下进行，由于室内测定条件与实际应用不同，温湿度等环境因子对白僵局的致病力有很大的影响(梁宗琦和叶育昌，1994；潘志萍，2008)，因此这些虫生真菌在田间环境中对红火蚁的防治效果未经证实。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中红火蚁致病虫生真菌存在的缺陷和不足，提供一株防治红火蚁的球孢白僵菌bbl25菌株。所述球孢白僵菌bbl25菌株对红火蚁高度致病，田间防治效果理想，可作为一种活体生物杀虫剂，对环境无污染、对人畜无毒性，适用于有机农产品生产，具有较大的应用前景。本发明的目的是提供一株防治红火蚁的球孢白僵菌bbl25菌株。本发明的另一目的是提供上述球孢白僵菌bbl25菌株的应用。本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：一株防治红火蚁的球孢白僵菌(beauveriabassiana)bbl25菌株，所述菌株于2017年2月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，菌种保藏编号为cctccno：m2017045，分类命名号为beauveriabassianabbl25；保藏地址为中国武汉武汉大学。所述菌株由内蒙古赤峰市巴林右旗西拉沐沦的土壤中分离纯化获得，通过生物活性测定、生物学特性研究菌种鉴定，明确所述菌株是对红火蚁高效的虫生真菌菌株，所述菌株分类地位属于半知菌亚门(deuteromycotina)、丝孢纲(hyphomycetes)、丛梗孢目(moniliales)、丛梗孢科(moniliaceae)、白僵菌属(beauveria)。所述菌株在马铃薯葡萄糖培养基上的形态学特征如下：菌落初期为白色，表面绒毛状；菌落培养到第12天，菌落圆形，中央与边缘微隆起，中部大部分地方略微凹陷，表面呈白色，绒毛状，背面为淡黄色，直径为(68.16±1.96)mm，后期菌落中部变为粉末状。在光学显微镜下，菌丝有隔、有分枝、透明，宽度为(1.08±0.14)μm；产孢细胞轮生或单生，分生孢子梗不分枝，分生孢子梗顶端膨大，分生孢子浓密地生长在分生孢子梗上；分生孢子球形或近球形、单胞、无色，直径(2.05±0.13)μm。进一步地，所述球孢白僵菌bbl25菌株的its1-5.8s-its4rdna序列如seqidno：1所示。进一步地，所述球孢白僵菌bbl25菌株的β-微管蛋白基因序列如seqidno：2所示。本发明的球孢白僵菌bbl25菌株在室内接种红火蚁后第14天对红火蚁的半致死浓度(lc50)为8.15×105分生孢子/ml且该菌株对红火蚁有较好的田间防治效果，1×107/ml的孢子悬浮液对红火蚁的防治效果在施药后14天达到82.52％，与化学杀虫剂0.25％氟虫胺饵剂的效果相当。所述球孢白僵菌bbl25菌株的分生孢子悬浮液浸渍红火蚁后第2～3天，红火蚁出现行动缓慢、萎靡不振的现象，继而发生死亡。在光学显微镜下，可观察到白色菌丝首先从红火蚁尸体的足关节、口器、体节处伸出体外，随着时间推移，菌丝上产生大量白色分生孢子。因此，所述球孢白僵菌bbl25菌株在防治红火蚁中的应用及在制备防治红火蚁药剂中的应用亦在本发明保护范围内。优选地，所述应用的方法为：收获球孢白僵菌bbl25菌株的分生孢子，用0.01～0.03％(优选0.02％)吐温80溶液配制成浓度为5×106～1×107/ml(优选1×107/ml)的孢子悬浮液，采用喷雾法将孢子悬浮液喷洒于红火蚁身上进行红火蚁防治。具体可在红火蚁聚集于蚁窝表面时喷洒于红火蚁身上从而进行防治。同时，本发明还提供一种防治红火蚁的生物制剂，所述生物制剂中包含有上述球孢白僵菌bbl25菌株。优选地，所述生物制剂中包含有5×106～1×107孢子/ml的球孢白僵菌bbl25菌株孢子悬浮液。更优选地，所述生物制剂中包含有1×107孢子/ml的球孢白僵菌bbl25菌株孢子悬浮液。同时，上述生物制剂在防治红火蚁中的应用也在本发明保护范围内。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)本发明所述球孢白僵菌bbl25菌株对防治红火蚁高效，施药后14天对红火蚁的半致死浓度(lc50)为8.15×105/ml。(2)本发明所述球孢白僵菌bbl25菌株对红火蚁有较好的田间防治效果，1×107/ml的孢子悬浮液对红火蚁的防治效果在施药后14天达到82.52％，与化学杀虫剂0.25％氟虫胺饵剂的效果相当。(3)本发明所述球孢白僵菌bbl25菌株是一种昆虫病原真菌，可作为生物活体农药，具有对环境无污染，对人畜无毒性的特征，适用于有机农产品生产需求，具有较大的应用前景。附图说明图1为球孢白僵菌bbl25菌株在马铃薯葡萄糖培养基上，25℃，培养12天时的菌株菌落形态；a为正面，b为反面。图2为球孢白僵菌bbl25菌株产孢结构和分生孢子显微图；a为产孢结构，b为分生孢子。图3为球孢白僵菌bbl25菌株侵染红火蚁时的形态特征。图4为球孢白僵菌bbl25菌株的its1-5.8s-its4rdna基因与β-微管蛋白基因特异性扩增电泳图。图5为球孢白僵菌bbl25菌株的rdna-its基因序列分支发育树。图6为球孢白僵菌bbl25菌株的β-微管蛋白基因序列分支发育树。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1球孢白僵菌bbl25菌株的分离与鉴定1、菌株分离所述菌株由内蒙古赤峰市巴林右旗西拉沐沦的土壤中分离纯化获得。2、菌株的形态学鉴定将获得的菌株在马铃薯葡萄糖培养基上培养，其形态学特征为：菌落初期为白色，表面绒毛状；菌落培养到第12天，菌落圆形，中央与边缘微隆起，中部大部分地方略微凹陷，表面呈白色，绒毛状，背面为淡黄色，直径为(68.16±1.96)mm，后期菌落中部变为粉末状(如图1所示)。在光学显微镜下，菌丝有隔、有分枝、透明，宽度为(1.08±0.14)μm；产孢细胞轮生或单生，分生孢子梗不分枝，分生孢子梗顶端膨大，分生孢子浓密地生长在分生孢子梗上；分生孢子球形或近球形、单孢、无色，直径(2.05±0.13)μm(如图2所示)。3、菌株的分子鉴定将获得的菌株进行进一步的分子鉴定。所述菌株的its1-5.8s-its4rdna基因特异性扩增物和β-微管蛋白基因特异性扩增物的电泳图如图4所示；其相应的its1-5.8s-its4rdna基因序列和β-微管蛋白基因序列依次如seqidno：1～2所示。在ncbi数据库比对its1-5.8s-its4rdna基因序列，对比结果表明，所述菌株序列与多个球孢白僵菌(beauveriabassiana)菌株序列高度相似。将该菌株与几个球孢白僵菌菌株，及以玫烟色棒孢霉(isariafumosorosea)菌株为外群，构建其系统发育进化树；结果如图5所示，本发明分离到的菌株与所有球孢白僵菌聚集在同一个分支上，其亲缘关系为高度同源。在ncbi数据库比对β-微管蛋白基因序列，比对结果表明，所述菌株序列与多个球孢白僵菌(beauveriabassiana)菌株和一株布氏白僵菌(beauveriabrongniartii)菌株序列高度相似。将该菌株与球孢白僵菌、布氏白僵菌、一些近似菌株，及以玫烟色棒孢霉(i.fumosorosea)为外群，构建其系统发育进化树；结果如图6所示，本发明分离到的菌株与球孢白僵菌、一株布氏白僵菌在同一个分支上，其亲缘关系为高度同源。因此，综合its1-5.8s-its4rdna序列分支发育树和β-微管蛋白基因序列分支发育树鉴定所述菌株为球孢白僵菌(beauveriabassiana)，其分类地位属于半知菌亚门(deuteromycotina)、丝孢纲(hyphomycetes)、丛梗孢目(moniliales)、丛梗孢科(moniliaceae)、白僵菌属(beauveria)。将该菌株并命名为球孢白僵菌(beauveriabassiana)bbl25菌株，并于2017年2月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，菌种保藏编号为cctccno：m2017045，分类命名号为beauveriabassiana；保藏地址为中国武汉武汉大学。实施例2球孢白僵菌bbl25菌株对红火蚁的毒力测定1、孢子悬浮液制备(1)分生孢子生产取实施例1保存的球孢白僵菌bbl25菌株的斜面菌种，刮取少量分生孢子接种至pda平板上，25℃培养箱中培养至菌落快要长满培养皿，刮取菌落表层分生孢子备用。(2)分子孢子悬浮液配制将步骤(1)刮取的分生孢子置于离心管中，加入0.02％的吐温-80溶液，振荡摇匀，用血球计数板测量孢子浓度，配制成所需不同浓度的分生孢子悬浮液，备用。配制如下浓度的球孢白僵菌bbl25菌株的分生孢子悬浮液：(1)1×106个/ml；(2)5×105个/ml；(3)1×105个/ml；(4)5×104个/ml；在实验室内条件下，将红火蚁在上述4个不同的浓度孢子悬浮液中进行浸渍处理，处理后连续14天调查红火蚁的死亡率，用spss软件分析计算各浓度的致死率、致死中浓度(lc50)；计算公式如下：死亡率(％)＝死亡虫数/处理前虫数×100％校正死亡率(％)＝(处理死亡率-对照死亡率)/(1-对照死亡率)×100％2、结果结果显示，浸渍处理14天后，球孢白僵菌bbl25菌株分生孢子对红火蚁毒力效果为：1×106个/ml、5×105个/ml、1×105个/ml、5×104个/ml4个浓度分别对应校正死亡率64.77％、38.10％、9.52％、19.05％(如表1所示)。用spss17.0软件对分生孢子浓度与红火蚁校正死亡率进行回归分析，处理后的出球孢白僵菌的半致死浓度(lc50)为8.15×105分生孢子/ml(如表2所示)，结果表明，球孢白僵菌bbl25菌株对红火蚁的处理效果很好。表1不同浓度的bbl25菌株孢子悬浮液对红火蚁的毒力测定结果浓度/ml-11×1065×1051×1055×104校正死亡率64.77％38.10％9.52％19.05％表2bbl25菌株对红火蚁毒力probit模型及其半致死浓度(lc50)模型方程卡方检验pblc50及95％置信区间(孢子/ml)y＝1.233x-7.286a0.6958.15×105(3.04×105-2.31×106)a：浓度x使用底数为10的对数来转换b：拟合优度检验结果中，pearson卡方检验的p>0.05，说明拟合度没有问题本实施例在生物测定同时，还对球孢白僵菌bbl25菌株侵染红火蚁进行了观察。观察时间分别为红火蚁死亡后的第2～4天，在解剖镜下观察其侵染红火蚁的形态特征，其结果如图3所示：球孢白僵菌分生孢子悬浮液浸渍红火蚁后第2～4天，红火蚁出现行动缓慢、萎靡不振的现象，继而发生死亡。在光学显微镜下，可观察到白色菌丝首先从红火蚁尸体的足关节、口器、体节处伸出体外，随着时间推移，菌丝上产生大量白色分生孢子。实施例3几种虫生真菌对红火蚁致病力测定1、按照上述实施例2中步骤(1)生产分生孢子的方法，将来自内蒙古不同地点土壤中代号为ms-01、ms-02、ms-03、ms-05、ms-06、ms-08、ms-13、ms-22、l18、bbl25菌株和来自广州地区斜纹夜蛾僵虫分离的爪哇菌株、广州地区烟粉虱僵虫分离的玫烟色棒孢霉(ifb01)分别配制成1.0×107个孢子/ml，在实验室内条件下，用孢子悬浮液浸渍处理红火蚁，处理后连续14天调查红火蚁的死亡率。死亡率(％)＝死亡虫数/处理前虫数×100％校正死亡率(％)＝(处理死亡率-对照死亡率)/(1-对照死亡率)×100％2、不同菌株对烟粉虱的校正死亡率如表3所示；结果显示，球孢白僵菌bbl25菌株对红火蚁的校正死亡率最高，为87.29％，显示出对红火蚁很强的致病力。表3不同虫生真菌菌株对红火蚁致病力的测定结果(1×107ml)实施例4球孢白僵菌bbl25菌株对红火蚁的田间药效试验1、按照上述实施例2中步骤(1)生产分生孢子的方法，将球孢白僵菌分生孢子加入0.02％的吐温-80溶液中，按以下浓度或方法设置实验组和对照组：(1)1×106/ml的孢子悬浮液；(2)5×106/ml的孢子悬浮液；(3)1×107/ml的孢子悬浮液；(4)阳性对照：0.25％氟虫胺饵剂(商品名：灭蚁皇，广东肇庆市鼎湖区临富生物制剂有限公司)；(5)空白对照：清水。试验在华南农业大学宁西教学科研基地进行，设3个处理(1×106，5×106和1×107孢子/ml悬浮液)，每个处理4个蚁巢，重复3次，设0.25％氟虫胺饵剂与清水对照。施药时先用细木棒搅动蚁巢，引诱大量红火蚁爬出蚁巢表面，分别喷洒不同浓度的球孢白僵菌bbl25菌株分生孢子悬浮液直至蚁巢完全湿透，处理后对蚁巢做好标记。在施药前，以及施药后7天、14天，在蚁巢附近用内置火腿肠的诱集瓶诱集红火蚁30min，然后带回计数，计算红火蚁的虫口减退率和防治效果。虫口减退率(％)＝(1-药后处理诱集瓶诱集红火蚁总数/药前诱集瓶诱集红火蚁总数)×100防治效果(％)＝100×(处理减退率-ck减退率)/(100-ck减退率)2、试验结果表明，球孢白僵菌bbl25菌株在野外对红火蚁有较好的防治效果，随着使用孢子悬浮液浓度的增加，本菌株的防治效果相应增加。当1×107/ml孢子在施药后7天与14天内，防治效果分别达到67.14％和82.52％，与0.25％氟虫胺饵剂的效果相当(表4)。表4球孢白僵菌bbl25菌株对红火蚁田间防治效果注：数字后的字母表示经新复极差法(dmrt)分析后的显著性差异，字母不同表示具有显著性差异(p<0.05)。本发明使用喷雾法对球孢白僵菌进行了野外药效的试验，与防治红火蚁的化学药剂作比较，球孢白僵菌的防治效果相对较高，且持续性较长。sequencelisting<110>华南农业大学<120>一株防治红火蚁的球孢白僵菌bbl25菌株及其应用<130>2017<160>2<170>patentinversion3.3<210>1<211>540<212>dna<213>beauveriabassianabbl25<400>1gtggcatcgactcactccctacccttctgtgacctacctatcgttgcttcggcggactcg60ccccagcccggacgcggactggaccagcggcccgccggggacctcaaactcttgtattcc120agcatcttctgaatacgccgcaaggcaaaacaaatgaatcaaaactttcaacaacggatc180tcttggctctggcatcgatgaagaacgcagcgaaacgcgataagtaatgtgaattgcaga240atccagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagcattctggcgggcat300gcctgttcgagcgtcatttcaaccctcgacctccccttgggggggtcggcgttggggacc360ggcagcacaccgccggccctgaaatggagtggcggcccgtccgcggcgacctctgcgcag420taatacagctcgcaccggaaccccgacgcggccacgccgtaaaacacccaacttctgaac480gttgacctcgaatcaggtaggactacccgctgaacttaagcatatcaaaaggcggaggaa540<210>2<211>506<212>dna<213>beauveriabassianabbl25<400>2gggctcctgctcctgacgagcgtggtgcccactccttccgcgccgtctctgttcccgagc60tcactcagcagatgttcgaccctaagaacatgatggctgcttctgacttccgcaacggtc120gctacctgacctgctctgccattttgtaagttgattcaaacatgtactgattgacgcatc180aactaacaaccctttagccgtggtaaggttgccatgaaggaggttgaggaccagatgcgt240aatgtgcagaccaagaactccagctacttcgtcgagtggatccccaacaacatccagaac300gctctctgcgccgttcccccccgcggacttaagatgtcgtctaccttcattggtaactcg360acctctatccaggatctcttcaagcgtgtcggtgagcagttctccgccatgttccgtcgc420aaggctttccttcattggtacactggtgaaggtatggacgagatggagttcactgaggct480gagttcaacatgaagaatctcgtcaa506当前第1页12