一种检测BRAFV600E基因突变的试剂盒的制作方法

本发明涉及生物技术和基因工程领域，尤其涉及的是一种检测brafv600e基因突变的试剂盒及其检测方法。

背景技术：

raf基因是癌症基因的一类，raf家族中包括araf、braf、craf，其中braf基因突变常出现在癌变细胞中，如：黑色素瘤(>60％)和结直肠癌。在细胞增殖过程中，酪氨酸受体依次与ras家族蛋白激酶，raf丝氨酸-苏氨酸激酶，丝裂原活化蛋白激酶(map)连接，这一通路在癌症细胞中被频繁激活。map激酶，也被认为是细胞外信号调节蛋白激酶(erk)，在多个重要的生长因子信号传导中起到重要作用，如表皮生长因子(egf)。brafv600e突变蛋白在体外即可以激活人类黑色素瘤中的raf/mek/erk通路，同时也可以激活map通路。

皮肤黑色素瘤是最恶性的皮肤癌，每年全球发病约20万例，在未来的几年里还会继续增加，黑色素瘤中30％-60％存在braf基因突变。虽然brafv600e特异性抑制剂维罗非尼对brafv600e转移型黑色素瘤有显著的疗效，然而在用药8个月后，癌细胞就会对维罗非尼产生抗药作用。尽管黑色素瘤占所有类型皮肤癌的4％，但是死亡率却高达80％。存活率完全取决于所处的临床阶段，晚期和局部转移患者的5年生存率分别为15％和60％，所以及早检测确诊，对黑色素瘤患者的治疗至关重要。

目前已有的几种检测braf基因突变技术可分为筛选分析法和靶向分析法，筛选分析法能够在整个扩增区域内识别突变，靶向分析法能够特异性地扩增突变片段。在筛选分析法中，双向测序(sanger测序)和焦磷酸测序在临床中的应用最为广泛，特异等位基因pcr(taqman)法是最常见靶向分析法。所有的检测方法都经过分析灵敏度、特异性、检测限、成本和响应延迟等方面的验证。筛选分析法中的双向测序法的检测限为20％，焦磷酸测序法检测限为5％-10％，而以实时pcr为基础的靶向分析法的检测为1％或者更低。相比于其他类型的肿瘤，黑色素瘤中braf突变存在多种限制因素，高浓度黑色素会对pcr产生影响，也已经有研究报道其存在瘤内异质性。因此，需要开发新的检测方法解决存在的问题，避免假阳性和假阴性结果的产生。

taqmanpcr是一种基于taqman的特异性等位基因pcr，在pcr反应中突变特异等位基因引物(asp)与野生型特异等位基因阻滞子(asb)结合，利用阻滞分子完全抑制野生型等位基因片段的扩增，从而排除突变等位基因扩增的影响，提高特异性和灵敏度。双盲测试比较直接测序、单链构象分析(ssca)、高分辨熔炼分析(hrm)和cast-pcr，taqmanpcr显示出对braf突变检测的高灵敏度和速度。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有brafv600e突变检测技术中存在的不足，提供一种高效、快速、低检测限的检测brafv600e基因突变的试剂盒，本发明的另一目的在于提供一种检测brafv600e基因突变的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种检测brafv600e基因突变的试剂盒，包括一对brafv600e特异性引物(上游引物、下游引物)、一种检测brafv600e的taqman-mgb探针，其特征在于：所述的一对特异性引物和taqman-mgb探针分别是：

上游引物：5’-agggtttccactgtcaaaca-3’

下游引物：5’-tcatcactcgactcccgtct-3’

taqman探针：fam-5’-ccacagcccttccgaccagc-3’-mgb

优选的，所述的taqman探针的5’端包含有荧光报告基团fam，3’端包含有淬灭基团mgb。

优选的，所述试剂盒中还包括pcr缓冲液、taqdna聚合酶、mg²⁺、dntp混合物、rnasefreeh2o。

作为优选，所述taqdna聚合酶的浓度为0.05u/ul，mg2+浓度为4mm，dntp混合物浓度为0.4mm。

一种检测brafv600e基因突变的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)提取癌细胞的rna并反转录成cdna，稀释cdna浓度至10ng/ul；

2)荧光定量pcr最优反应体系为20ul，具体包括：10×pcrbuffer2ul，上游引物1ul，下游引物1ul，dntp混合物1.6ul，taqdna聚合酶0.4ul，taqman-mgb探针1ul，mg²⁺1.6ul,cdna模板1ul，rnasefreeh2o10.4ul；

3)放入荧光定量pcr仪中进行pcr扩增，pcr反应条件如下：

4)收集后40个循环的扩增数据，用mutationdetector^tmsoftwareversion2.0软件进行数据分析并计算样本的突变率。

优选的，步骤1)中cdna模板的稀释使用rnasefreeh2o作为溶剂。

优选的，所述pcr反应中用brafv600e突变片段作为阳性对照，rnasefreeh2o作为阴性对照。

本发明提供了检测brafv600e基因突变的试剂盒，具体包括：一对brafv600e特异性引物(上游引物、下游引物)、一种检测brafv600e的taqman-mgb探针、pcr缓冲液、taqdna聚合酶、mg²⁺、dntp混合物、rnasefreeh2o，本发明基于biorad平台采用荧光定量pcr仪，对taqman探针进行设计，该方法克服了传统pcr技术操作复杂，检测限高、准确度低的缺点，利用taqman探针提高了检测的特异性，taqman探针3’端的存在一个mgb淬灭基团，相比较与传统的淬灭基团，mgb提高了探针的tm值，使pcr扩增过程更稳定，结果更可靠；mgb是不发光的荧光基团，提高了荧光定量pcr的信噪比，从而提高了分辨率；从空间位置上看mbg更靠近报告基因，使结果的特异性和准确性得到提高。使用本发明试剂盒对brafv600e基因突变进行检测，大大地提高了检测效率和对癌症的诊断效率，精准的检测结果也为癌症诊断提供了有力的依据。

附图说明

图1为实施例2中，用引物对2作为特异性引物对阳性样本进行荧光定量pcr分析的结果；

图2为实施例3中，用引物对3作为特异性引物对阳性样本进行荧光定量pcr分析的结果。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

1)提取癌细胞的rna并反转录成cdna，稀释cdna浓度至10ng/μl；

2)荧光定量pcr反应体系为20ul，具体包括：10×pcrbuffer2μl，上游引物1μl，下游引物1μl，dntp混合物1.6μl，taqdna聚合酶0.4μl，mg²⁺1.6μl,cdna模板1μl，rnasefreeh2o10.4μl；

3)半定量pcr反应条件如下：

4)对pcr扩增产物进行凝胶电泳分析。

作为优选，最初设计出四组brafv600e特异性引物对：

上游引物1：5’-agaggcgtccttagcagaga-3’

下游引物1：5’-gacttctggtgccatccaca-3’

上游引物2：5’-agacgggactcgagtgatga-3’

下游引物2：5’-gacttctggtgccatccaca-3’

上游引物3：5’-agggtttccactgtcaaaca-3’

下游引物3：5’-tcatcactcgactcccgtct-3’

上游引物4：5’-agaggacagtggtacctgca-3’

下游引物4：5’-atcggtctcgttgcccaaat-3’

从凝胶电泳的分析结果中初步筛选出没有扩增出非特异性片段的引物对2和3，作为本发明试剂盒中的特异性引物。

实施例2

1)提取癌细胞的rna并反转录成cdna，用rnasefreeh2o稀释cdna浓度至10ng/μl，再对cdna分别进行1:5、1:10、1：25、1:50、1:100的稀释；

2)荧光定量pcr最优反应体系为20μl，具体包括：10×pcrbuffer2μl，上游引物21μl，下游引物21μl，dntp混合物1.6μl，taqdna聚合酶0.4μl，taqman-mgb探针1μl，mg²⁺1.6μl,cdna模板1μl，rnasefreeh2o10.4μl；

上游引物2：5’-agacgggactcgagtgatga-3’

下游引物2：5’-gacttctggtgccatccaca-3’

taqman探针2：fam-5’-agacgggactcgagtgatga-3’-mgb

3)放入荧光定量pcr仪中进行pcr扩增，pcr反应条件如下：

4)收集后40个循环的扩增数据，用mutationdetectortmsoftwareversion2.0软件进行数据分析。

实施例3

1)提取癌细胞的rna并反转录成cdna，用rnasefreeh2o稀释cdna浓度至10ng/μl，再对cdna分别进行1:5、1:10、1：25、1:50、1:100的稀释；

2)荧光定量pcr最优反应体系为20μl，具体包括：10×pcrbuffer2μl，上游引物31μl，下游引物31μl，dntp混合物1.6μl，taqdna聚合酶0.4μl，taqman-mgb探针1μl，mg²⁺1.6μl,cdna模板1μl，rnasefreeh2o10.4μl；

上游引物3：5’-agggtttccactgtcaaaca-3’

下游引物3：5’-tcatcactcgactcccgtct-3’

taqman探针3：fam-5’-ccacagcccttccgaccagc-3’-mgb

3)放入荧光定量pcr仪中进行pcr扩增，pcr反应条件如下：

4)收集后40个循环的扩增数据，用mutationdetectortmsoftwareversion2.0软件进行数据分析。

参照附图1和图2，从附图2中可以看出引物组3在低浓度样本中达到阈值的循环数更少，即ct值更低，且从重复性方面分析，引物组2(附图1)在样本浓度较高时重复性稍强于引物组3，但是低浓度是引物对2重复性更好，综合以上结果，本发明将优选用引物组3作为试剂盒中的扩增特异性引物和探针引物。

上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。