一株高蛋白酶解活力植物乳杆菌PE‑28株及利用该菌株制备人参肽的方法与流程

本发明涉及微生物
技术领域：
，具体涉及一株高蛋白酶解活力植物乳杆菌pe-28株及利用该菌株制备人参肽的方法。
背景技术：
：生物活性肽(bioacti)根据肽链长度，分为二肽、小分子肽和多肽，肽除具有营养功能以外，还有广泛的生理调节功能，如降血压、阿片样活性、抗血栓、促进免疫以及促进营养物质的消化吸收等。生物活性肽不仅具有广泛的活性和多样性，而且具有来源丰富、成本低、安全性好、易于工业化生产的优点。近年来，随着对生物活性肽的作用机制、生理效果以及制备方法的深入研究，人们已经从各种乳蛋白、大豆蛋白、玉米蛋白、鱼贝类蛋白、胶原蛋白等食物蛋白的酶解产物或发酵制品中分离得到了多种生物活性肽。一些生物活性肽已经作为健康食品、功能食品和药物实现了工业化生产，并取得巨大的经济效益，生物活性肽应用开发前景广阔。目前，对活性肽的研究日益活跃，市场上活性肽的种类和数量不断增加。活性肽的制备主要包括蛋白酶酶解、基因工程、化学合成和微生物发酵等方法。使用食品级微生物发酵酶解活性肽制备技术，例如乳酸菌发酵乳蛋白制备降压肽、抗氧化肽等。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种利用乳杆菌发酵酶解技术制备功能性生物活性肽的新方法，基于此，本发明提供一株高蛋白酶解活力植物乳杆菌pe-28株及利用该菌株制备人参肽的方法。本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：本发明的一株高蛋白酶解活力植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株，已于2017年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctccno:m2017087。本发明还提供了采用上述的一株高蛋白酶解活力植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株制备人参肽的方法，该方法包括以下步骤：步骤一、将干人参根粉碎，用60％乙醇溶液回流提取两次，过滤后滤渣用80～100℃热水提取两次，每次提取0.5～1.5h，过滤后合并滤液，经浓缩、离心后上清液加入固体(nh4)2so4进行沉淀，4℃静置过夜，再经离心、透析、冻干工艺获得人参总蛋白冻干粉；步骤二、将人参总蛋白冻干粉制成人参蛋白培养基，将植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株接种于人参蛋白培养基中，所述植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株的接种量是人参蛋白培养基体积的3％，37℃静置培养15～25h，经离心、浓缩、冻干工艺获得人参肽。作为优选的实施例，步骤一，将干人参根粉碎至30目。作为优选的实施例，步骤一，所述干人参根选取5年以下通过栽培获得的干人参的根。作为优选的实施例，步骤一，所述热水温度为80℃。作为优选的实施例，步骤一，所述(nh4)2so4浓度为70％。作为优选的实施例，步骤二中，所述人参蛋白培养基的制备过程如下：称取人参总蛋白冻干粉25g，葡萄糖20g，加水配制成1000ml溶液，115℃灭菌20min，获得人参蛋白培养基。作为优选的实施例，步骤二中，离心的条件为：6000rpm，10min，4℃。利用上述的制备方法获得的人参肽。本发明的一株高蛋白酶解活力植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株在制备食品、保健品、药品中的应用。本发明的有益效果是：本发明的创新点在于提供一株具有高蛋白酶解活力的乳酸菌新菌株-植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株，以及利用该植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株发酵酶解人参蛋白制备功能性人参肽的方法，为微生物发酵酶解制备生物活性肽提供了一条新途径。本发明提供的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株及其发酵酶解制备的人参肽产品都可以作为功能性益生菌和功能性原料应用于食品、保健品和药品等领域，所获得的小分子生物活性人参肽具有显著的提高免疫力和抗疲劳作用。附图说明图1为硫酸铵分级沉淀人参总蛋白的sds-page电泳图谱。图2为利用本发明的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株制备的人参总蛋白hplc分析图谱。图3为利用本发明的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株制备的人参肽hplc分析图谱。具体实施方式本发明是经广泛筛选获得的一株具有高蛋白酶解活力的乳酸菌新菌株-植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株，并以人参蛋白为底物，利用植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株发酵酶解制备小分子生物活性人参肽，该小分子生物活性人参肽具有显著的提高免疫力和抗疲劳作用，是开发健康食品和保健食品重要的功能因子。本发明的一株高蛋白酶解活力植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株，已于2017年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称cctcc，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学保藏中心)，保藏编号为：cctccno:m2017087。本发明的一株高蛋白酶解活力植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株，是采用东北发酵酸菜经反复培养纯化得到的，20％甘油、-80℃保存备用。本发明的一株高蛋白酶解活力植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株经多种试验鉴定，革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性、吲哚试验阴性、产硫化氢试验阴性、明胶液化试验阴性、水解淀粉试验阴性和硝酸盐还原试验阴性。本发明的一株高蛋白酶解活力植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株的生理生化特性如下：革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，联苯胺试验阴性，吲哚试验阴性，乙酰甲基甲醇试验阳性；不运动的杆菌；最适生长温度为37～42℃，适宜ph为5.0～7.0；在15℃和45℃能够生长；耐受6.5％nacl；不水解淀粉，不液化明胶，不产生硫化氢；发酵葡萄糖产酸不产气；在液体mrs培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。本发明的一株高蛋白酶解活力植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株的api50ch(法国梅里埃公司)鉴定结果如下：能利用核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、苦杏仁苷、熊果苷、n-乙酰-葡萄糖胺、七叶醇、柳醇、纤维二糖、菊糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖、棉籽糖、牻牛儿糖、葡萄糖酸盐；不能利用阿东醇、阿拉伯糖、糖原、卫矛醇、麦芽糖、肌醇、α-甲基-d-葡萄糖苷、α-甲基-d-甘露糖苷、淀粉、鼠李糖、木糖醇、d-松二糖、d-塔格糖、d-米苏糖、葡萄糖酸盐、d-阿拉伯糖醇、岩糖、l-阿拉伯糖醇、2-酮基-葡萄糖酸盐、5-酮基-葡萄糖酸盐。本发明的菌株pe-28经16srdna序列同源性分析可以确定为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)。本发明的一株高蛋白酶解活力植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株可以作为一种活性成分在制备产品中的应用。所说的产品可以为利用植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株、其发酵物或者其发酵物提取物制作而成的食品、保健品或药品等。利用本发明的一株高蛋白酶解活力植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株发酵酶解制备人参肽的方法，包括以下步骤：步骤一、将干人参根粉碎，用60％乙醇溶液回流提取两次，过滤后滤渣用80～100℃热水提取两次，每次提取0.5～1.5h，过滤后合并滤液，经浓缩、离心后上清液加入固体(nh4)2so4进行沉淀，4℃静置过夜，再经离心、透析、冻干工艺获得人参总蛋白冻干粉；步骤二、将人参总蛋白冻干粉制成人参蛋白培养基，将植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株接种于人参蛋白培养基中，所述植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株的接种量是人参蛋白培养基体积的3％，37℃静置培养15～25h，经离心、浓缩、冻干工艺获得人参肽。以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。以下实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均通过常规生化试剂商店购买得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。固体bcp培养基：溶剂为水，含酵母膏2.5g/l、蛋白胨5g/l、葡萄糖5g/l、溴甲酚紫0.04g/l、琼脂15g/l，ph为7.0。液体bcp培养基与固体bcp培养基的区别仅在于不加入琼脂。固体mrs培养基：溶剂为水，含蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、酵母膏5g/l、kh2po42g/l、乙酸钠5g/l、柠檬酸钠5g/l、mgso4·7h2o0.2g/l、mnso4·4h2o0.05g/l、吐温-801ml/l、琼脂15g/l、葡萄糖20g/l，ph为6.6。液体mrs培养基与固体mrs培养基的区别仅在于不加入琼脂。实施例1本发明的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株的制备一、菌株的分离1、样本取材：东北发酵酸菜。取东北发酵酸菜5g，固体用研钵研碎呈糊状，加入45ml生理盐水(为10倍稀释)，混匀取0.5ml稀释液，再次用生理盐水进行倍比稀释至10-3，取100ul液体(10-1、10-2、10-3)涂布于固体bcp培养基中进行培养(37℃，48～72h)。挑取产黄圈的单菌落接种于固体mrs培养基平板上继续培养(37℃，48h)，经固体mrs培养基平板反复划线培养纯化(37℃，48h)，得到多株纯培养菌种。2、将上述获得的多株纯培养的菌种分别接种于液体mrs培养基中培养(37℃，14～18h)，然后加入20％甘油，置于-80℃冰箱中保存。3、经革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性、吲哚试验阴性、产硫化氢试验阴性、明胶液化试验阴性、水解淀粉试验阴性和硝酸盐还原试验阴性从多株纯培养的菌种中筛选出多株植物乳杆菌，选取其中的1株命名为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株。二、菌株的鉴定1、本发明的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株的生理生化鉴定结果如下：革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，联苯胺试验阴性，吲哚试验阴性，乙酰甲基甲醇试验阳性；不运动的杆菌；最适生长温度为37～42℃，适宜ph为5.0～7.0；在15℃和45℃能够生长；耐受6.5％nacl；不水解淀粉，不液化明胶，不产生硫化氢；发酵葡萄糖产酸不产气；在液体mrs培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。2、本发明的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株的api50ch(法国梅里埃公司)鉴定结果如下：能利用核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、苦杏仁苷、熊果苷、n-乙酰-葡萄糖胺、七叶醇、柳醇、纤维二糖、菊糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖、棉籽糖、牻牛儿糖、葡萄糖酸盐；不能利用阿东醇、阿拉伯糖、糖原、卫矛醇、麦芽糖、肌醇、α-甲基-d-葡萄糖苷、α-甲基-d-甘露糖苷、淀粉、鼠李糖、木糖醇、d-松二糖、d-塔格糖、d-米苏糖、葡萄糖酸盐、d-阿拉伯糖醇、岩糖、l-阿拉伯糖醇、2-酮基-葡萄糖酸盐、5-酮基-葡萄糖酸盐。3、16srdna序列同源性分析(1)ctab法提取菌株基因组dna将分离的多株植物乳杆菌接种于液体mrs培养基中，37℃培养16h，取10ml培养液，10000r/min离心10min，离心后弃去上清液，用te缓冲液清洗菌体1次；将清洗后的菌体重悬浮于1.9ml的te缓冲液中，加入0.1ml质量分数为10％的sds溶液、10μl浓度为20mg/ml的蛋白酶k、5μl浓度为50mg/ml的溶菌酶，混匀后在37℃的水浴锅中水浴1h；水浴后，向体系中加入300μl5m的nacl溶液和300μl质量分数为10％的ctab-nacl溶液，混匀后在65℃的水浴锅中水浴20min；水浴后，向体系中加入等体积的氯仿-异戊醇溶液(氯仿溶液与异戊醇溶液的体积比为24:1)，充分混匀后10000r/min离心30min；吸取上清液至新的离心管中，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇溶液(酚溶液、氯仿溶液、异戊醇溶液的体积比为25:24:1)，充分混匀后10000r/min离心30min；吸取上清液至新的离心管中，加入0.6倍体积的异戊醇溶液，在-20℃的条件下放置2h，然后10000r/min离心20min，弃去上清液；用体积分数为70％的乙醇溶液清洗沉淀，然后10000r/min离心20min，在室温条件下放置至乙醇完全控干；将沉淀溶于20μlte缓冲液中，加入1μl的rna酶并在37℃的水浴锅中水浴1h，获得菌株基因组dna，置于-20℃保存。(2)pcr扩增①扩增引物：根据乳酸菌的16srdna序列的保守区域，采用jung-hoonyoon等人设计的引物，其序列如下：16sf：5＇-agagtttgatcctggctcag-3＇；16sr：5＇-agaaaggaggtgatccagc-3＇。②pcr反应体系如表1所示：表1体系组分反应体系takaraextaq(5u/μl)0.25μl10×extaqbuffer(mg2+plus)5μl5μldntpmixture(各2.5mmol/l)4μl基因组dna1μl正向引物(10μmol/l)1μl反向引物(10μmol/l)1μl灭菌双馏水37.75μl总体积50μl③pcr扩增程序如下：④检测pcr扩增产物预先制备质量分数为1％的琼脂糖凝胶(加入10mg/ml的溴化乙锭eb)，pcr扩增结束后，吸取5μlpcr扩增产物和1μl的6×loadingbuffer混合均匀，用移液器加入到琼脂糖凝胶板的点样孔中进行电泳。目标片段长度约为1500bp，使用dl2000的dnamarker，以1×tae作为电泳液，电泳电压为100v，电泳时间为40min。(3)分析将验纯后的pcr扩增产物送到上海生工进行测序；获得各菌株的16srdna序列通过blast程序与genbank库中已知菌株的序列信息进行同源性比对分析，鉴定待测菌株；以16srdna序列同源性大于99％为标准进行属种归类，然后再将待测菌株与模式菌株的16srdna序列利用mega4.0软件中的neighbor-joining法构建系统发育树。16srdna序列如序列表中的seqidno:1所示。基于上述分析结果可以确定，本发明的菌株pe-28为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)。4、菌株的保藏本发明的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株，已于2017年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称cctcc，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学保藏中心)，保藏编号为：cctccno:m2017087。实施例2植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株的蛋白酶活力分析采用邻苯二甲醛法筛选评价菌株的蛋白酶活力，邻苯二甲醛法是一种得到广泛认可的蛋白酶水解活性测定方法。其原理是通过邻苯二甲醛与β-巯基乙醇发生水解反应，释放出α-氨基酸，在紫外波长340nm处有强吸收峰，通过测定α-氨基酸含量来反映乳酸菌的蛋白水解能力大小。其具体步骤如下：(1)试剂配制100μg/ml酪氨酸溶液的配制：将酪氨酸在105℃烘箱中烘至恒重，精确称取恒重的酪氨酸0.1000g，逐步加入6ml、1mol/l的盐酸使其溶解，用0.2mol/l盐酸定容至100ml，此时酪氨酸溶液浓度为1000μg/ml，再吸取此溶液10ml，以0.2mol/l盐酸定容至100ml，即配制成浓度为100μg/ml的酪氨酸溶液，此溶液配成后应及时使用或及时放入冰箱中保存。opa试剂的配制：将62.5ml、0.1m的四硼酸钠溶液，6.25ml、20％sds溶液，100mg邻苯二甲醛，5ml甲醇溶液，250μlβ-巯基乙醇溶液混合，定容至250ml，即配制成opa试剂，opa试剂需现用现配，并避光保存。(2)标准曲线的测定分别量取0、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml的酪氨酸溶液(浓度为100μg/ml)，用ddh2o将溶液补至5ml，混合均匀，备用；取150μl不同浓度的酪氨酸溶液，加入3mlopa试剂，轻轻震荡均匀，室温反应2min，测定od340值；以酪氨酸浓度为横坐标、od340值为纵坐标制作标准曲线：y＝0.0146x+0.0021(r2＝1)。(3)样品测定将本发明的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株按3％(v/v)的量接种于11％脱脂乳中，37℃培养24h；取1.25ml菌液，加入0.3mlddh2o，3ml、0.75m三氯乙酸，混合均匀后，室温静止10min；6000r/min、4℃离心6min，取上清备用；取150μl上清，加入3mlopa试剂，轻轻震荡，室温条件静止反应2min，于波长340nm处测定溶液的吸光度；得到的od340值与标准曲线相对照，得到的蛋白酶水解活性相当于酪氨酸的量，也可直接以od340值作对比。由表2的结果可以看出，本发明的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株的蛋白酶水解活性高于其他测试菌株(nc305、dm-12、nc301)，游离氨基酸含量可达到137.48μg/ml。表2高蛋白水解活性菌株复筛结果菌株游离氨基酸含量(μg/ml)pe-28137.48nc30510.04dm-120.97nc30156.74实施例3利用本发明的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株发酵酶解制备人参肽1、人参总蛋白的提取选材：5年以下通过栽培获得的干人参的根。称取5年以下栽培干人参的根2000g，粉碎至30目，加入10～30倍量(干人参的根与60％乙醇溶液的重量比为1:10-30)的60％乙醇溶液回流提取2次，过滤，滤渣用10～30倍量(滤渣与80℃热水的重量比为1:10-30)的80℃热水煮沸提取2次，每次1h，过滤，合并滤液，取滤液1l浓缩至100ml，离心(4000rpm，10min，4℃)，上清液加入固体(nh4)2so4进行沉淀，(nh4)2so4浓度为70％(硫酸铵的质量百分含量g/100g)，4℃静置过夜，经离心(5000rpm，30min，4℃)、透析(6000～8000da)、冻干得人参总蛋白冻干粉。2、人参肽的制备培养基的制备：称取人参总蛋白冻干粉25g，葡萄糖20g，加水配制成1000ml溶液，115℃灭菌20min，获得人参蛋白培养基；发酵：按人参蛋白培养基体积分数3％接入本发明的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株，37℃静置培养20h，经离心(6000rpm，10min，4℃)、上清浓缩、冻干得人参肽。3、人参总蛋白的sds-page电泳分析和人参肽的分析采用硫酸铵分级沉淀试验对人参总蛋白进行sds-page电泳，其结果如图1所示。4、人参总蛋白和人参肽的高效液相色谱(hplc)分析将上述获得的人参总蛋白于5000rpm、4℃条件下离心10min，离心后的上清液过0.22μm微孔滤膜进行hplc检测，以表3流动相比例梯度洗脱；检测波长：280nm，柱温：50℃，流速：0.5ml/min，色谱柱：zorbax300sb-c18，其hplc图谱如图2所示。同理，将上述获得的人参肽发酵液于5000rpm、4℃条件下离心10min，离心后的上清液过0.22μm微孔滤膜进行hplc检测，以表3流动相比例梯度洗脱；检测波长：280nm，柱温：50℃，流速：0.5ml/min，色谱柱：zorbax300sb-c18，其hplc图谱如图3所示。结果表明：通过比较利用本发明的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株发酵酶解制备的人参总蛋白hplc图谱(图2)与人参肽hplc图谱(图3)可知，所制得的人参肽在不同保留时间出现不同的小分子肽峰：1.57/1.75/2.19/3.32/4.51/5.25/6.22/7.44。表3梯度洗脱(min)0.1％三氟乙酸0.01％三氟乙酸+80％乙睛0.009821.009828.8055459.0059515.0059515.2098225.00982本发明公开了一株高蛋白酶解活力植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pe-28株，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。sequencelisting<110>吉林省命之元生物科技有限公司<120>一株高蛋白酶解活力植物乳杆菌pe-28株及利用该菌株制备人参肽的方法<160>1<210>1<211>1472<212>dna<213>人工<400>1acttcaccctaatcatctgtcccaccttaggcggctggttcctaaaaggttaccccaccg60actttgggtgttacaaactctcatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgt120attcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccgacttcatgtaggcgagttg180cagcctacaatccgaactgagaatggctttaagagattagcttactctcgcgagttcgca240actcgttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatt300tgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtctcaccagagtgcccaactt360aatgctggcaactgataataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacg420acacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtatccatgtccccgaagggaacgtctaat480ctcttagatttgcatagtatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgtagcttcgaattaa540accacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagccttgcgg600ccgtactccccaggcggaatgcttaatgcgttagctgcagcactgaagggcggaaaccct660ccaacacttagcattcatcgtttacggtatggactaccagggtatctaatcctgtttgct720acccatactttcgagcctcagcgtcagttacagaccagacagccgccttcgccactggtg780ttcttccatatatctacgcatttcaccgctacacatggagttccactgtcctcttctgca840ctcaagtttcccagtttccgatgcacttcttcggttgagccgaaggctttcacatcagac900ttaaaaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaatccggacaacgcttgccacctac960gtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgaggctttctggttaaataccgtcaata1020cctgaacagttactctcagatatgttcttctttaacaacagagttttacgagccgaaacc1080cttcttcactcacgcggcgttgctccatcagactttcgtccattgtggaagattccctac1140tgctgcctcccgtaggagtttgggccgtgtctcagtcccaatgtggccgattaccctctc1200aggtcggctacgtatcattgccatggtgagccgttaccccaccatctagctaatacgccg1260cgggaccatccaaaagtgatagccgaagccatctttcaaactcggaccatgcggtccaag1320ttgttatgcggtattagcatctgtttccaggtgttatcccccgcttctgggcaggtttcc1380cacgtgttactcaccagttcgccactcactcaaatgtaaatcatgatgcaagcaccaatc1440aataccagagttcgttcgacttgcatgatagc1472当前第1页12