本发明涉及生物制剂的技术领域，尤其涉及一种从海洋球石藻中提取叶绿醇的方法。
背景技术：
海洋球石藻(coccolithophores)是一类单细胞海洋微型浮游植物，隶属于定鞭藻门(haptophyta＝prymnesiophyta)定鞭藻纲(prymnesiophyceae)。海洋球石藻代谢产物中富含多种生物活性物质，如二十二碳六烯酸(dha)、聚酮类化合物等，尤其是海洋微藻细胞中总脂含量最高可达细胞干重的50％，这些化合物具有良好的抑菌、抗氧化、抗肿瘤等生物功能，在生物技术领域具有广阔的应用前景。但目前有关海洋球石藻脂类活性物质领域的研究较少。
有鉴于此，本发明人研究和设计了一种从海洋球石藻中提取叶绿醇的方法，本案由此产生。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种从海洋球石藻中提取叶绿醇的方法，旨在通过薄层层析法、硅胶柱层析法、凝胶柱层析法、制备型薄层ptlc等方法对海洋球石藻乙酸乙酯相提取物的叶绿醇进行分离、纯化，以便于后续大规模化生产叶绿醇。
为了解决上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种从海洋球石藻中提取叶绿醇的方法,依次以：用乙酸乙酯进行萃取；用反相硅胶柱进行一次层析；用反相硅胶柱进行二次层析；用葡聚糖凝胶柱sephadexlh-20进行层析；用正相硅胶柱进行层析；用ptlc制备的方法从海洋球石藻中提取叶绿醇。
作为实施例的优选方式，上述提取叶绿醇的方法具体包括以下步骤：
步骤一、制备海洋球石藻乙酸乙酯相萃取物：先用乙醇溶液浸提，获得乙醇浸膏，再以乙酸乙酯为萃取剂进行萃取处理，合并萃取液，减压浓缩得到海洋球石藻乙酸乙酯相萃取物；
作为实施例的优选方式，海洋球石藻生长至稳定期，收获，冷冻干燥获得海洋球石藻藻粉，用质量分数为75％的乙醇溶液浸提，获得乙醇浸膏，加入等体积的乙酸乙酯和水，反复萃取，收集乙酸乙酯相，合并、减压浓缩至干，获得海洋球石藻乙酸乙酯相萃取物；
步骤二、反相硅胶柱层析制备叶绿醇一次粗品：将获得的海洋球石藻乙酸乙酯相萃取物以反相硅胶柱进行层析处理，收集，检测、合并、减压浓缩至干，得到叶绿醇一次粗品；
作为实施例的优选方式，将海洋球石藻乙酸乙酯相萃取物用适量的分析纯甲醇溶解，加入量以甲醇正好没过萃取物为宜，进行反相硅胶柱层析；依次用水，质量分数为25％的甲醇溶液，质量分数为50％的甲醇溶液，质量分数为75％的甲醇溶液，甲醇洗脱，每个梯度洗脱1.5l，流速控制为30ml/min，每200ml收集1管，旋蒸，初步用tlc分析流出物，合并叶绿醇高浓度流分段，减压浓缩至干，获得叶绿醇一次粗品；
步骤三、反相硅胶柱层析制备叶绿醇二次粗品：将获得的叶绿醇一次粗品以反相硅胶柱进行层析处理，收集，检测、合并、减压浓缩至干，得到叶绿醇二次粗品；
作为实施例的优选方式，将叶绿醇一次粗品，依次采用质量体积分数为65％，70％，75％，80％，85％的甲醇溶液梯度进行反相硅胶柱层析，每个梯度洗脱300ml，流速控制为30ml/min，每200ml收集1管，旋蒸，初步用tlc分析流出物，合并叶绿醇高浓度流分段，减压浓缩至干，获得叶绿醇二次粗品；
步骤四、葡聚糖凝胶柱sephadexlh-20层析制备叶绿醇一次精品：将获得的叶绿醇二次粗品以葡聚糖凝胶柱sephadexlh-20进行层析处理，收集，检测、合并、减压浓缩至干，得到叶绿醇一次精品；
作为实施例的优选方式，将叶绿醇二次粗品用适量甲醇溶解后，上葡聚糖凝胶柱sephadexlh-20，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，流速控制8s/drop，使用自动收集器收集各馏分，每30min收集一管，初步用tlc分析流出物，合并142至167管的馏分，减压浓缩至干，获得叶绿醇一次精品；
步骤五、正相硅胶柱层析制备叶绿醇二次精品：将获得的叶绿醇一次精品以正相硅胶柱进行层析处理，收集，检测、合并、减压浓缩至干，得到叶绿醇二次精品；
作为实施例的优选方式，将叶绿醇一次精品经过正相硅胶柱层析，用硅胶粉拌样，硅胶用石油醚饱和后装柱，样品上柱后用正己烷乙醚的体系进行洗脱，所述正己烷和乙醚的体积比为9:1，收集馏分，合并9-15管，减压浓缩至干，获得叶绿醇二次精品；
步骤六、ptlc制备叶绿醇：将获得的叶绿醇二次精品进行ptlc，点样、展开，刮板，样品回收，保存于-20℃，得到叶绿醇纯品；
作为实施例的优选方式，将叶绿醇二次精品经过ptlc，最终得到叶绿醇：采用高效薄层层析板，在体积比为：石油醚：乙酸乙酯＝8：1的展开剂中展开，前后两端显色，用刀片刮取中间部分，合并，用甲醇溶解，高速离心，收集上清液，减压浓缩至干，最终得到叶绿醇。
一种叶绿醇在制备肝癌抑药剂中的应用。
由于本发明系统采用了上述的技术方案，使得本实用性具有以下有益效果：本发明首次采用薄层层析法、硅胶柱层析法、凝胶柱层析法、制备型薄层等方法对海洋球石藻乙酸乙酯相提取物的叶绿醇进行了分离、纯化，以便为后续大规模生产叶绿醇奠定基础。
附图说明
图1为本发明叶绿醇tlc的图。
具体实施方式
实施例1一种从海洋球石藻中提取叶绿醇的方法
本发明揭示了一种从海洋球石藻中提取叶绿醇的方法,依次以：用乙酸乙酯进行萃取；用反相硅胶柱进行一次层析；用反相硅胶柱进行二次层析；用葡聚糖凝胶柱sephadexlh-20进行层析；用正相硅胶柱进行层析；用ptlc制备的方法从海洋球石藻中提取叶绿醇。
作为实施例的优选方式，上述提取叶绿醇的方法具体包括以下步骤：
步骤一、制备海洋球石藻乙酸乙酯相萃取物：先用乙醇溶液浸提，获得乙醇浸膏，再以乙酸乙酯为萃取剂进行萃取处理，合并萃取液，减压浓缩得到海洋球石藻乙酸乙酯相萃取物；
收获处于稳定期的海洋球石藻藻粉19.3740g，用质量分数为75％的乙醇浸提，获得乙醇浸膏5.1247g，加入等体积的乙酸乙酯和水，反复萃取，收集乙酸乙酯相，合并、减压浓缩至干，获得海洋球石藻乙酸乙酯相萃取物4.2357g；
步骤二、反相硅胶柱层析制备叶绿醇一次粗品：将获得的海洋球石藻乙酸乙酯相萃取物以反相硅胶柱进行层析处理，收集，检测、合并、减压浓缩至干，得到叶绿醇一次粗品；
将4.2357g海洋球石藻乙酸乙酯相萃取物用适量的分析纯甲醇溶解后，进行反相硅胶(180g)柱层析；依次用水，质量分数为25％的甲醇溶液，质量分数为50％的甲醇溶液，质量分数为75％的甲醇溶液，甲醇洗脱，每个梯度洗脱1.5l，流速控制为30ml/min，每200ml收集1管，旋蒸，初步用tlc分析流出物，结果如图1所示，合并叶绿醇高浓度流分段，减压浓缩至干，获得叶绿醇一次粗品；
步骤三、反相硅胶柱层析制备叶绿醇二次粗品：将获得的叶绿醇一次粗品以反相硅胶柱进行层析处理，收集，检测、合并、减压浓缩至干，得到叶绿醇二次粗品；
将叶绿醇一次粗品，依次采用质量分数为65％，70％，75％，80％，85％的甲醇溶液梯度进行反相硅胶柱层析，每个梯度洗脱300ml，流速控制为30ml/min，每200ml收集1管，旋蒸，初步用tlc分析流出物，合并叶绿醇高浓度流分段，减压浓缩至干，获得叶绿醇二次粗品；
步骤四、葡聚糖凝胶柱sephadexlh-20层析制备叶绿醇一次精品：将获得的叶绿醇二次粗品以葡聚糖凝胶柱sephadexlh-20进行层析处理，收集，检测、合并、减压浓缩至干，得到叶绿醇一次精品；
将叶绿醇二次粗品用适量甲醇溶解后，上葡聚糖凝胶柱sephadexlh-20，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，流速控制8s/drop，使用自动收集器收集各馏分，每30min收集一管，初步用tlc分析流出物，合并142至167管的馏分，减压浓缩至干，获得叶绿醇一次精品；
步骤五、正相硅胶柱层析制备叶绿醇二次精品：将获得的叶绿醇一次精品以正相硅胶柱进行层析处理，收集，检测、合并、减压浓缩至干，得到叶绿醇二次精品；
将叶绿醇一次精品经过正相硅胶柱层析，用硅胶粉拌样，硅胶用石油醚饱和后装柱，样品上柱后用正己烷乙醚的体系进行洗脱，所述正己烷和乙醚的体积比为9:1，收集馏分，合并9-15管，减压浓缩至干，获得叶绿醇二次精品；
步骤六、ptlc制备叶绿醇纯品：将获得的叶绿醇二次精品进行ptlc，点样、展开，刮板，样品回收，保存于-20℃，得到叶绿醇纯品；
将叶绿醇二次精品经过ptlc，最终得到叶绿醇；采用高效薄层层析板，在体积比为：石油醚：乙酸乙酯＝8：1的展开剂中展开，前后两端显色，用刀片刮取中间部分，合并，用甲醇溶解，高速离心，收集上清液，减压浓缩至干，最终得到叶绿醇。
实施例2细胞毒活性实验
a.细胞冻存：
配制10％dmso小牛血清冻存液；取对数期生长的lo2、hepg2细胞，用胰蛋白酶消化单层生长细胞；1000rpm离心5min；移除上清，加入新的冻存液；分装于冻存管中，标好名称、时间；将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中过夜，迅速取出冻存管，移入液氮中冻存。
b.细胞复苏：
从液氮中取出细胞冻存管，37℃水浴中迅速解冻，控制这个过程在1分钟之内；吸出细胞悬浮液至离心管中并加入10倍培养基，轻轻混匀；1000rpm离心5min；倒掉上清液，重复洗一次，血球计数板计数，静置co2培养箱37℃培养；次日更换培养基继续培养。
c.mtt法检测细胞活力：
本实验所选的肿瘤细胞为肝癌细胞系hepg2和正常肝细胞lo2。用胰酶消化对数生长期的肿瘤细胞，加入新鲜培养液后用血球计数板计数，调整好细胞浓度后接种于96孔板，置于37℃co2培养箱内培养24h。将6种单体化合物配制成浓度为10mg/ml的药液，每个浓度三个平行实验，以顺铂为阳性对照。每孔中加入20μlmtt溶液，37℃培养4h。去除上清，每孔加入dmso150μl。37℃摇床培养2小时，在酶标仪490nm处测定光密度(od490)值，计算抑制率。
抑制率％＝(1-实验组平均od值/对照组平均od值)×100％
表3叶绿醇对lo2(正常)和hepg2(肝癌)细胞的抑制率
细胞毒活性实验表明，叶绿醇对hepg2肝癌细胞的抑制效果较强，高达67.60％。
叶绿醇也称植物醇，是植物叶绿素的一个组成部分，其基本结构是由四个异戊二烯单位组成的双萜。本研究中细胞毒活性实验结果表明源自e.huxleyi的叶绿醇对于肝癌细胞hepg2有较强的抑制作用，抑制率可达到67.6％，经过进一步的深入研究有望作为肝癌治疗的有效制剂。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。