一种稷平脐蠕孢菌菌株、其筛选方法及其用途与流程

本发明属于微生物应用于农业植物保护、防除农作物杂草的技术领域，具体涉及一种稷平脐蠕孢菌菌株bipolarispanici-miliacei(y.nisik.)shoemaker(sx-5-2)、其筛选方法及其用途。

背景技术：

我国是一个拥有14亿人口的农业大国，然而我国的粮食产量还需要以来外国进口来补充，化学农药的大量使用以及作物田杂草的频繁发生严重制约着现代农业的发展。我国农田杂草共有255种，其中大面积发生的约有10种，而这10种中禾本科杂草占40％。牛筋草、狗尾草、稗草、千金子、狗牙根、假俭草、马唐、看麦娘、菵草、早熟禾等是我国重要的农田禾本科杂草，由于其种子的休眠性，早熟性及与作物的共生性，以及其强大的分蘖能力和结实性，收割机割跨区作业都为禾本科杂草的传播提供了良好的条件。纵观中国的农田杂草，具有种类繁多、发生量大、难以防除的特点，而对于禾本科杂草的防除方法也集中于人工除草、机械除草、化学防治等方面。随着人类保护环境和生物多样性意识的提高，特别是在大力倡导可持续发展的今天，农药对农田生态环境和农业生产的危害，已引起世界各国的普遍关注，因而研制生物除草剂成为对抗这些禾本科杂草的新途径。而国内现在尚无有效的生物除草剂来针对这些禾本科杂草，显然将该菌株开发成为生物除草剂会有极为显著的经济和社会效益。

柔枝莠竹(microstegiumvimineum(trin.)a.camus)原产于亚洲，在中国分布于安徽、福建、广东、广西、贵州、河南、湖北、湖南、江苏、江西、四川、山东、台湾、云南、西藏和浙江省，其生存和生长跨越各种各样的环境条件，主要发生在潮湿，阴暗的地区，如森林边缘，潮湿的草原，旷野，湿地，作物田边缘，沟渠，树篱和峡谷，也偶尔发生在花园和农田，会形成高密度、几近单一的植物群落，一种在森林环境中长势茂盛的独特的c4一年生杂草。自1919年在美国田纳西州第一次发现柔枝莠竹，它目前散布在整个美国东南部，其侵入森林下层和挤出原生植被的能力使得柔枝莠竹已经成为美国严重的外来入侵植物。它对森林水文，碳储存和营养循环以及对植物群落组成和功能都有负面影响，在经历建立新种群，杂交，以及对新环境的适应和其它过程后其基因发生改变，导致原产地和入侵地柔枝莠竹生长和形态特征之间的重大遗传差异，增加了柔枝莠竹的活力和适应性，再加上菌根刺激分枝和气生根的形成，使其入侵更为严重。

目前商业化的生物除草剂有80年代出研制的devine和collego以及90年代末推出的camperico和biochon，这些除草剂在控制相应的目标杂草上起到了重要作用，甚至是唯一的选择。如devine的持效性可以保证使用一次，2～3年无需再除草。在已被研究的候选生防真菌又相对集中在如下几个属：炭疽菌属(colletotrichum)有18种，镰刀菌属(fusarium)13种，链格孢菌属(alternaria)12种和尾孢菌属(cercospora)8种，柄锈菌属(puccinia)，核盘菌属(sclerotinia)，叶黑粉菌属(entyloma)，壳单胞菌属(ascochyta)。目前成功用于作物生产并申请专利的主要有炭疽菌属(colletotrichumspecies)(us3,849,104和us3,999,973)；镰刀菌属(fusariumspecies)(us4,419,120)；链格孢属(alternariaspecies)(us4,390,360)；壳单孢菌属(ascochytaspecies)(us4,915,724)以及核盘菌属(selerotiniaspecies)(caoz,292,233)；小菌核菌属(sclerotiumrolfsii)(sc64)等。目前国内对于平脐蠕孢属已有狗尾草平脐蠕孢和玉蜀黍平脐蠕孢用于生物除草剂的专利，没有稷平脐蠕孢菌的申报，也没有其运用在作物田禾本科杂草和草坪杂草以及柔枝莠竹及其近缘种的生物防除。

技术实现要素：

本发明的目的是针对水稻、小麦、高粱、大豆、棉花、蔬菜作物田的禾本科杂草马唐、牛筋草、狗尾草、稗草、千金子、看麦娘、早熟禾等，高羊茅、结缕草草坪的狗牙根、假俭草等杂草以及柔枝莠竹及其近缘种植物油芒、芒、金茅、日本莠竹、荩草、苏丹草等禾本科植物。筛选一种稷平脐蠕孢菌菌株，用于生物除草，安全、高效，成本低，无污染，对农作物安全。

为达成以上目的，本发明公开了一种稷平脐蠕孢菌菌株、其筛选方法及其用途，采用的技术方案如下：

一种稷平脐蠕孢菌菌株，所述菌株为稷平脐蠕孢菌菌株sx-5-2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.13887。

上述的稷平脐蠕孢菌菌株用作生物除草剂的用途。

优选的，上述的稷平脐蠕孢菌菌株用作生物除草剂的用途为：利用所述稷平脐蠕孢菌菌株的分生孢子的浓度为每毫升10⁴个以上，接种于目标杂草上。

优选的，所述杂草为禾本科杂草。

优选的，所述禾本科杂草包括狗牙根、早熟禾、假俭草、马唐、看麦娘、菵草、牛筋草、狗尾草、柳枝稷、稗草、千金子、柔枝莠竹及其近缘属植物。

优选的，所述柔枝莠竹近缘属植物包括油芒、芒、金茅、日本莠竹、荩草、苏丹草。

一种除草组合物，包含稷平脐蠕孢菌菌株sx-5-2，保藏编号为cgmccno.13887；以及农药学上可接受的载体。

优选的，所述载体包括表面活性剂、稳定剂。

优选的，所述表面活性剂为吐温20、吐温80、菜籽油和卵磷脂；所述稳定剂为抗氧化剂或ph调节剂，包括明胶和阿拉伯树胶。

一种稷平脐蠕孢菌菌株的筛选方法，包括以下步骤：

步骤1)将该菌株于28℃黑暗培养箱培养4天，采用真菌gdna提取试剂盒提取dna，分别利用rdnaits序列和gpdh序列进行pcr扩增，其通用引物分别为its1(5’-tccgtaggtgaacctgcgc-3’)、its2(5’-ccttgtaagtttcttttcctcc-3’)和gpd1(5’-caacggcttcggtcgcattg-3’)、gpd2(5’-gccaagcagttggttgtgc-3’)；

步骤2)将步骤1)得到的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收，连接至pmd19载体，转化大肠杆菌dh5α，经过蓝白斑筛选，挑取白色菌落，摇菌，得到菌液；

步骤3)将步骤2)制得的菌液进行测序，所测结果在genbank中核酸数据库的its和gpdh相关序列进行同源性比较；

步骤4)经扩增测序比对后，its扩增序列(mf083601)与b.panici-miliacei模式菌株(kj909773)的同源性为99％，gpdh扩增序列(mf112228)与b.panici-miliacei模式菌株(km042896)同源性为99％，确定菌株为稷平脐蠕孢菌。

本发明的主要优点和积极效果如下：

1、稷平脐蠕孢菌柔枝莠竹专化型菌剂用于生物除草可以在作物与禾本科杂草间进行安全地选择。本发明的除草剂对环境友好，可抑制杂草的耐药和抗药性发展，有利于绿色食品和有机农业的推广，并且成本低、无污染、对农作物安全。在供试的17科57种植物中，对稷平脐蠕孢菌很敏感的有12种，敏感的有7种，稍敏感的有5种，不敏感的有33种，其中有敏感性的植物大都集中在禾本科，对于其他科植物如菊科、旋花科、唇形科、十字花科、玄参科、茜草科、石竹科、锦葵科、鸭跖草科、莎草科、大戟科、豆科、马齿苋科、茄科、酢浆草科等植物敏感性较弱。从形态上看，孢子主要侵染禾本科植物叶片，由于其叶片普遍较窄，孢子接触后容易产生侵染结构并迅速扩散，而菊科、旋花科、大戟科、石竹科、玄参科等杂草叶片较宽，具有发达的网状脉侵染结构不易形成，故而不易被侵染。

2、本发明用于生物除草，是利用活的生物本身，该生物是直接采集于自然环境，是目标作物田及其环境中发生的目标杂草的天然致病菌，由于环境中已经存在，故没有在使用过程中的生态风险，加之，该菌株专化性强，对作物及其它非目标植物安全性高，不会导致对环境的残留危害，其菌体死亡后迅速腐化降解，降解产物均为可循环有机物，不会导致污染，因而，对环境安全，可用于生产出绿色或有机农产品。

3、该菌株对目标杂草控制效果可以达到80％以上，特别是苗期和衰老的植株。

4、根据测试，稷平脐蠕孢菌sx-5-2对大多数作物安全，仅对玉米等敏感性很高，在水稻、小麦、高粱、大豆、棉花、蔬菜作物田以及高羊茅、结缕草草坪可以安全使用，并能用于控制上述田间禾本科杂草。这再次表明稷平脐蠕孢菌sx-5-2具有开发为防除柔枝莠竹及禾本科杂草生物除草剂的潜力。

附图说明

图1为sx-5-2稷平脐蠕孢菌菌株菌落形态图；

图2为sx-5-2稷平脐蠕孢菌菌株的分生孢子形态图；

图3为sx-5-2稷平脐蠕孢菌菌株的凝胶电泳图，图中1、2为its序列，3、4为gpdh序列。

具体实施方式

稷平脐蠕孢菌菌株bipolarispanici-miliacei(y.nisik.)shoemaker(sx-5-2)(保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2017年4月17日；保藏号：cgmccno.13887)，稷平脐蠕孢菌菌株属于真菌界(fungi)，子囊菌门(ascomycota)，座囊菌纲(dothideomycetes)，格孢腔菌亚纲(pleosporomycetidae)，格孢腔菌目(pleosporalesluttrellexbarr)，格孢腔菌科(plesporaceaenitschke)，旋孢腔菌属(cochliobolusdrechsler)[无性阶段：平脐蠕孢属(bipolarisshoemarke)]，稷平脐蠕孢菌(bipolarispanici-miliacei(y.nisik)shoemaker)。在马铃薯葡萄糖培养基上生长较快，25℃黑暗条件下培养5天，菌落直径50～55mm，青灰色，质地绒状，菌落背面黑褐色，无水溶性色素。如图1所示为稷平脐蠕孢菌培养4天后的菌落形态图。分生孢子梗单生或丛生于培养基上，褐色，具分隔，未见分枝，顶端合轴式延伸，产孢痕明显，长可达210μm，宽4.1～6.5μm。分生孢子簇生于分生孢子梗顶端和下部产孢节上，长椭圆形或倒棒状，直或微弯曲，浅到黄褐色，颜色均一，具4～10假隔膜，脐点黑色，略突出，平截，53～100×12～20μm。如图2所示为稷平脐蠕孢菌在高倍显微镜下的分生孢子形态图。

本发明的新菌株是通过下述途径获得的，发明人对安徽、福建、广东、广西、贵州、河南、湖北、湖南、江苏、江西、四川、山东、台湾、云南、西藏和浙江省等地的森林边缘、草原、旷野、湿地、作物田边缘、沟渠、树篱、峡谷和农田的柔枝莠竹发病情况进行调查并采集发病的柔枝莠竹叶片，记录植株发病症状及有关信息并带回实验室，对其寄生真菌进行分离研究并严格按照柯赫式法则(koch’spostulate)进行了致病性验证。

首先稷平脐蠕孢菌菌株(bipolarispanici-miliacei)菌株sx-5-2自然条件产生的孢子在柔枝莠竹上的致病症状为：柔枝莠竹罹病植株叶片上均可见大小不同的病斑，发病初期叶片中心出现明显的淡褐色病斑，圆形或椭圆形，边缘黄褐色，具黄色晕圈，宽2～3mm，长3～5mm，部分叶尖出现黄化，发病中期，病斑逐渐扩大形成矩圆形，圆形或不规则形，病斑中央呈现深褐色，严重时叶片病斑密集成片，叶片顶端枯死，发病后期叶片大都出现黄化或枯死，并伴随叶片卷曲，下部叶片较上部发病严重。

于病叶的病健交界处切取组织块，用75％酒精和1％次氯酸钠溶液进行表面消毒。将这些组织小块接种在pda培养基上，28℃黑暗培养2天，对分离得到的菌株进行纯化培养，观察到的菌丝生长情况以及孢子产生情况也与前面相似，且为柔枝莠竹的强致病菌。将其保存于斜面培养基上，置于4℃备用。

在光学显微镜下观察分生孢子、分生孢子梗形态，同时显微照相测定分生孢子的大小。根据《中国真菌志》、《真菌鉴定手册》描述的形态特征进行病原鉴定。经鉴定，菌株sx-5-2的形态特征与《中国真菌志》第三十卷对稷平脐蠕孢菌bipolarispanici-miliacei(y.nisik.)shoemaker的描述基本一致，鉴定为b.panici-miliacei。描述如下：分生孢子梗黄褐色，顶端颜色较淡，屈膝状弯曲，单生或簇生，圆柱状，多隔膜，基部膨大，90～160.5×4.5～6.5μm。分生孢子暗褐色，拟纺锤形至宽椭圆形，中部粗，两端略细，直或弯，光滑，6～8个(多7个)假隔膜，80～112.5×14.5～19μm(平均97.6×16.9μm)；脐部略突出，平截。

采用真菌gdna提取试剂盒(biomiga)提取致病真菌dna，分别利用rdnaits序列和gpdh序列进行pcr扩增。其通用引物分别为its1(5’-tccgtaggtgaacctgcgc-3’)、its2(5’-ccttgtaagtttcttttcctcc-3’)和gpd1(5’-caacggcttcggtcgcattg-3’)、gpd2(5’-gccaagcagttggttgtgc-3’)。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收，连接至pmd19载体，转化大肠杆菌dh5α，经过蓝白斑筛选，挑取白色菌落，摇菌。并进行pcr扩增，经电泳和凝胶分析仪检测，1％的琼脂糖凝胶上显示单一的明亮条带，如图3所示，图中1、2为its扩增序列，目的条带大小约为600bp；3、4为gpdh扩增序列，目的条带大小约为500bp。将菌液委托上海生工公司进行测序，所测结果在genbank中核酸数据库的its和gpdh相关序列进行同源性比较(blastn软件分析)。经扩增测序比对后，its扩增序列(mf083601)与b.panici-miliacei模式菌株(kj909773)的同源性为99％，gpdh扩增序列(mf112228)与b.panici-miliacei模式菌株(km042896)同源性为99％，确定菌株为稷平脐蠕孢菌。its扩增序列(mf083601)如seqidno：1所示，gpdh扩增序列(mf112228)如seqidno：2所示。

稷平脐蠕孢菌sx-5-2纯培养产生的孢子在柔枝莠竹上的致病症状为：叶片中心出现明显的淡褐色病斑，圆形或椭圆形，部分叶尖出现黄化，随着时间的推移，病斑逐渐扩大且颜色加深，严重时叶片病斑密集成片，叶片顶端出现枯死，接种后期叶片大部分黄化或枯死，叶片卷曲。从病叶部位重新分离病菌，病斑表面的孢子与所喷施的稷平脐蠕孢菌孢子一致，符合柯赫式法则。

以上实验条件下的发病症状与自然病症相似。

本发明的稷平脐蠕孢菌菌株sx-5-2分离自柔枝莠竹，但它具有广谱的禾本科杂草致病力，同样它的另一个优点在于可以有效杀死很多一年生和多年生禾本科杂草，而不影响周边的作物，从这一点看，稷平脐蠕孢菌sx-5-2具有与化学除草剂芳香苯氧丙酸类除草剂同样的专一性，但却对环境安全。

按其特征鉴定为：子囊菌门(ascomycota)，座囊菌纲(dothideomycetes)，格孢腔菌亚纲(pleosporomycetidae)，格孢腔菌目(pleosporalesluttrellexbarr)，格孢腔菌科(plesporaceaenitschke)，旋孢腔菌属(cochliobolusdrechsler)[无性阶段：平脐蠕孢属(bipolarisshoemarke)]，稷平脐蠕孢菌(bipolarispanici-miliacei(y.nisik)shoemaker)。该专化型菌株主要侵染柔枝莠竹及其近缘种，以及禾本科杂草，而对水稻、小麦、高粱、大豆、棉花、蔬菜等主要作物高度免疫，在供试的17科57种植物中，对稷平脐蠕孢菌很敏感的有12种，敏感的有7种，稍敏感的有5种，不敏感的有33种，其中有敏感性的植物大都集中在禾本科，对于其他科植物如菊科、旋花科、唇形科、十字花科、玄参科、茜草科、石竹科、锦葵科、鸭跖草科、莎草科、大戟科、豆科、马齿苋科、茄科、酢浆草科等植物敏感性较弱。因此该菌株可用于水稻、小麦、高粱、大豆、棉花、蔬菜作物田，以及高羊茅、结缕草草坪，用于控制农田杂草马唐、牛筋草、狗尾草、稗草、千金子、柔枝莠竹、早熟禾，看麦娘等禾本科杂草，以及莠竹属近缘属植物油芒、芒、金茅、日本莠竹、荩草、苏丹草等。

本发明的稷平脐蠕孢菌sx-5-2用于生物除草，具体的应用方法为：将菌种接种于下列培养基，诱导产生分生孢子后喷施于田间或杂草发生地，使用剂量为10⁴～10⁶个/ml。

其培养方法为：稷平脐蠕孢菌在黑暗条件下生长约4天，将培养皿在无菌条件下置于黑光灯或紫外灯(24h)下照射，培养基在照射过程中会产生孢子。

1、pda培养基——马铃薯葡萄糖琼脂培养基

2、mvpda培养基——柔枝莠竹浸汁pda培养基

3、mssa培养基——玉米粉豆粉蔗糖培养基

4、pca培养基——马铃薯胡萝卜琼脂培养基

5、cda培养基——czapekdoxagar培养基

6、燕麦片琼脂培养基

7、玉米粉琼脂培养基

玉米粉300g

琼脂20g

蒸馏水1l

目前，国内外尚无关于柔枝莠竹的真菌除草剂的报道，这方面的研究为解决柔枝莠竹以及禾本科杂草的防除提供了一个新的优良的途径。本发明的除草组合物可以与其它适合的化学除草剂配合使用，从而降低化学除草剂的用量，减少对环境的污染。

根据需要，本发明的除草组合物可使用表面活性剂、稳定剂等助剂，表面活性剂如吐温20、吐温80等，稳定剂可使用抗氧化剂或ph调节剂等。

实施例1

从野外采集到患病柔枝莠竹的叶片，记录植株发病症状，镜检。用柔枝莠竹浸汁琼脂培养基进行病原真菌的分离。在显微镜下挑取个菌株的单孢子，分别接种在pda培养基上，于黑暗，28℃下培养，观察病原真菌纯培养的菌落特征并测量菌落直径。另取直径5mm的各菌落圆片接种在pda平板中央，于4天后测量个菌落直径。

表1柔枝莠竹病原真菌菌落特征的比较

注：d1表示单孢子5天后形成的菌落直径。

d2表示5mm菌落圆片4天后形成的菌落直径。

实施例2

从自然发生于浙江的柔枝莠竹病害植株上采集分离出致病真菌，对其致病性进行了实验。分别用不同浓度的各种病原真菌孢子悬浮液(其中表面活性剂为吐温20、吐温80、菜籽油和卵磷脂，稳定剂为抗氧化剂或ph调节剂，包括明胶和阿拉伯树胶等)，于自然条件下喷施柔枝莠竹，观察各真菌的致病特性。

表2从柔枝莠竹植株上分离的几种致真菌对柔枝莠竹的致病力比较

注：10⁵、10⁴分别表示喷施的孢子悬浮液浓度为每毫升10⁵、10⁴个孢子(下同)。

小写字母为0.05显著水平，大写字母为0.01显著水平(下同)。

由表2可知，在稷平脐蠕孢菌菌株sx-5-2致病率高于除菌株mll1-5外的所有其他菌株，虽略低于菌株mll1-5，但是，两者在10⁴sp/ml的差异不显著。

实施例3

将sx-5-2菌株在pda培养基上培养4天，置于28℃黑光灯下照射，以无菌水配置孢子悬浮液(同实施例2)。另外在9cm的盆钵中培养柔枝莠竹幼苗，待其长至3～4叶期，用手持喷雾器喷施孢子悬浮液，28℃保湿48h，湿度80％，在处理一周后，可以完全杀死该草。

实施例4

将供试植物(见表3、4)种子播种于直径9cm的盆钵中，设置4组重复，在温度为28℃的温室中培育，当供试植物达到3-4叶期时进行接种(同实施例2、3)，每盆保留5-10株，测试sx-5-2菌株对于各供试植物的敏感性情况。安全性试验结果表明，sx-5-2菌株对玉米有较强的致病力，对甘蔗有弱的致病性，对粟有极弱的致病性，对水稻、小麦、大麦、高粱等禾本科作物以及棉花、大豆、烟草、花生、蚕豆、芝麻、油菜等均无致病性。杀草谱试验结果表明，sx-5-2菌株对柳枝稷、稗草、千金子、日本莠竹、马唐、看麦娘、狗牙根、苏丹草等禾本科杂草有强的致病性，对假俭草、牛筋草、菵草、狗尾草、芒、油芒、金茅、早熟禾、荩草有一定的致病性，对黑麦草、中华结缕草、高羊茅、雀麦、白茅以及异型莎草、球序卷耳、繁缕、猪殃殃、鸭跖草、泽漆、荠菜、苜蓿、大巢菜、野大豆、车轴草、打碗花、宝盖草、通泉草、波斯婆婆纳、酢浆草、马齿苋、加拿大一枝黄花、艾蒿和紫茎泽兰无致病性。因此，sx-5-2菌株可以应用于水稻、小麦、大麦、高粱、棉花、大豆、烟草、花生、蚕豆、芝麻、油菜等作物田，防治稗草、千金子、日本莠竹、马唐、柔枝莠竹、牛筋草、菵草、狗尾草等禾本科杂草。

表3供试作物对稷平脐蠕孢菌sx-5-2的敏感性

表4供试杂草对稷平脐蠕孢菌菌株sx-5-2的敏感性

sequencelisting

<110>南京农业大学

<120>一种稷平脐蠕孢菌菌株、其筛选方法及其应用

<130>2017

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<213>稷平脐蠕孢（bipolarispanici-miliacei）

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