一种鉴别翘嘴鲌与三角鲂杂交个体的方法与流程

本发明涉及一种鱼类杂交个体的鉴别方法，特别涉及一种鉴别翘嘴鲌与三角鲂杂交个体的方法。

背景技术：

翘嘴鲌体型较大，体细长，侧扁，呈柳叶形。头背面平直，头后背部隆起。口上位，下颌坚厚急剧上翘，竖于口前，使口裂垂直。眼大而圆。鳞小。翘嘴鲌属中、上层大型淡水经济鱼类，行动迅猛，善于跳跃，性情暴躁，容易受惊。

翘嘴鲌体长，甚侧扁，头背面平直，头后背部为隆起，体背部接近平直。腹棱不完全，自腹鳍至肛门。口大，上位，下颌很厚，且向上翘，口裂几乎成垂直。眼大，位于头的侧下方。下咽齿末端成钩状。腹鳍基至肛门间有腹棱；背鳍具强大而光滑的硬刺；尾鳍分叉，下叶稍长于上叶。体背略呈青灰色，两侧银白，各鳍灰黑色。尾巴是红色的被称为翘嘴红鲌，尾巴呈青色的称之为青梢鲌，最大的个体可重达10千克，是我国鳊鲌亚种最大的一种鱼。

翘嘴鲌平时多生活在流水及大水体的中上层，游泳迅速，善跳跃。以小鱼为食，是一种凶猛性鱼类。雌鱼3龄达性成熟，雄鱼2龄即达成熟，亲鱼于6-8月在水流缓慢的河湾或湖泊浅水区集群进行繁殖活动。产卵后大多进入湖泊摄食或在江湾缓流区肥育。幼鱼喜栖息于湖泊近岸水域和江河水流较缓的沿岸，以及支流、河道与港湾里。冬季，大小鱼群皆在河床或湖槽中越冬。翘嘴鲌分布甚广，产于黑龙江、辽河、黄河、长江、钱塘江、闽江、台湾、珠江等水系的干、支流及其附属湖泊中。广泛分布于长江流域各水系及附属湖泊。

三角鲂，因顶鳍高耸、头尖尾长，从侧面看近似三角形而得名。属鲤科、鲂鳊亚科、鲂属鱼类。体高，略呈菱形，三角鲂体长130～367mm，体侧扁而高，略呈长菱形，腹部圆，腹棱存在于腹鳍基与肛门之间，尾柄宽短。是中国特有鱼类。

栖息于流水或静水的水域中下层，属杂食性鱼类，以水生植物为食，也吃水生昆虫、小鱼、虾和软体动物等。3龄性成熟，春夏之交鱼群集于有流水的场所进行繁殖。体形大肉厚、骨刺比较少、肉质嫩滑，为淡水鱼类中的珍品，是一种较贵重的经济鱼类。

三角鲂，体长130～367mm；体长为体高的2.3～3.1倍，为头长的4.2～5.1倍，为尾柄长的8.3～10.9倍，为尾柄高的8.1～10.3倍。头长为吻长的2.3～3.9倍，为眼径的3.0～4.6倍，为眼间距的2.1～2.8倍，为尾柄长的1.6～2.5倍，为尾柄高的1.8～2.3倍。尾柄长为尾柄高的0.7～1.2倍。

三角鲂体侧扁而高，略呈长菱形，腹部圆，腹棱存在于腹鳍基与肛门之间，尾柄宽短。头短，侧扁，头长远较体高为小，吻短而圆钝，吻长等于或大于眼径。口小，端位，口裂稍斜，上下颌约等长，边缘具角质，上颌角质呈新月形，上颌骨伸达鼻孔的下方。眼较大，位于头侧，眼后缘至吻端的距离大于眼后头长。眼间宽而圆凸，眼间距大于眼径。鳃孔向前约伸至前鳃盖后缘的下方；鳃盖膜联于峡部；峡部窄。鳞中大，背、腹部鳞较体侧鳞为小。侧线约位于体侧中央，前部略呈弧形，后部平直，伸达尾鳍基。背鳍位于腹鳍后上方，外缘上角尖形，第三不分枝鳍条为硬刺，刺尖长，其长大于头长。背鳍起点至吻端的距离大于或等于至尾鳍基的距离。臀鳍外缘凹入，

起点与背鳍基末端约相对，至腹鳍起点的距离小于臀鳍基部长。胸鳍尖形，后伸到达或不达腹鳍起点，也有超过腹鳍起点。腹鳍位于背鳍的前下方，其长短于胸鳍，末端不达臀鳍起点。尾鳍深叉，下叶略长于上叶，末端尖形。鳃耙短，排列较稀。下咽骨宽短，呈“弓”状，前、后臂约等长，有前、后角突；主行咽齿侧扁，末端尖而弯，最后一枚齿呈圆锥形。鳔3室，中室最大，后室小而末端尖形。肠长，盘曲多次，其长为体长的2.5倍左右。腹膜银灰色。

自然界中翘嘴鲌与三角鲂存在自然杂交个体，随着养殖业的发展，翘嘴鲌与三角鲂人工杂交个体也被培育而出，然而，在鱼体长度3cm以下的较小时期，翘嘴鲌与三角鲂杂交个体与纯种的翘嘴鲌、三角鲂外形相似度极高，肉眼难以分辨，只有等到成体期才能看出明显的形态区别。因此，如何更准确的区分该时期翘嘴鲌与三角鲂杂交个体与纯种的翘嘴鲌、三角鲂成为急需解决的问题，目前，现有技术中未报到用于鉴定翘嘴鲌与三角鲂杂交个体的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种鉴别翘嘴鲌与三角鲂杂交个体的方法，针对鱼体长度3cm以下的较小时期的翘嘴鲌与三角鲂杂交个体与纯种的翘嘴鲌、三角鲂区分难以区分的问题，采用pcr的方法，引物特异性强，鉴别准确、快速，能有效将在鱼体长度3cm以下的较小时期的翘嘴鲌与三角鲂杂交个体与纯种的翘嘴鲌、三角鲂区分。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种鉴别翘嘴鲌与三角鲂杂交个体的方法，包括以下步骤：

（1）dna提取：提取样品鱼鳍部位的基因组dna；

（2）pcr扩增：采用翘嘴鲌分辨引物a、三角鲂分辨引物b分别同时对提取的样品鱼鳍部位的基因组dna进行pcr扩增；

（3）结果判断：对pcr扩增产物进行凝胶电泳，根据电泳结果判断样品是否为翘嘴鲌与三角鲂杂交个体，若翘嘴鲌分辨引物a的pcr扩增产物电泳出现一条条带，同时三角鲂分辨引物b的pcr扩增产物电泳出现两条条带，则表明样品为翘嘴鲌与三角鲂杂交个体。

本发明针对翘嘴鲌、三角鲂的基因组dna，设计开发了针对性的特异性引物翘嘴鲌分辨引物a、三角鲂分辨引物b，翘嘴鲌分辨引物a、三角鲂分辨引物b能针对杂交个体中对应的翘嘴鲌、三角鲂基因部分进行特异性扩增，从而通过对比pcr扩增结果能准确、快速鉴别样品是否为翘嘴鲌与三角鲂杂交个体。

同时，本发明的方法还能同时判断被检测的样品是否为翘嘴鲌或三角鲂的纯种，若翘嘴鲌分辨引物a未出现扩增条带，同时三角鲂分辨引物b出现两条扩增条带，则为三角鲂纯种；若翘嘴鲌分辨引物a出现扩增条带，同时三角鲂分辨引物b未出现扩增条带，则为翘嘴鲌纯种。

作为优选，所述翘嘴鲌分辨引物a为：

f：5’-gtacgaccccgattgcaaaag-3’；

r：5’-gagacacaagctgcggtg-3’。

作为优选，所述三角鲂分辨引物b为：

f：5’-ttcttccaggggcattggtg-3’；

r：5’-ggtttctttgctgtcctggtg-3’。

作为优选，步骤（2）pcr扩增的程序设置为：98℃预变性30s，后经过35个循环，每个循环包括98℃、10s，56℃、30s，72℃、15s；最后72℃延伸5min。

作为优选，若翘嘴鲌分辨引物a的pcr扩增产物电泳出现一条条带，大小在648bp；同时三角鲂分辨引物b的pcr扩增产物电泳出现两条条带，大小在540bp和780bp，则表明样品为翘嘴鲌与三角鲂杂交个体。

作为优选，所述翘嘴鲌与三角鲂杂交个体的体长在3cm以下。

本发明的有益效果是：采用pcr的方法，引物特异性强，鉴别准确、快速，能有效将在鱼体长度3cm以下的较小时期的翘嘴鲌与三角鲂杂交个体与纯种的翘嘴鲌、三角鲂区分。

附图说明

图1是翘嘴鲌分辨引物a的pcr扩增产物电泳图。

图2是三角鲂分辨引物b的pcr扩增产物电泳图。

图中：m：为markerdl2000；ca为翘嘴鲌；mt为三角鲂；h为翘嘴鲌*三角鲂杂交个体。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例：

一种鉴别翘嘴鲌与三角鲂杂交个体的方法，包括以下步骤：

（1）dna提取：提取样品（鱼体长度3cm以下）鱼鳍部位的基因组dna，可采用市售试剂盒提取样品鱼鳍部位的基因组dna，也可采取以下方法：

1.取少许鳍条组织，加入500ul细胞裂解液(100mmtris-hcl，5mmedta，500mmnacl，1.25%sds(ph7.5),5ul蛋白酶k（1mg/ml）），消化过夜。

2.加入等体积的tris饱和酚（500μl），摇匀（10min）。

3.离心：12000r/min，10min，4℃,离心后分成上中下三层，上层为dna，中层为蛋白质，下层为有机质。

4.吸取上层液体加入新的离心管。

5.加入等体积经过-20℃冷冻的100%的乙醇，12000r/min，10min，4℃离心。

6.弃上清，留白色沉淀（dna），加500μl的75%的经过-20℃冷冻的乙醇。

7.重复第6步骤2次（用75%乙醇洗三次）。

8.待乙醇挥发，加入50μlddh2o。

（2）pcr扩增：采用翘嘴鲌分辨引物a、三角鲂分辨引物b分别同时对提取的样品鱼鳍部位的基因组dna进行pcr扩增，pcr扩增的程序设置为：98℃预变性30s，后经过35个循环，每个循环包括98℃、10s，56℃、30s，72℃、15s；最后72℃延伸5min。翘嘴鲌分辨引物a能扩增翘嘴鲌纯种及翘嘴鲌与三角鲂杂交个体中翘嘴鲌特定基因组的dna；三角鲂分辨引物b能扩增三角鲂纯种及翘嘴鲌与三角鲂杂交个体中三角鲂特定基因组的dna。

所述翘嘴鲌分辨引物a为：

f：5’-gtacgaccccgattgcaaaag-3’（seqidno.1）；

r：5’-gagacacaagctgcggtg-3’（seqidno.2）。

所述三角鲂分辨引物b为：

f：5’-ttcttccaggggcattggtg-3’（seqidno.3）；

r：5’-ggtttctttgctgtcctggtg-3’（seqidno.4）。

（3）结果判断：对pcr扩增产物进行凝胶电泳，根据电泳结果判断样品是否为翘嘴鲌与三角鲂杂交个体，若翘嘴鲌分辨引物a的pcr扩增产物电泳出现一条条带，大小在648bp左右；同时三角鲂分辨引物b的pcr扩增产物电泳出现两条条带，大小在540bp和780bp左右，则表明样品为翘嘴鲌与三角鲂杂交个体。

试验部分：

采用翘嘴鲌分辨引物a对翘嘴鲌纯种、三角鲂纯种、翘嘴鲌与三角鲂杂交个体进行pcr扩增，扩增结果如图1所示，pcr结果：ca及杂交个体有条带，大小在648bp，mt未出现条带。扩增体系如下：

5×q5reactionbuffer（5×q5反应缓冲液，市售，neb公司产品）5微升，

10mmdntps0.5微升，10μm正向引物1.25微升，

10μm反向引物1.25微升，

模板dna1微升，

q5hotstarthigh-fidelitydnapolymerase（q5热启动高保真dna聚合酶，市售，neb公司产品）0.25微升，

5×q5highgcenhancer(5×q5高gc增强子，市售，neb公司产品)5微升，

无核酸酶水补足至25微升。

采用三角鲂分辨引物b对翘嘴鲌纯种、三角鲂纯种、翘嘴鲌与三角鲂杂交个体进行pcr扩增，扩增结果如图2所示，pcr结果：mt及杂交个体均有两条带，大小在540bp和780bp左右位置有两条带，ca未出现条带。扩增体系如下：

5×q5reactionbuffer（5×q5反应缓冲液，市售，neb公司产品）5微升，

10mmdntps0.5微升，10μm正向引物1.25微升，

10μm反向引物1.25微升，

模板dna1微升，

q5hotstarthigh-fidelitydnapolymerase（q5热启动高保真dna聚合酶，市售，neb公司产品）0.25微升，

5×q5highgcenhancer(5×q5高gc增强子，市售，neb公司产品)5微升，

无核酸酶水补足至25微升。

以本发明的方法对50个鱼体长度3cm以下实际样品进行鉴别，发现其中杂交个体数量为12个，进一步养殖为成体后通过形态观察确认本发明鉴别的杂交个体准确度的100%。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

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<110>浙江省淡水水产研究所

<120>一种鉴别翘嘴鲌与三角鲂杂交个体的方法

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