防治牙周炎的DNA疫苗的制作方法

本发明属于口腔疾病防治医学技术领域，具体涉及一种dna疫苗、制备方法以及其在防治牙周炎中的用途。

背景技术：

牙周病是引起牙齿丧失的主要口腔疾病之一，也是危害人类口腔和全身健康的主要疾病；慢性牙周炎是导致成人牙齿功能丧失的主要原因，发病率高。牙周病对牙周组织造成的破坏是持续且不可逆的，一旦发生，以目前的治疗手段很难达到完全康复。此外，牙周病还与某些全身疾病密切相关，是诱发某些系统性疾病如糖尿病、心血管系统疾病等的危险因素，许多临床研究表明牙周病与这些全身疾病相互影响，甚至互为因果。牙周病还可能导致新生儿早产与低体重。最近的研究表明，在患有牙周病的早产低体重儿的母体中，产妇的静脉血清和脐带血清中各炎性因子水平明显升高，且母体牙周病变程度越高，婴儿孕周越小，出生体重越低。因此，从各个方面来说，探索有效的防治牙周病的药物或疫苗对于提高国民整体健康水平有着重要意义。

牙龈卟啉单胞菌(porphyromonasgingivalis，p.gingivalis)是牙周炎的主要致病菌之一，其在慢性牙周炎和侵袭性牙周炎等口腔疾病的发生发展中发挥着重要的作用。p.gingivalis含有大量的特异性毒力因子，如菌毛、血凝素、脂多糖及蛋白酶等，介导p.gingivalis对牙周组织黏附、定植，进而破坏牙周组织结构。近年来随着分子生物学与免疫学技术的不断成熟，尤其是p.gingivalis基因组dna被成功测序，为筛选作为疫苗的候选基因提供了可靠的依据。针对上述靶点设计基因疫苗，发挥相应的免疫效应是可行的。

牙龈素是p.gingivalis细胞表面的特异性半胱氨酸蛋白酶，存在于p.gingivalis外膜、膜泡或胞外，是重要的毒力因子，能直接参与牙周组织的破坏，并使p.gingivalis逃避宿主的免疫防御机制，同时也反映了不同时期的p.gingivalis在牙周炎患者病变部位的比例变化，在p.gingivalis致牙周病的发生发展过程中占据相当重要的地位。牙龈素编码基因分别为rgpa、rgpb和kgp，分别编码rgpa、rgpb和kgp蛋白。其中kgp、rgpa、rgpb的免疫原性各不相同，有研究人员通过实验验证kgp、rgpa的免疫原性较rgpb强。rgpa基因包括催化结构域和血凝集素黏附结构域(hemagglutinina,haga)，其中haga基因分为四段，分别编码ha1、ha2、ha3、ha4结构域，其中ha2为p.gingivalis的关键区域。大量基因水平的分析表明，ha2基因具有调控介导细菌凝集并破坏红细胞，黏附至牙周组织，破坏牙周组织形态的作用。另有研究报道ha2基因缺陷的菌株，凝血实验结果显著小于正常的菌株，证实其在p.gingivalis中具有凝血作用。根据genbank中已公布的rgpa基因的序列，结合其已公布ha2蛋白序列编号，对应找到其基因编码区为第4357-4861(gi：u15282)。

白细胞介素15(简称白介素15，或il-15)从肾脏表皮细胞系cv-1/ebna中克隆出来的一种具有免疫调节作用的细胞因子，属于公用γ链受体的细胞因子家族。il-15能够诱导nk细胞和cd8⁺t细胞的发育、增殖及活化。il-15还能促进b细胞特别是b1细胞的增殖分化，使其分化出分泌siga的浆细胞。调节bl细胞向产生分泌性iga细胞分化的细胞因子主要有il-15、转化生长因子β(tgf-β)及il-5等。这些细胞因子作用已被抗原致敏的b1细胞，经过细胞信号传导，诱导编码iga不变区基因的表达，实现抗原致敏的b1细胞向产生siga浆细胞分化。由此可见，通过提高体内免疫细胞周围il-15的含量，制造一个利于更多b1细胞转化成分泌型iga浆细胞的微环境，可以提高黏膜免疫应答的强度。

现阶段，基因疫苗已经成为探索防治疾病的一种有效的新措施，作为基因疫苗的重组质粒进入胞内，与细胞同时进行增殖与表达，产生分泌蛋白至胞外，诱导抗原-抗体反应产生体液免疫，同时具有表面抗原效应的抗原可以表达于细胞膜上，从而诱导细胞免疫。因其具有体液免疫及细胞免疫的双重免疫效应，使其成为优于传统灭活疫苗及减毒疫苗的新型疫苗。同时，构建靶向基因疫苗成为现阶段研究的热点，将多种基因串联，以增强其免疫效应。

迄今，还没有将牙龈素-血凝素基因编码区的核心功能区ha2和sd大鼠il-15基因连接，用于牙周炎疫苗的研究和开发工作中。

技术实现要素：

本发明设计将牙龈素-血凝素基因编码区的核心功能区ha2、sd大鼠il-15基因重组并整合到真核表达质粒上，制备dna疫苗，用于口腔牙周炎防治的研究。

据此，本发明提供了一类新型的dna疫苗、制备方法以及其在防治牙周炎中的用途。

具体地：

一方面，本发明提供了一种新型的dna疫苗，为pvax1-ha2/il-15重组质粒，是由牙龈卟啉单胞菌w83型的牙龈素-血凝素基因编码区的核心功能区ha2、sd大鼠il-15基因、ires序列和真核表达载体pvax1质粒构成。

本发明所述的dna疫苗，为pvax1-ha2/il-15重组质粒，经酶切去除pvax1载体后，得到的ha2/il-15的dna序列如seqid:1所示。

另一方面，本发明还提供了上述为pvax1-ha2/il-15重组质粒的dna疫苗的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

(1)、ha2/il-15重组基因的制备；

(2)、pvax1-ha2/il-15重组质粒的构建并转化感受态细胞，筛选重组质粒；

(3)、重组质粒酶切后进行dna测序鉴定，得到的ha2/il-15的dna序列如seqid:1所示。

一种优选的实施方式，上述为pvax1-ha2/il-15重组质粒的dna疫苗的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

(1)、牙龈素-血凝素基因编码区的核心功能区ha2、sd大鼠il-15基因及ires基因的克隆，ha2和il-15基因通过ires序列连接后得到ha2/il-15重组基因片段；

(2)、将步骤(1)中获得的ha2/il-15重组基因片段插入到pvax1质粒，构建pvax1-ha2/il-15重组质粒，并转化感受态细胞dh5α，得到的pvax1-ha2/il-15重组质粒；

(3)、步骤(2)得到的pvax1-ha2/il-15重组质粒，经酶切鉴定正确后进行dna测序，得到的ha2/il-15的dna序列如seqid:1所示。

一种优选的实施方式，上述为pvax1-ha2/il-15重组质粒的dna疫苗的制备方法的所述步骤(1)的优选操作为：

1)、根据genbank公布的ha2、il-15以及pires2-egfp图谱中的ires序列设计并合成引物；

2)、牙龈卟啉单胞菌w83型的培养及基因组dna的提取，克隆ha2基因；

3)、pvax1及pires2-egfp质粒的提取，克隆ires序列；

4)、sd大鼠总rna的提取及逆转录，克隆il-15基因；

5)、ha2和il-15基因通过ires序列连接后得到ha2/il-15重组基因片段。

一种优选的实施方式，上述为pvax1-ha2/il-15重组质粒的dna疫苗的制备方法的所述步骤(2)的优选操作为：将步骤(1)中获得的ha2/il-15重组基因片段插入到pvax1质粒中，构建pvax1-ha2/il-15重组质粒，将上述重组质粒转化感受态细胞dh5α，重组质粒酶切鉴定正确后送dna测序，序列如seqid:1所示；为ha2/il-15。

上述为pvax1-ha2-fima重组质粒的制备方法；其各个步骤优选，但不限于，如下的操作：

所述步骤(1)、牙龈素-血凝素基因编码区的核心功能区ha2和sd大鼠il-15基因、连接片段ires序列的克隆，il-15与ires序列进行拼接后获得的片段与ha2拼接，获得ha2/il-15重组片段，具体步骤为：以牙龈卟啉单胞菌w83型、sd大鼠总rna逆转录为cdna、pires2-egfp为模版，以pvax1质粒为载体，体外扩增目的基因ha2、il-15及ires序列，根据牙龈素-血凝素基因编码区的核心功能区ha2(genbank号：ha2gi:u15282)、sd大鼠il-15基因(genbank号：il-15gi：af015719)及ires序列设计并合成如下引物：(引物合成工作由上海(生工)生物工程有限公司完成)。

表1：ha2、ires和il-15基因的引物序列

注：加框部分为保护碱基；下划线部分为酶切位点：nhei：gctagc、xhoi：gagctc；斜线部分为kozak序列。

分别以牙龈卟啉单胞菌的总dna、sd大鼠总rna逆转录为cdna、pires2-egfp为模版，pcr扩增ha2、il-15、ires序列，获得的目的片段分别进行凝胶电泳回收纯化，通过拼接获得ires-il-15，中间产物经凝胶电泳回收纯化，与ha2进行拼接，获得目的基因片段ha2/il-15，产物经凝胶电泳回收纯化。

将步骤(1)中获得的ha2/il-15基因片段与pvax1质粒分别进行双酶切，酶切产物分别进行纯化，酶切后的目的片段与质粒进行dna连接，构建pvax1-ha2/il-15重组质粒，将上述重组质粒转化感受态细胞dh5α，重组质粒酶切鉴定正确后送dna测序，序列如seqid:1所示；为ha2/il-15。在seqid:1所示的序列中：1-12位为kozak序列与限制酶切位点，13-15位为起始序列，16-423位为ha2序列，424-1014位为ires序列，1015-1503位为il-15序列，1504-1509位为限制酶切位点。动物实验表明，用本发明将靶标基因ha2和il-15构建的dna疫苗免疫sd大鼠，能成功诱导在唾液中产生特异性siga的抗ha2抗体，进而诱导动物机体产生免疫应答。本发明构建的dna疫苗具有较好的免疫原性，可抑制sd大鼠牙周炎的发生。本发明安全性高，能表达天然抗原，免疫应答持久，有效防治了牙周炎的发生。本发明方法简单，生产成本低廉，易于推广。

因此，第三方面，本发明还提供了上述的dna疫苗在防治牙周炎或者疫苗中的用途。

此外，本发明还提供了一种药物或疫苗，包含上述本发明所述的dna疫苗以及药学可接受载体。

附图说明

图1是以sd大鼠的总rna逆转录的cdna为模版，克隆菌毛蛋白基因il-15基因电泳鉴定图；其中，1为il-15扩增产物，m为bm2000dnamarker。

图2是以牙龈卟啉单胞菌w83型菌株基因组为模版，克隆牙龈素-血凝素基因编码区的核心功能区ha2基因电泳鉴定图；其中，1为ha2扩增产物，m为bm2000dnamarker。

图3是以pires2-egfp为模版，克隆的ires序列的电泳鉴定图；其中1为ires序列，m为bm2000dnamarker。

图4是重组质粒pvax1-ha2/il-15结构示意图。

图5是pvax1-ha2/il-15质粒的nhei、xhoi双酶切鉴定图；其中m为1kbladderdnamarker，1为pvax1-ha2/il-15质粒的酶切产物。

具体实施方法

下面结合实施例对本发明进行详细阐述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。

本发明用以构建真核表达载体的基本骨架为pvax1质粒(购自美国invitrogen公司，贵州省高等学校口腔疾病研究特色重点实验室保存)；构建过程以及制备过程中，质粒扩增所用的宿主菌为e.colidh5a感受态细胞(购自上海生物工程有限公司)；插入的外源基因为：牙龈卟啉单胞菌w83型的ha2和sd大鼠il-15，以及ires序列(贵州省高等学校口腔疾病研究特色重点实验室保存)。

实施例1：防治牙周炎dna疫苗—pvax1-ha2/il-15的构建

步骤一、牙龈卟啉单胞菌w83型的培养

将冻存的牙龈卟啉单胞菌w83型(贵州省高等学校口腔疾病研究特色重点实验室保存)划线培养于bhi血琼脂培养板(购自北京索莱宝生物科技有限公司)上，培养条件为37℃厌氧箱(80％n2，10％h2，10％co2)，避光复苏4-7天，观察到黑色菌落生长至1mm左右挑取平板上长出的单菌落接种至含bhi液体培养基(商品化平面培养基，购自上海恒远生物科技有限公司)中，置于厌氧培养箱中培养1-2天，观察到液体变浑浊，有少量菌体沉淀，收集菌液用于后续试验。

步骤二、牙龈卟啉单胞菌w83型菌株基因组的获得

使用苯酚-氯仿法提取细菌基因组dna。试剂选用katara生物科技有限公司细菌基因组提取试剂盒，并参考试剂盒说明书进行基因组提取操作如下：

1、取上述步骤一收集的富含牙龈卟啉单胞菌w83型菌株的菌液10ml，3000rpm，10min，收集菌体；

2、加入sinⅰ清洗菌体，3000rpm，弃上清；

3、根据菌体量加入sinⅱ，加入1/10溶菌酶，37℃放置一夜；

4、加入终浓度为2％sds，55℃-60℃放置1h至澄清；

5、加入等体积的tris-平衡酚，上下颠倒混匀，放置几分钟，12000rpm，10min；

6、取上清，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇，上下颠倒混匀，放置几分钟，12000rpm，10min，重复一次；

7、取上清，加入1/10sinⅲ，加入等体积异丙醇，-20℃放置10min，12000rpm，10min；

8、wb漂洗2次，12000rpm，2min，56℃烘箱放置3min，eb洗脱，获得清液，得到牙龈卟啉单胞菌w83型菌株基因组dna样品溶液，电泳及测序验证。

9、紫外分光光度计下测量od260/280(光密度)及浓度，-80℃保存。

步骤三、pires2-egfp及pvax1质粒的提取

1、pires2-egfp的培养：划线接种于lb固体培养基(含1‰氨苄霉素，amp)上，过夜挑取单克隆于含3ml肉汤(lb)液态培养基(含1‰氨苄霉素)的培养管中，37℃280rpm摇床培养过夜。

2、pvax1的培养：划线接种于lb固体培养基(含1‰卡那霉素，kana)上，过夜挑取单克隆于含3ml肉汤(lb)液态培养基(含1‰卡那霉素，kana)的培养管中，37℃280rpm摇床培养过夜。

以axygen质粒提取试剂盒提取质粒，步骤如下：

1、收集菌体：菌液，5000rpm，10min，弃上清，加入6mlddh2o，5000rpm，10min，清洗菌体，弃上清；

2、加溶液p1500μl悬浮沉淀，震荡器混匀15s后，室温静置5min；

3、加溶液p2500μl，反复颠倒7-10下，室温静置5min；

4、加溶液p3700μl，反复颠倒至絮状沉淀不再增多，12000rpm，15min；

5、收集上清至离心柱内，10000rpm，1min，弃滤液；

6、加去蛋白液pe500μl，10000rpm，1min，去蛋白；

7、加漂洗液wb700μl，10000rpm，1min，重复漂洗一次，空离一次，吸附柱放至干净的ep管内，56℃静置5min；

8、加30μl洗脱液eb(56℃预热)，静置2min，收集(12000rpm，1min)，获得清液，得到pvax1质粒dna样品溶液。

9、紫外分光光度计下测od260/od280及浓度，-80℃保存。

步骤四：sd大鼠总rna的获取及逆转录

a:取6-8周健康的雌性sd大鼠一只，取其肝脏，置于1.5ml去酶的ep管中，称量(事先称量该ep管的重量)m(肝脏)＝m(放置肝脏后总量)-m(未放置肝脏ep管)。每个ep管中肝脏不超过1g。

b:向组织内加1ml的trizol，-80℃过夜。

c:使用trizol法提取sd大鼠肝脏内总rna，

紫外分光光度计测得od260/280＝1.90，浓度＝1308.8ng/μl

利用加尾法的逆转录试剂盒进行逆转录：

表2：20ul逆转录反应体系

注：rna总量小于1μg即1000ng

逆转录反应条件：37℃15min，85℃5sec，4℃∞。所得逆转录产物-80℃保存。

步骤五、牙龈素-血凝素基因编码区的核心功能区ha2基因和il-15的克隆和载体构建

为获得牙龈素-血凝素基因编码区的核心功能区ha2基因和il-15以及ires序列，分别以上述基因组dna及质粒pires2-egfp为模板，设计合成引物。

1、ires片段的扩增

以iresf端为上游引物；以iresr端为下游引物，以已构建好的pires2-egfp为模版，扩增序列ires.

表3：反应体系及反应条件

反应产物纯化回收后得到ires片段。

2、ires与il-15片段进行拼接

以片段ires与il-15片段为模版，以iresf端为上游引物，以il-15的r端为下游引物，进行拼接：

表4：反应体系及反应条件

结果进行纯化回收，准备与ha2进行拼接。

3、ha2/il-15片段的拼接

以2的纯化产物以及ha2片段为模版，上游引物选择ha2f端，下游引物选择il-15r端，进行pcr扩增。

表5：反应体系及反应条件

产物进行胶回收，为下一步酶切做准备，同时将片段进行测序，修饰突变基因，测序及修饰工作由上海生物工程有限公司进行。

步骤六、pcr产物及质粒的酶切反应

根据步骤三获得的pvax1质粒和步骤四获得的pcr产物，分别用xhoi和nhei双酶切。酶切反应体系如表6所示：

表6：pcr产物及pvax1质粒的酶切反应体系

体系配置完成后，于37℃恒温酶切3h，1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。

步骤七、目的片段与载体片段的纯化

将步骤六双酶切后获得的pcr产物和pvax1质粒，按照axypreppcr纯化试剂盒的说明方法回收纯化产物，步骤如下：

1、加入pcr产物三倍体积bufferpcr-a混匀，过柱，12000rpm，1min；

2、柱内加入700μlbufferw210000rpm，1min，重复1次；

3、空离1min，56℃烘箱静置至乙醇挥发，加入ddh2o(56℃预热)，静置5min，12000rpm，1min，得到ha2/il-15和pvax1质粒目的基因的线性片段，-20℃备用。

步骤八、目的片段与载体连接

将步骤七纯化后得到的目的基因片段ha2/il-15连接至载体pvax1质粒上，其连接体系如表7所示：

表7：目的片段与载体连接体系

上述连接混合液16℃水浴过夜连接，获得pvax1-ha2/il-15重组质粒。

步骤九、重组质粒转化感受态细胞

将步骤八连接好的pvax1-ha2/il-15重组质粒转入感受态dh5α细胞中，步骤如下：

1、-80℃中取出感受态细胞2支，置于冰浴中；

2、向感受态细胞中各加入连接产物10μl，轻轻旋转混匀内容物，冰浴中静置30min；

3、将离心管置于42℃水浴90s，快速转移至冰浴冷却2min，尽量静置；

4、超净台内向离心管中加入500μl无菌、不含抗生素的lb培养基，混匀置于37℃恒温摇床45min，复苏菌液；

5、菌液3000rpm，10min收集菌体，加入50μl重新混匀菌体；

6、超净台内将菌液接种至含有amp抗性的lb培养基平板中，37℃培养过夜，得到pvax1-ha2/il-15重组质粒的感受态dh5α细胞菌液。

7、挑选单菌落，置于加入500μl抗性液体培养基的1.5ml离心管中，37℃恒温摇床4-6h，观察长势，挑出扩增的菌体进行菌液pcr。

步骤十、菌液pcr以及重组子的筛选

将步骤九挑选出扩增的菌体进行菌液pcr，筛选重组子，菌液pcr体系如下：

表8：菌液pcr体系

pcr反应扩增条件为：

pcr产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件：100v，30min，结果置于凝胶电泳成像系统进行分析，筛选重组子进行保菌及扩增，挑选8个重组子进行测序，筛选阳性克隆进行测序，测序工作由上海英潍捷基贸易有限公司完成。

根据测序结果及载体序列，绘制dna疫苗图谱(如图4)及全序列如seqid:1所示。

实施例2：牙周炎dna疫苗免疫sd大鼠的实验研究

1、质粒疫苗的大量制备

用promega质粒大提试剂盒纯化回收pvax1-ha2/il-15及空载体pvax1。

2、6只6-8周雄性sd大鼠随机分为3大组，实验组：a组，对照组：b组、c组，每组各6只，具体如下：

a组：pvax1-ha2/il-15鼻腔滴注组；

b组：pvax1鼻腔滴注组；

c组：生理盐水鼻腔滴注组；

3、免疫方案：每周免疫一次，连续免疫3周，每只大鼠免疫剂量为200μg/次。

4、样本采集：在免疫前1天及免疫后1～9周采集唾液样本。

2％硝酸毛果芸香碱(0.1g/ml)按照0.3mg/100g的剂量对动物进行腹腔注射，大约3min后开始收集唾液约500μl，4℃,12000rpm×15min，收集上清，弃去唾液中杂质后放入-80℃冰箱保存备用。

5、样本检测：交叉连续稀释分析法确定抗原包被的最佳浓度、酶标抗体的最佳工作浓度及待测样品最佳稀释浓度：

通过交叉连续稀释分析法来确定抗原包被的最佳浓度、标本最佳稀释浓度以及酶标抗体的最佳工作浓度：抗原包被浓度为2.5μg/ml；酶标抗体最佳工作浓度过氧化酶标记羊抗大鼠iga(1:4000)。唾液最佳稀释浓度1:4。

6、实验结果

6.1、唾液中siga型抗ha2抗体水平的观察见表9.

表9随时间变化各组大鼠唾液中siga型抗ha2抗体(od450，n＝6)值结果

注：*表示与空载组及阴性对照组相同时间点分别比较，均存在差异(p<0.05)

从表9可知，免疫前各组大鼠唾液中siga型抗ha2抗体差异无统计学意义(p>0.05)，实验组(a组)在初始免疫后的1周抗体水平开始有上升趋势，第5周达高峰，b组和c组变化不明显；免疫后1周至8周,实验组分别与空载组及阴性对照组相同时间点比较，均存在差异(p<0.05)，且差异有统计学意义。

实验结果表明，用本发明构建的牙周炎dna疫苗pvax1-ha2/il-15免疫sd大鼠，能成功诱导唾液中特异性siga型抗ha2抗体的产生，可诱导动物产生免疫应答，具有较好的免疫原性，进而可以抑制sd大鼠牙周炎的发生。

sequencelisting

<110>遵义医学院

<120>防治牙周炎的dna疫苗

<130>1

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<170>patentinversion3.3

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<212>dna

<213>人工序列

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