一种马链球菌兽疫亚种保护性抗原MAP及其制备方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体的，本发明涉及一种马链球菌兽疫亚种保护性抗原map及其制备方法。

背景技术：

链球菌是一种常见的致病菌，根据细胞壁多糖抗原不同，可分为a、b、c…、v(缺i和j)20个群，其中a群链球菌(groupastreptococci,gas)主要对人致病，其他群主要对动物致病。b群链球菌(groupbstreptococci,gbs)和c群链球菌(groupcstreptococci,gcs)等群溶血性链球菌主要感染家畜和家禽，如gbs主要引起牛乳腺炎和猪脓疱症；gcs则主要引起马腺疫以及羊和猪败血症。

马链球菌兽疫亚种(streptococcuszooepidemicus,sez)是gcs的一种，为β溶血性链球菌，目前国内对于sez的研究还有待进一步的深入。sez主要引起败血症、脑膜炎、心内膜炎、化脓性关节炎，还可引起马、猪、羊、牛等哺乳动物的乳房炎。此外，sez还可以感染人，主要通过接触感染sez的动物、排泄物等或其他日常工作而发生感染。虽然抗生素被广泛用于预防和治疗链球菌病，但随之而来的则是耐药性的产生和兽药残留等问题。因此，开发出效果较好的疫苗既可以解决抗生素滥用的问题，又有利于链球菌的防治。目前，对于sez毒力因素和保护性抗原的研究较少，从而很难开发出有效的亚单位疫苗来控制sez对动物的感染。因此提供一种保护性抗原对于sez的防治意义重大。

技术实现要素：

有鉴于此，针对sez感染及防治问题，本发明提供了一种马链球菌兽疫亚种保护性抗原map及其制备方法。

本发明第一方面提供了一种马链球菌兽疫亚种保护性抗原map，为sezmap重组蛋白，由map基因编码，由807个氨基酸残基组成，分子量为87.02kda，氨基酸序列如seqidno.2所示。

本发明第二方面提供了上述链球菌保护性抗原map的制备方法，包含以下步骤：

s1、pcr扩增：使用马链球菌兽疫亚种基因组为模板，使用引物进行pcr扩增克隆map基因；

s2、与载体连接：pcr产物和pet-32a载体通过限制性酶酶切后连接；

s3、转化和诱导：将上述连接好的载体转化大肠杆菌后，待其od为0.6～0.8时，加入终浓度0.4～1.0mmol/liptg后诱导3-5h；

s4、纯化：离心收集细菌沉淀并重悬，破碎后离心收集上清液，取上清液进行纯化，获得纯化的重组蛋白。

优选的，所述引物为：

正向引物：5’-cccggatccggtcaagcgcatttctgat-3’；

反向引物：5’-ctcaagctttgaggcaaccttggaga-3’。

更加优选的，所述正向引物和反向引物各有1个酶切位点，分别为bamhi酶切位点和hindiii酶切位点。

本发明第三方面提供了上述马链球菌兽疫亚种保护性抗原map在制备马链球菌兽疫亚种疫苗中的应用。

本发明第四方面提供了上述马链球菌兽疫亚种保护性抗原map制备马链球菌兽疫亚种疫苗的方法，步骤包括：将成功表达并纯化的sezmap重组蛋白与免疫佐剂乳化后作为疫苗，sezmap重组蛋白浓度为100-200μg/ml。

本发明的有益效果为：

本发明提供一种马链球菌兽疫亚种保护性抗原map及其制备方法，采用该蛋白制备的疫苗的特异性强，通过克隆、诱导表达、层析纯化后得到的map重组蛋白。重组map蛋白可以和sez感染康复猪血清发生良好的免疫反应，重组map蛋白二免小鼠血清经elisa检测显示，抗体滴度明显高于对照组，且所产生的抗体也以igg1为主。重组map蛋白免疫小鼠后可以提供较高的保护效力，anti-map二免小鼠血清可以为小鼠提供明显的被动免疫保护。在sez感染的小鼠组织内提取分离的sez其map基因的转录水平要高于体外培养的sez的转录水平，map抗体还可以诱导高水平的杀菌能力。流式细胞术试验中，经map抗体处理细菌的平均荧光强度与空白对照组相比有较大的提升，证明map蛋白分布于sez的表面。

附图说明

图1.表示map蛋白的sds-page和westernblot结果。泳道m为蛋白预染marker。泳道1～3分别为重组大肠杆菌非诱导、诱导表达map蛋白和ni-nta纯化后的map蛋白。泳道4为rmap蛋白与sez康复期血清的免疫印记分析结果。结果表明rmap具有良好的免疫原性。

图2.表示重组map蛋白免疫小鼠后在小鼠体内诱导产生的免疫反应结果。(a)免疫组的igg水平显著高于阴性对照组的抗体水平。(b)在map诱导的抗体反应中，igg1占主导地位，其抗体滴度要显著高于igg2a。

图3.表示免疫组、阳性对照组和阴性对照组的小鼠经sezc55138株攻毒后，小鼠的存活率。结果表明map实验组和阳性对照组均能够为小鼠提供高水平的免疫保护力，而阴性对照组则全部死亡。

图4.表示map抗体和sez灭活疫苗免疫血清(阳性对照组)均能较好的为小鼠提供保护，而正常血清(阴性对照组)不能为小鼠提供被动保护。

图5.表示小鼠全血致死实验分析，sez灭活疫苗免疫血清(阳性对照组)和map免疫血清的杀菌能力均显著地高于健康小鼠血清(阴性对照组)，实验组仅略低于阳性对照组。

图6.表示定量pcr分析结果，结果表明，map基因在小鼠体内的转录水平要显著高于体外培养的sez的转录水平。

图7.流式细胞术分析map在sez的表面分布。结果表明，二免血清孵育后的荧光强度要明显高于空白对照组，表明map蛋白位于sez的表面。

图8.表示粘附抑制实验结果，结果表明sec_205能够抑制sez对hep-2细胞的粘附能力，相对于对照组而言，抑制率为27.2％。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明提供的一种马链球菌兽疫亚种保护性抗原map及其制备方法予以进一步说明。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。

本发明的实施例中所用的菌株及其生长条件如下：

菌株采用sezc55138菌株；培养基为添加5％胎牛血清的tsb培养基或者tsa培养基；在37℃震荡培养约8h，或od600达到0.6～1.0。

所述tsb培养基、tsa培养基可市场购买得到，或按公知常规方法自行配置后使用。

本发明的实施例中所用的载体为大肠杆菌pet-32a，感受态细胞为大肠杆菌bl21。

本发明实施例中采用的sezc55138菌株、pet-32a载体、胎牛血清和大肠杆菌bl21感受态均为市购产品。

实施例一

本实施例提供了一种马链球菌兽疫亚种保护性抗原map，为sezmap重组蛋白，由map基因编码，由807个氨基酸残基组成，分子量为87.02kda，氨基酸序列如seqidno.2所示。

采用该蛋白制备的疫苗具有特异性强，效果好，副作用小等优点。该蛋白具有典型的细胞锚定域，是一种细菌表面蛋白，适合用于制备疫苗。

进一步的，本实施例还提供了上述马链球菌兽疫亚种保护性抗原map的制备方法，具体步骤包括：

1)pcr扩增：以sezc55138基因组为模板，采用引物常规条件下进行pcr扩增，所述引物为：

正向引物(seqidno.3)：

5’-cccggatccggtcaagcgcatttctgat-3’，划线部分为bamhi酶切位点；

反向引物(seqidno.4)：

5’-ctcaagctttgaggcaaccttggaga-3’，划线部分为hindiii酶切位点。

2)与载体连接：采用相同的限制性内切酶对pcr产物和pet-32a载体进行酶切，回收后用t4连接酶进行连接，得到重组载体。

3)转化和诱导：将重组载体转化进入大肠杆菌表达菌株后，待其进入指数生长期，加入终浓度0.4～1.0mmol/liptg诱导3h。

优选地，所述大肠杆菌表达菌株为bl21感受态细胞，加入的iptg终浓度为1mm。

所述引物由武汉金开瑞生物工程技术服务有限公司合成。所述限制性内切酶为bamhi和hindiii。

iptg即异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，是β-半乳糖苷酶的活性诱导物质。基于这个特性，带有lacz基因载体dna以lacz缺失细胞为宿主进行转化时，它可以作为具有lac或tac等启动子的表达载体的表达诱导物使用。

4)纯化：将菌液离心收集菌体，用无菌pbs重悬后经高压1000bar破碎，离心收集上清，上清液经过ni-nta层析柱进行纯化，获得纯化的map重组蛋白。

所述纯化是在akatafplc上利用填装有ni-nta树脂的蛋白纯化层析柱纯化重组map蛋白。

5)westernblot检测：纯化后的重组蛋白，经转膜后，将sez感染康复猪血清作为一抗，山羊抗猪hrp-igg作为二抗，反应后经ecl显色。

实验结果：pcr得到1887bp的map碱基序列(seqidno.1)，表达得到的map重组蛋白是由807个氨基酸残基构成(seqidno.2)，蛋白分子量为87.02kda。比较诱导和非诱导培养的细菌，可以证明成功表达了目的蛋白，且目的蛋白的条带大小与预测的大小一致。通过ni-nta亲和层析的方式获得纯化的重组蛋白，通过westernblot实验表明，该蛋白与感染sez的康复期猪血清表现出良好的免疫反应性(见图1)

实施例二、抗体滴度测定

血清滴度经elisa测定后，将纯化的重组蛋白于4℃过夜包被，二免10天后的小鼠采血分离血清，血清经梯度倍比稀释后，每个稀释度取100μl加入酶联板，37℃反应后加入山羊抗鼠hrp-igg，用酶标仪读取od值。取od值大于对照血清平均od值+3倍方差sd(标准差)的血清最低稀释倍数作为血清抗体。

试验结果：实验组map特异性igg水平明显高于阴性对照组(图2a)。

为了揭示免疫反应类型，利用elisa检测igg1和igg2a对亚类反应进行了评估。igg1与th2类反应相关，而igg2a与th1类反应相关，该实验在一定程度上反映了免疫反应的类型。

结果表明rmap可以引起特异的免疫反应，同时rmap可诱导igg1和igg2a的高水平抗体滴度表达且igg1>igg2a(图2b)。

实施例三、小鼠免疫接种与攻毒试验

1、30只6周龄km雌鼠，随机分成3组，每组10只；

2、实验组：50μg纯化的rmap用montanidegel01pr(seppic，france)佐剂乳化后，腹腔注射免疫第一组小鼠，14天后，以同样的方式第二次免疫小鼠；

3、阳性对照组：将c55138灭活后经montanidegel01pr(seppic，france)佐剂乳化后，以1×10⁹cfu/ml免疫小鼠，采用腹腔注射的方式，间隔14日后，同样的方式进行二次免疫；

4、阴性对照组：第二组小鼠腹腔注射经montanidegel01pr(seppic，france)佐剂乳化的pbs做对照；

5、所有小鼠二次免疫10天后，尾静脉采血分离血清，然后使用sezc55138菌株(2×10⁵cfu/ml)攻毒；

6、观察并记录所有小鼠的生长情况。

实验结果：1)阳性对照组的小鼠基本未表现特别严重的临床症状，在整个攻毒期只有1只小鼠出现死亡。

2)阴性对照组的小鼠在攻毒后第二天即开始出现死亡，存活的小鼠表现出明显的临床症状，例如被毛零乱，对外界刺激反应迟钝，不好动等，并在攻毒后5天内全部死亡；

3)实验组的10只小鼠，攻毒后第三天开始出现死亡，存活的小鼠表现出轻微的临床症状，如精神状态较差，消瘦，在6天内即全部恢复正常，最终有2只小鼠死亡(见图3)。

结果表明：重组rmap蛋白可以较好地保护小鼠抵抗sez强毒株的攻击。

实施例四、被动保护试验分析

为了证实是归功于map特殊的刺激免疫反应，用anti-rmap小鼠血清被动免疫小鼠，然后再实行攻毒试验。

1、30只6周龄km雌鼠，随机分为3组，每组10只；

2、实验组：用100μlanti-rmap二免的小鼠血清静脉注射免疫第一组小鼠；

3、阳性对照组：用sez灭活疫苗二免的小鼠血清静脉注射第二组小鼠；

4、阴性对照组：用正常小鼠的血清静脉注射第三组小鼠；

5、免疫24h后，所有小鼠用sezc55138攻毒(2×10⁵cfu/ml)；

6、观察并记录所有小鼠的生长情况。

实验结果：1)阳性对照组小鼠在攻毒试验中全部存活下来；

2)实验组小鼠在攻毒后有一些临床表现，如精神萎靡，被毛粗乱，对刺激反应迟缓，但小鼠最终的存活率达80％。

3)阴性对照组小鼠则在攻毒后仅存活1只(见图4)。

结果表明map对小鼠有明显的被动免疫保护能力。

实施例五、全血致死量分析

为了测定anti-rmap抗体的杀菌活性，采集新鲜健康小鼠血液经肝素抗凝，与使用anti-rmap或sez灭活疫苗免疫前后小鼠血清进行混合，再与sez孵育后进行评估。

1、待sezc55138菌株生长到指数中期，离心后收集菌体，用pbs调整细菌浓度为10⁴cfu/ml；

2、阳性对照组：900μl健康小鼠肝素抗凝全血，与100μlsez灭活疫苗免疫后血清混合后作为阳性对照；

3、阴性对照组：900μl健康小鼠肝素抗凝全血，与100μlsez灭活疫苗免疫前血清混合后作为阴性对照；

4、实验组：900μl健康小鼠肝素抗凝全血，与100μlrmap免疫后血清混合后作为实验组；

5、分别向各混合液中加入100μlsez菌液，于37℃恒温摇床中孵育90min；

6、每组取100μl孵育后样品，涂布于tsa平板中，每组进行3个重复，计算孵化前后存活的细菌数量；

7、存活率为处理后存活的细菌数量相对于加入的细菌数量的百分比。

实验结果：阴性对照组sez存活率达72.6±3.694％；阳性对照组sez存活率仅为10.7±1.498％；实验组sez存活率为63.9±2.954％(见图5)。

结果表明：anti-rmap可以诱导高水平的杀菌能力。

实施例六、定量pcr检测体内诱导基因的表达水平

为了评估sezmap基因在小鼠体内外的表达水平，通过荧光定量pcr技术定量检测map基因体内外的转录水平。

1、体内细菌从感染sez的小鼠脾脏内获得，无菌收集脾脏组织，碾磨后于4℃，850×g离心5min，取上层清液于4℃，15500×g离心5min，沉淀即为脾脏组织内的细菌；体外培养的细菌待其生长到指数中期后离心收集沉淀即可；

2、提取细菌总rna；

3、将rna逆转录为cdnas，以cdna样品为模板进行定量pcr反应，所有反应进行三个重复；

在实时荧光定量pcr中，使用下述引物对map基因进行定量分析：

正向引物(seqidno.5)：5’-tcgtgttgttgaccctg-3’；

反向引物(seqidno.6)：5’-ggttagcaagcgagca-3’；

在实时荧光定量pcr中，使用下述引物对16srrna基因进行定量分析：

正向引物(seqidno.7)：5’-atccgaactgagattggc-3’；

反向引物(seqidno.8)：5’-cccttatgacctgggcta-3’；

实验结果：map基因在sez感染的小鼠体内的转录水平比体外培养的转录水平高很多(见图6)。

实施例七、流式细胞术分析

1、用无菌pbs(含1％bsa)重悬细菌，将细菌浓度调整为1.0×10⁶cfu/ml，取100μl；

2、实验组加入经rmap免疫的小鼠血清100μl，对照组加入经pbs免疫的小鼠血清100μl，4℃孵育15min，然后室温孵育30min；

3、5000rpm/min离心5min，收集菌体；

4、用无菌pbs(含1％bsa)洗涤3次，加入抗体200μl，4℃孵育15min，然后室温孵育30min；

5、用无菌pbs(含1％bsa)洗涤3次，用500μl无菌pbs(含1％bsa)重悬，加入到流式细胞管中，通过流式细胞仪检测。(见图7)

实验结果：对照组细菌平均荧光强度相差不大，而实验组细菌的平均荧光强度有较大的提升，表明map蛋白分布于sez的表面。

实施例八、hep-2细胞粘附抑制试验

为检测重组蛋白map对sez粘附hep-2细胞的影响，通过hep-2细胞的粘附试验进行检测，主要步骤如下：

1、在24孔板中加入含10％胎牛血清的dmem培养细胞，将其置于37℃，5％co2浓度的细胞培养箱中培养，待其长至80％左右；

2、使用预冷的pbs/bsa洗涤细胞3次；

3、每孔加入200μg/ml的纯化的rmap孵育2h，相同的细胞加入200μg/ml的bsa孵育作为对照组；

4、孵育完成后，用pbs/bsa洗涤3次，然后向各孔中加入1ml5×10⁷cfu/ml的sezc55138株在37℃，5％co2条件下孵育2h；

5、用pbs/bsa洗去没有粘附的细菌，然后用1mlpbs(含0.2％的tritonx-100)将细胞吹散，稀释后平板计数；

6、rmap对sez粘附hep-2细胞的抑制率通过如下公式计数：

抑制率＝[1-(map处理组的细菌数/bsa处理组的细菌数)]×100％。

实验结果：rmap能够抑制sez对hep-2细胞的粘附作用，相对于对照组bsa处理而言，rmap对sez的粘附抑制率为27.2％(见图8)。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

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