本发明属于生物工程领域，具体涉及全量程羊或兔抗人crp抗体的制备方法。
背景技术：
c反应蛋白（crp）是典型的急性期反应蛋白与重要的免疫抵抗反应调节者。人c反应蛋白基因由两个外显子与一个内含子组成。由206个氨基酸组成的c反应蛋白，分子量是23kd。由五个相同的亚基依靠非共价键形成的环状五聚体，这一特征性结构使其归类于穿透素家族。人类crp是由肝脏产生。在正常情况下，c反应蛋白的表达水平很低的，但是在受感染刺激后，它的表达水平可以在几个小时以后提高到10000倍。小鼠的c反应蛋白不是个急性反应蛋白，所以表达水平很低；crp是一种能和肺炎链球菌的荚膜c多糖结合，由5个相同的亚单位（23kd）以非共价键聚集形成的环状五聚体蛋白，分子量为115kd，半寿期为19h，多由白细胞介素-6（il-6）等炎性分子刺激肝脏细胞合成。正常人血清中crp含量极微。一般新生儿血清crp水平小于2mg/l，大于此值即与细菌感染的严重程度有关；儿童和成人≤10mg/l；10~99mg/l提示局灶性或浅表性感染，≥100mg/l提示败血症或侵袭性感染等严重感染。crp是急性时相反应蛋白之一，在感染发生后6~8h开始升高，24~48h达到高峰。比正常值高几百倍甚至上千倍，升高幅度与感染的程度呈正相关。在疾病治愈后其含量急速下降，一周内可恢复正常。病毒感染时，crp不增高（除了一些严重侵袭导致组织损伤的病毒如腺病毒(adenovirus)、疱疹病毒等）。临床上crp一般作为鉴别细菌或病毒感染的一个首选指标，用于自身免疫性及感染性疾病的诊断和监测，以及抗生素(antibiotic)疗效观察等。hs-crp并不是一种新的crp，其实是根据测定方法更敏感而命名。临床常规测定普通crp的方法检测线性一般为3~200mg/l，因缺乏较高的灵敏性已不足以预测心血管事件的危险。近年相继采用胶乳增强的免疫比浊法等技术大大提高了分析的灵敏度（检测低限为0.005~0.10mg/l不等），在低浓度crp（如0.15~10mg/l）测定范围内有很高的准确度。这些方法所进行测定的crp称为高敏感（high-sensitivity）或超敏感（ultrasensitive）crp，国内一般简称为超敏或高敏crp（英文缩写为hs-crp）。人群中血清hs-crp水平分布通常没有性别和种族差异。美国中年人hs-crp水平的10%、25%、50%、75%和90%临界值分别为0.3、0.6、1.5、3.5和6.6mg/l。此外，美国的四项研究发现，男性和没有采用激素替代治疗（hrt）的妇女hs-crp五分之一区间分布极为相似，临界值分别为<0.5、0.5~1.0、1.0~2.0、2.0~4.0和>4.0mg/l，目前已被推荐使用。一般认为，我国健康人群hs-crp水平的中位数范围为0.58~1.13mg/l。多数研究认为hs-crp在3mg/l以下，冠状动脉事件发生危险较低。美国疾病控制预防中心（cdc）与美国心脏协会（aha）建议，可根据hs-crp水平对患者进行心血管病危险分类：即<1mg/l为相对低危险，1.0~3.0mg/l为中度危险，>3.0mg/l为高度危险。
简而言之，当前人类crp的检测已进入到全量程的阶段，一次人体抽血检测需要从0.5—300mg/l，这样就可以预测因crp浓度低冠心病的风险，也可以监察心血管病、肺部感染、急性胰腺炎等，又可通过crp的急速上升判定细菌、病毒感染等。
crp的测定方法，一般分为定性和定量两种。定性方法有，用纯化了的肺炎球菌与病人血清反应的沉淀法、肺炎球菌荚膜肿胀试验、特异性抗血清与crp反应的毛细管沉淀试验、补休结合试验等。但它们的灵敏度低，只用于定性检测。定量检测的有：放射免疫（ria），荧光免疫（fia），酶标免疫（elisa）、速率散射比浊法（ina）和乳胶增强透射比浊法（ita）。乳胶增强透射比浊法是目前医院较多使用的方法之一。而乳胶增强透射比浊法最为重要的就是crp免疫比浊试剂的制备了。而制备乳胶增强透射比浊crp试剂最为重要和关键的就是原料—羊或兔抗人crp抗血清和抗体的制备。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种能免疫出高效价的crp抗血清，纯化出效价高、特异性强的羊或兔抗人crp抗体的全量程羊或兔抗人crp抗体的制备方法。
为达到上述目的，本发明是通过以下的技术方案来实现的。
全量程羊或兔抗人crp抗体的制备方法，包括以下步骤：
（1）免疫出羊或兔抗人高效价的crp抗血清：
①抗原制备与处理：从人体液或组织中分离提纯crp蛋白抗原，与佐剂混合并；
②乳化：采用高速剪切法乳化抗原；
③按免疫程序免疫羊或兔；
④对免疫后的羊或兔采血；
（2）纯化出羊或兔抗人crp抗体：
①盐析法：用辛酸、硫酸铵三步沉淀法，将羊或兔抗c反应蛋白（crp）抗血清中的特异性抗体全部提取；
②蛋白g柱纯化：取盐析后的羊或兔抗人crp抗体，用结合缓冲液稀释，过滤，加入g柱中，收集流穿液，用结合缓冲液加g入柱中，待全部流出，加洗脱缓冲液，同时收集洗脱液；
（3）中和稀释：将步骤（2）纯化后的羊或兔抗人crp抗体，用中和缓冲液稀释成全量程crp抗体原料：
（4）冻干制得。
进一步地所述步骤（1）中佐剂为弗氏佐剂。佐剂的添加使抗原的免疫原性显著提高，经过前期试验发现，免疫抗体水平高于原有佐剂的2-4倍；改进的佐剂物理性状也显著改善，对动物注射部位的刺激作用明显减轻，未见明显的不良反应。
在免疫动物前，抗原需与佐剂混合并乳化，形成稳定的“油包水”和“水包油”乳剂。前者有利于延长抗原在体内的存留时间和提高抗原的免疫原性，但对局部组织具有很强的刺激反应，通过在容器内高速剪切的方法乳化抗原，克服了现有乳化方法造成抗原的损失大、乳化不完全、费时费力、抗原易破坏的缺点。
进一步地所述步骤（1）中乳化过程中用冷却水对乳化容器降温。避免乳化过程中升温对抗原的破坏。
进一步地所述步骤（1）中免疫程序中，首次免疫选择22个部位点注射，第二次至最后一次免疫注射部位选择20个部位点。其中，所述22个部位点分别为：后足窝各1点、颌下淋巴结左右各1点、腋窝周围左右各2点、股淋巴结周围各3点、背部脊柱左右两侧各4点。所述20个部位点分别为：颌下淋巴结左右各1点、腋窝周围左右各2点、股淋巴结周围各3点、背部脊柱左右两侧各4点。
注射部位和免疫程序是否科学合理，对抗体水平的高低至关重要。我们对现有免疫程序进行调整，增加了关键注射部位，对加强免疫的时间和剂量进行调整，经过试验发现，按我们改进的程序进行免疫，至少可以减少一次免疫，节省了一次免疫的抗原，动物的抗体上升速度和水平均有大幅度提高。
进一步地所述步骤（2）中盐析法的步骤为：
（s1）抗血清用4倍体积乙酸-乙酸钠缓冲液稀释，用0.1mnaoh调至ph4.5；
（s2）室温下滴加辛酸，搅拌30min，按每升溶液滴加25ml辛酸的比例滴加；
（s3）冷冻高速离心机8000~12000rpm离心15~30min，收集上清夜，弃去沉淀；离心过程中温度控制在2~8℃；
（s4）过滤上清液；
（s5）按上清液体积的l/10加入10×pbs，用5mnaoh调至ph7.4；
（s6）按每升溶液加277g硫酸铵，搅拌30min；
（s7）冷冻高速离心机4000~6000rpm离心10~20min，弃去上清液，收集沉淀；离心过程中温度控制在2~8℃；
（s8）沉淀用透析液溶解，透析脱盐。
进一步地，步骤(2)中，结合缓冲液为：10mmpbs含nan30.01%，ph7.2—7.4。
进一步地，步骤(2)中，洗脱缓冲液为：10mmnah2po4，150mmnacl含nan30.01%(重量百分比)，用盐酸调至ph2.8±0.04，其中所用盐酸为5mhcl。
进一步地，步骤(3)中，中和缓冲液：100mmpbs含nan30.01%(重量百分比)，ph8.0—8.5。
进一步地所述步骤（2）中取盐析后的羊或兔抗人crp抗体，用结合缓冲液稀释后经0.22nm滤膜过滤。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点在于：
能解决全量程crp检测原料--羊抗c反应蛋白（crp）抗体的生产和制备，填补了国内的空白。经下游ivd行业多家crp试剂盒厂家的应用，质量完全达到国际同行业水平；使用我们生产和制备的crp抗体生产的试剂，检测人血清量程可达0.3mg/l--300mg/l。
具体实施方式
下面结合实例对本发明作进一步的详细说明。
本发明中透析液购买自天津市标准生物制剂有限公司。
实施例1：全量程羊或兔抗人crp抗体的制备方法，包括以下步骤：
（1）免疫出羊或兔抗人高效价的crp抗血清：
①抗原制备与处理：从人体液或组织中分离提纯crp蛋白抗原，与弗氏佐剂混合并；
②乳化：采用高速剪切法乳化抗原；
③按免疫程序免疫羊或兔；免疫程序中，首次免疫注射部位选择22个部位点注射，第二次至最后一次注射选择20个部位点注射；所述22个部位点分别为：后足窝各1点、颌下淋巴结左右各1点、腋窝周围左右各2点、股淋巴结周围各3点、背部脊柱左右两侧各4点。所述20个部位点分别为：颌下淋巴结左右各1点、腋窝周围左右各2点、股淋巴结周围各3点、背部脊柱左右两侧各4点。
④对免疫后的羊或兔采血；
（2）纯化出羊或兔抗人crp抗体：
①盐析法：用辛酸、硫酸铵三步沉淀法，将羊或兔抗c反应蛋白（crp）抗血清中的特异性抗体全部提取；具体步骤如下：
（s1）抗血清用4倍体积乙酸-乙酸钠缓冲液稀释，用0.1mnaoh调至ph4.5；
（s2）室温下滴加辛酸，搅拌30min，按每升溶液滴加25ml辛酸的比例滴加；
（s3）冷冻高速离心机10000rpm离心30min，收集上清夜，弃去沉淀；离心过程中温度控制在2~8℃；
（s4）过滤上清液；
（s5）按上清液体积的l/10加入10×pbs（磷酸盐缓冲溶液，0.1m），用5mnaoh调至ph7.4；
（s6）按每升溶液加277g硫酸铵，搅拌30min；
（s7）冷冻高速离心机5000rpm离心15min，弃去上清液，收集沉淀；离心过程中温度控制在2~8℃；
（s8）沉淀用透析液溶解，透析脱盐。
②蛋白g柱纯化：取盐析后的羊或兔抗人crp抗体，用结合缓冲液稀释，经0.22nm滤膜过滤，加入g柱中，收集流穿液，用结合缓冲液加入g柱中，待全部流出，加洗脱缓冲液，同时收集洗脱液，得到纯化后的羊或兔抗人crp抗体；其中，结合缓冲液为：10mmpbs含nan30.01%，ph7.2—7.4；洗脱缓冲液为：10mmnah2po4，150mmnacl含nan30.01%(重量百分比)，用盐酸调至ph2.8±0.04，其中所用盐酸为5mhcl。
（3）中和稀释：将步骤（2）纯化后的羊或兔抗人crp抗体，用中和缓冲液稀释成全量程crp抗体原料：其中，中和缓冲液：100mmpbs含nan30.01%(重量百分比)，ph8.0—8.5。
（4）冻干制得。
通过紫外分光光度计对全量程crp抗体原料进行检测，紫外分光光度计752预热20分钟，调至280nm波长；针对三批次采用本实施例制得的crp抗体原料进行检测，测试结果为：原料抗体浓度在18-22mg/ml，相对偏差≤10%。
实施例2：与实施例1基本相同，所不同的地方如下：
（s3）步骤中，冷冻高速离心机8000rpm离心30min；
（s7）步骤中，冷冻高速离心机4000rpm离心20min。
实施例3：与实施例1基本相同，所不同的地方如下：
（s3）步骤中，冷冻高速离心机12000rpm离心15min；
（s7）步骤中，冷冻高速离心机6000rpm离心10min。
本发明按照上述实施例进行了说明，应当理解，上述实施例不以任何形式限定本发明，凡采用等同替换或等效变换方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。