细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶重组蛋白、其可溶性表达方法及其纯化方法和应用与流程

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶重组蛋白、其可溶性表达方法及其纯化方法和应用。

背景技术：

转二羟基丙酮激酶是磷酸戊糖途径非氧化阶段的关键酶，其主要作用在于调控磷酸戊糖途径产生5-磷酸核糖和尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，前者是细胞增殖过程中合成核苷酸不可缺少的原料，参与核苷酸、辅酶a和尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸等分子的合成代谢；后者是生物体内重要的还原当量，不仅维持谷胱甘肽于还原状态，而且作为供氢体直接参与多种代谢反应，广泛参与胞内信号转导、抗氧应激等。基于以上研究背景，本发明构建了编码细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶基因的原核表达质粒，转化入大肠杆菌表达系统，诱导其表达，并进行蛋白纯化，得到了该蛋白，为其免疫原性、组织定位以及酶学特性等功能研究奠定了基础，为包虫病治疗药物的研究提供了有效的药物靶点，并有望用于囊型包虫病患者的免疫诊断。

技术实现要素：

本发明通过基因工程技术，提供了一种细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶的原核表达载体pet30a-转二羟基丙酮激酶，利用该载体转化大肠杆菌（bl21-de3）实现了转二羟基丙酮激酶的高水平可溶性表达。并提供了一种亲和层析纯化方法，纯化出了大量的高纯度的重组转二羟基丙酮激酶，用于转二羟基丙酮激酶生化特性分析、功能的研究及囊型包虫病患者的免疫诊断。

本发明提供细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶重组蛋白，所述细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶重组蛋白的氨基酸序列为序列表seqidno.2。

作为优选，所述细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶重组蛋白编码的核苷酸序列为序列表seqidno.1中第42-1022位碱基。

本发明还提供上述细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶重组蛋白的可溶性表达，步骤如下：

（1）目的基因转二羟基丙酮激酶的扩增；

（2）构建转二羟基丙酮激酶表达质粒：将步骤（1）制备的目的基因转二羟基丙酮激酶酶切并纯化后，构建入pet-30a相应的多克隆酶切位点，构建质粒pet30a-转二羟基丙酮激酶；

（3）将步骤（2）制备的质粒pet30a-转二羟基丙酮激酶转化入e.colibl21(de3)感受态细胞中，活化表达转二羟基丙酮激酶的e．colibl21(de3)菌体，将活化表达的菌液加入lb液体培养基中，振荡培养2-3小时，至a600达到0.5；加入0.4mmol/l的iptg在18℃，150r/min诱导振荡培养7h，离心收集细菌，超声，收集上清液。

本发明还提供上述细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶重组蛋白的纯化方法，是使用ni-ntahis-bind（novagen）预装柱纯化细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶重组蛋白，然后使用6号洗脱液进行洗脱；所述6号洗脱液的配方为：500mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph8.0。

作为优选，步骤如下：

（1）加入超纯水于ni-nta预装柱中，使其缓慢的流过柱内填充的介质；

（2）加入结合缓冲液；所述结合缓冲液的配方为：50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph8.0；

（3）上样，加入通过超声破碎e.colibl21(de3)-pet30a-转二羟基丙酮激酶提取的上清液，使其缓慢流过柱内介质；

（3）用漂洗缓冲液冲洗预装柱；所述漂洗缓冲液的配方为：50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，20mm/l咪唑，ph8.0；

（4）加入1号洗脱液，使其缓慢流过柱内介质；所述1号洗脱液的配方为：50mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph8.0；

（5）加入2号洗脱液，使其缓慢流过柱内介质；所述2号洗脱液的配方为：100mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph8.0；

（6）加入3号洗脱液，使其缓慢流过柱内介质；所述3号洗脱液的配方为：200mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph8.0；

（7）加入4号洗脱液，使其缓慢流过柱内介质；所述4号洗脱液的配方为：300mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph8.0；

（8）加入5号洗脱液，使其缓慢流过柱内介质；所述5号洗脱液的配方为：400mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph8.0；

（9）加入6号洗脱液，使其缓慢流过柱内介质，收集洗脱液；所述6号洗脱液的配方为：500mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph8.0。

本发明还提供上述细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶重组蛋白在制备检测细粒棘球蚴病的elisa试剂盒中的应用。

本发明还提供一种检测细粒棘球蚴病的elisa试剂盒，所述elisa试剂盒中包被抗原为权利要求1或2所述的细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶重组蛋白。

作为优选，所述包被抗原用ph9.6的0.05m/l碳酸盐缓冲液稀释至终浓度10μg/ml。

作为优选，所述试剂盒还包括封闭液，所述封闭液为含有5%脱脂奶粉的tbst，所述百分比的单位为g/ml。

作为优选，所述试剂盒还包括酶标二抗，所述酶标二抗为过氧化物酶标记的羊抗人igg。

本发明提供了一种细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶基因，还提供了细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶基因所编码的蛋白质，并提供了一种细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶的原核表达载体pet30a-转二羟基丙酮激酶，该载体含有t7启动子和终止子、细菌核糖体结合位点和转二羟基丙酮激酶基因及一个组氨酸标签，从细粒棘球绦虫成虫cdna文库中克隆出转二羟基丙酮激酶基因，用t7启动子控制它在大肠杆菌中的表达，利用该载体转化大肠杆菌(bl21-de3)，在较低温度、较低诱导剂浓度及较短诱导时间条件下诱导该菌，可实现转二羟基丙酮激酶的高效可溶性表达：表达的重组蛋白质绝大部分为可溶性蛋白，占大肠杆菌可溶性总蛋白80%。本发明还提供了一种使用ni-ntahis-bind（clontech）亲和层析从大肠杆菌可溶性总蛋白中纯化出高纯度的重组转二羟基丙酮激酶的蛋白纯化方法，在使用6号洗脱液（500mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph8.0）时，可制备大量高纯度的细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶。该重组蛋白表达量高，且在特定的诱导条件下呈可溶性表达，纯化该蛋白的操作相当简单，成本也很低，极易重复使用。本发明所制备的重组蛋白可以用于囊型包虫病患者的免疫诊断，其作为免疫抗原能够被囊型包虫病患者血清识别，应用于间接elisa检测时，具备较高的特异性和灵敏度，临床检测符合率高达85％。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶基因pcr扩增产物电泳结果；

图2为细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶的原核表达；

图3为细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶亲和层析纯化；

图4为细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶的western-blot鉴定。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

实施例一细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶基因序列及其编码的蛋白质序列

细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶全长1120个核苷酸，最大的开放阅读框（orf）位于42-1022，含981bp，起始密码子为atg，终止密码子为tga，编码326个氨基酸，其核苷酸序列及编码的氨基酸序列分别见序列表seqidno.1和2。

核苷酸序列：

氨基酸序列：

实施例二细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶的原核表达载体pet30a-转二羟基丙酮激酶的克隆构建

1．目的基因转二羟基丙酮激酶的扩增

以细粒棘球绦虫pbluescriptⅱsk转二羟基丙酮激酶（细粒棘球绦虫pbluescriptⅱsk转二羟基丙酮激酶从海南医学院寄生虫学教研室获得，社会公众也可从该教研室获得）为模板，根据细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶基因序列设计如下两对引物：

f：5′-gcgaattcatgccatctacactg-3′，下划线部分为ecori酶切位点；

r：5′-cgaagctttcaattggagtcagtg-3′，下划线部分为hindiii酶切位点。

扩增转二羟基丙酮激酶基因最大的开放阅读框（orf）中的基因序列（即42-1022位基因序列），pcr反应条件：95℃预变性5min；98℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸75s，30个循环；72℃延伸10min。扩增产物电泳结果见图1。

图1为细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶基因pcr扩增产物电泳结果；其中，m，markerⅲ；1，转二羟基丙酮激酶pcr扩增产物。

2．构建转二羟基丙酮激酶表达质粒

pcr产物经纯化后，扩增得到片段被ecorⅰ和hindⅲ酶切后并纯化后，构建入pet-30a相应的多克隆酶切位点，构建质粒pet30a-转二羟基丙酮激酶，经测序鉴定，转二羟基丙酮激酶的序列信息与目标基因序列一致：核苷酸序列为序列表seqidno.1中第42-1022位碱基，编码326个氨基酸，编码的氨基酸序列为序列表seqidno.2。

实施例三细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶的原核表达

在不同诱导条件下，重组蛋白的可溶性表达量有所不同，以下为最佳诱导方法：

将质粒pet30a-转二羟基丙酮激酶转化入e.colibl21(de3)中，活化表达转二羟基丙酮激酶的e．colibl21(de3)菌体，移入200mllb液体培养基中振荡培养2～3h至a600达到0.5；加入iptg（0.4mmol／l）18℃，150r/min诱导振荡培养7h；4℃10000rpm离心10min收集细菌；超声破碎提取上清，并进行sds-page电泳，可见蛋白在上清液中表达量很高，呈可溶性表达（见图2）。重组蛋白质大部分为可溶性蛋白，占大肠杆菌可溶性总蛋白80%。

为了寻找到最佳诱导条件，申请人进行了大量实验，图2细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶在不同诱导条件下的原核表达。

其中，在a图中，m：marker；1-4，bl21（de3）-pet30a-转二羟基丙酮激酶于37℃，iptg分别为1、0.8、0.6、0.4mmol/l，诱导20h后上清液的电泳图；

b图中，m：marker；1-4，bl21（de3）-pet30a-转二羟基丙酮激酶于25℃，iptg分别为1、0.8、0.6、0.4mmol/l，诱导12h后上清液的电泳图；

c图中，m：marker；1-4，bl21（de3）-pet30a-转二羟基丙酮激酶于18℃，iptg分别为1、0.8、0.6、0.4mmol/l，诱导7小时后上清液。

由图2中可见，在诱导温度为37℃，iptg分别为1、0.8、0.6、0.4mmol/l，诱导20h后，在上清液中未见有可溶性表达的转二羟基丙酮激酶；将诱导温度降至25℃，iptg为1、0.8、0.6、0.4mmol/l，诱导12h，可见使用0.4mmol/liptg诱导后上清液中出现了可溶性表达的转二羟基丙酮激酶；进一步降低诱导温度至18℃，iptg浓度为1、0.8、0.6、0.4mmol/l，诱导7h后，均可使上清液中转二羟基丙酮激酶的表达量进一步增加，且iptg浓度为0.4mmol/l，可溶性转二羟基丙酮激酶的表达量最多，占大肠杆菌可溶性总蛋白的80%，故将此条件作为转二羟基丙酮激酶原核诱导表达的最优条件。

实施例四细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶的亲和层析纯化

应用ni-ntahis-bind（novagen）纯化系统纯化目的蛋白。ni-ntahis-bind（novagen）预装柱购自美国novagen公司，型号：70691-3。

在滴加各种物质时，滴加速度为1滴/10秒。

不同的纯化方法得到的重组蛋白的纯化效果不同，需要对纯化方法进行优化。以下为部分优化过程：

加入20ml超纯水于ni-ntahis-bind预装柱中，使其缓慢的流过柱内填充的介质；加入20mltris-结合缓冲液（20mm/ltris，500mm/lnacl，20mm/l咪唑，ph8.0），使其缓慢的流过柱内填充的介质；上样，加入4ml通过超声破碎e.colibl21(de3)-pet30a-转二羟基丙酮激酶提取的上清液，将该亲和柱置于摇床上，室温下轻轻振摇5分钟后控制流速使上清液缓慢流过柱内介质并收集；加入40mltris-结合缓冲液（20mm/ltris，500mm/lnacl，20mm/l咪唑，ph8.0），控制流速使其缓慢流过柱内介质；加入50mm/l咪唑-tris洗脱液（50mm/l咪唑，20mm/ltris，500mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其缓慢流过柱内介质并收集；加入100mm/l咪唑-tris洗脱液（100mm/l咪唑，20mm/ltris，500mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其缓慢流过柱内介质并收集；加入200mm/l咪唑-tris洗脱液（200mm/l咪唑，20mm/ltris，500mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其缓慢流过柱内介质并收集；加入300mm/l咪唑-tris洗脱液（300mm/l咪唑，20mm/ltris，500mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其缓慢流过柱内介质并收集；加入400mm/l咪唑-tris洗脱液（400mm/l咪唑，20mm/ltris，500mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其缓慢流过柱内介质并收集。将收集的洗脱液分别进行sds-page分析，检查蛋白的纯化程度，见图3中的a图。

图3为细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶亲和层析纯化结果。

其中，在a图中，m：marker；1，bl21（de3）-pet30a-转二羟基丙酮激酶上清原样；2，蛋白上样过柱后流穿液；3，50mm/l咪唑-tris洗脱液；4，100mm/l咪唑-tris洗脱液；5，200mm/l咪唑-tris洗脱液；6，300mm/l咪唑-tris洗脱液；7，400mm/l咪唑-tris洗脱液。

由图3中的a图可见：分别用50mm/l咪唑-tris洗脱液并未将目的蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，分别用100mm/l、200mm/l、300mm/l、400mm/l咪唑-tris洗脱液能够将目的蛋白洗脱下来，但是蛋白纯度不高，杂蛋白含量很高，故进一步优化蛋白纯化条件，使用以下方法进行纯化。

加入20ml超纯水于ni-ntahis-bind预装柱中，使其缓慢的流过柱内填充的介质；加入结合缓冲液（50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph8.0）20ml；上样，加入4ml通过超声破碎e.colibl21(de3)-pet30a-转二羟基丙酮激酶提取的上清液，控制流速，使其缓慢流过柱内介质；用40ml漂洗缓冲液（50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，20mm/l咪唑，ph8.0）冲洗柱子，将杂蛋白洗脱下来；加入1号洗脱液（50mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其缓慢流过柱内介质，并用5mlep管收集该洗脱液；加入2号洗脱液（100mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其缓慢流过柱内介质，并用5mlep管收集该洗脱液；加入3号洗脱液（200mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其缓慢流过柱内介质，并用5mlep管收集该洗脱液；加入4号洗脱液（300mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其缓慢流过柱内介质，并用5mlep管收集该洗脱液；加入5号洗脱液（400mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其缓慢流过柱内介质，并用5mlep管收集该洗脱液；加入6号洗脱液（500mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其缓慢流过柱内介质，并用5mlep管收集该洗脱液；将收集的洗脱液分别进行sds-page分析，检查蛋白的纯化程度。可见在用6号洗脱液洗脱时最终得到纯度很高的细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶，该酶的分子量大小约为35.97kd（见图3b）。sds-page结果见图3中的b图。

在图3中的b图中，m：marker；1，1号洗脱液；2，2号洗脱液；3，3号洗脱液；4，4号洗脱液；5，5号洗脱液；6，6号洗脱液（纯化效果较好，纯度高）。

实施例五细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶的western-blot鉴定

取纯化后的重组蛋白进行sds-page后，将重组蛋白转印至pvdf膜上，5%脱脂奶粉常温封闭过夜，加入细粒棘球蚴病人血清为一抗（1∶200），4℃过夜，tbst洗膜3次，加入过氧化物酶标记的羊抗人igg为二抗（1∶5000），室温振荡孵育杂交1h，tbst洗膜3次后，用ecl化学发光液显色（见图4）。

图4为细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶的western-blot鉴定；其中，m：蛋白marker；1，棘球蚴感染病人血清；2，健康人血清。

实施例六检测细粒棘球蚴病的elisa试剂盒

检测细粒棘球蚴病的elisa试剂盒包括以下组分：

1、包被抗原：以实施例4得到的纯化的重组蛋白为包被抗原，用ph9.6的0.05m/l碳酸盐缓冲液稀释纯化的重组蛋白至终浓度10μg/ml；

2、封闭液：5g脱脂奶粉溶于100mltbst中；

3、阴性对照：健康人血清，1:200稀释；

4、酶标二抗：过氧化物酶标记的羊抗人igg，1:10000稀释；

5、tmb显色液；

6、终止液：2mol/l浓硫酸。

实施例七细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶的elisa检测

以纯化后的重组蛋白为抗原，对20份感染棘球蚴病人血清样品和20份健康人血清样品进行间接elisa检测。具体方法如下：

用ph9.6的0.05m/l碳酸盐缓冲液稀释纯化的重组蛋白至终浓度10μg/ml，每孔200μl包被96孔酶标板，4℃过夜；甩去孔中液体，以ph7.4的pbst洗板3次(5min/次)后每孔加入200μl封闭液（5g脱脂奶粉溶于100mltbst中），37℃封闭1小时。pbst洗板3次(5min/次)，每孔100μl分别加入细粒棘球蚴病患者和健康人血清（1∶200稀释），37℃温育1小时；pbst洗板3次，每孔100μl加入过氧化物酶标记的羊抗人igg（1：10000稀释），37℃温育1小时；pbst洗板3次，每孔100μl加入tmb显色液，37℃避光反应30分钟，每孔50μl加入2mol/l浓硫酸终止反应，测定吸光度（）值。以健康人血清的均值2倍加标准差为阳性判断值。elisa检测结果如表1所示，转二羟基丙酮激酶对细粒棘球蚴病患者血清的诊断敏感性为85%（17/20），对细粒棘球蚴病有较好的免疫诊断价值。

表1细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶elisa检测结果

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>兰州大学

<120>细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶重组蛋白、其可溶性表达方法及其纯化方法和应用

<210>1

<211>1120

<212>dna

<213>细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶核苷酸序列

<400>1

tgtcgttggttgtctcttatagtgtggtgctgatttctagaatgccatctacactggatt60

tattgaagcaaaccactattgtcgttgcagatacgggggattttgacagtatacgaaaat120

ttcttccaactgatgccacgactaatccgtctcttatacttgcggcttctaagatgccaa180

aatactcagaaatcattgaagaggcagtgcggattgccaagacgaagtccgactctctgg240

aagagcaagtcgaaatcgcctcagactacacatttgtaatgttcggcgaagaaattctga300

aaatcattcccggccgtgtttccacagaggtcgacgcgcggctttcttttgacaaagata360

agcaaatcgaaaaggcccttaggttgatcgctctctatgctgagaagggaatatcgaaag420

aacgtatactcattaaattgagctcaacctgggaaggcatacaggcagccaaggagcttg480

agttgaaacatggcgtacactgcaatcttacactccttttctctttcttccaagctgttg540

cttgcgctgaggccaacgtgacactcatctccccatttgttggccgcatttacgactggt600

acgtggcgaaaaagggtcaaatcgagtttactaggctcgatgacccaggtgttctctctg660

taacacagatttacaattactacaagaaattcggctacgaaaccgagattatgggcgcct720

ctttccgcaatgtaaatcagatactcggtctcgttggctgtgatctcttgactatttcac780

ctagtcttcttgaatctcttgcctccatggatgaggtggttcctgtcgctcttgatgcta840

aattagcttcttcgagatccaaatacgagtcgcctctgcacttagatgaggctgctttcc900

gctgggctatgaacggggatgagatggctactgataaactctcagagggtattcgcaagt960

ttgccgcagactcacggaccttagaatgccttctaagagctcgcctcactgactccaatt1020

gatgcctgcccctccttgcactcttttctcatctaatccgatttcccatttagtattttg1080

cataaaataaatgtattatgctaaaaaaaaaaaaaaaaaa1120

<210>2

<211>326

<212>prt

<213>细粒棘球绦虫转二羟基丙酮激酶重组蛋白

<400>2

metproserthrleuaspleuleulysglnthrthrilevalvalala

151015

aspthrglyasppheaspserilearglyspheleuprothraspala

202530

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859095

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115120125

ileleuilelysleuserserthrtrpgluglyileglnalaalalys

130135140

gluleugluleulyshisglyvalhiscysasnleuthrleuleuphe

145150155160

serphepheglnalavalalacysalaglualaasnvalthrleuile

165170175

serprophevalglyargiletyrasptrptyrvalalalyslysgly

180185190

glnilegluphethrargleuaspaspproglyvalleuservalthr

195200205

glniletyrasntyrtyrlyslyspheglytyrgluthrgluilemet

210215220

glyalaserpheargasnvalasnglnileleuglyleuvalglycys

225230235240

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245250255

aspgluvalvalprovalalaleuaspalalysleualaserserarg

260265270

serlystyrgluserproleuhisleuaspglualaalapheargtrp

275280285

alametasnglyaspglumetalathrasplysleusergluglyile

290295300

arglysphealaalaaspserargthrleuglucysleuleuargala

305310315320

argleuthraspserasn

325