一种高产莽草酸突变体的制备方法与流程

本发明涉及莽草酸筛选方法的技术领域。

背景技术：

莽草酸(shikimicacid，sa)是合成芳香族氨基酸、生物碱及许多高附加值生物产品的重要中间体。近年来，禽流感疫情在全球范围内蔓延，莽草酸作为唯一有效预防和治疗禽流感药物磷酸奥司米韦(商品名“达菲”)的关键原料，因此备受关注。除此之外，莽草酸还可应用于合成抗肿瘤药物二恶霉素、乙二醛酶抑制剂。相较于传统的从诸如八角等植物果实中提取的方法和化学合成的方法，微生物发酵法生产莽草酸具有无可比拟的优势，如生产周期短、环境危害小、成本低等。其中，以经典工程菌株大肠杆菌作为宿主合成莽草酸为常用的微生物合成方式之一。

作为一种小分子化合物，尽管莽草酸有巨大的市场需求，但目前并无高产量的微生物发酵法生产莽草酸。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是针对目前莽草酸产量无法实现高产量现状。

首先，本发明提供了一种高产莽草酸的基因功能缺失大肠杆菌，基因succ、或agp、或nans、或pphb、或bglf、或promoterofsdhcdab-sucabcdoperon、或gnd所表达的蛋白缺失功能；

所述的基因succ具有序列表中seqidno.1所述的碱基序列；

所述的基因agp具有序列表中seqidno.2所述的碱基序列；

所述的基因nans具有序列表中seqidno.3所述的碱基序列；

所述的基因pphb具有序列表中seqidno.4所述的碱基序列；

所述的基因bglf具有序列表中seqidno.所述的碱基序列；

所述的基因promoterofsdhcdab-sucabcdoperon具有序列表中seqidno.所述的碱基序列；

所述的基因gnd具有序列表中seqidno.7所述的碱基序列。

其次，本发明还提供了一种生产莽草酸的方法：将parog^fbr电转化于基因功能缺失大肠杆菌菌株dhαδaroa中，之后涂于卡纳霉素平板(0μg/ml)，将得到的菌种以0.01od接种到lb培养基中，在20rpm、37℃条件下培养12h，利用hplc检测发酵液中莽草酸产量。

进一步地，所述的parog^fbr为：

具有序列表中seqidno.8所示的碱基序列或seqidno.28所示的氨基酸序列的蛋白质，或

具有序列表中seqidno.9所示的碱基序列或seqidno.29所示的氨基酸序列的蛋白质，或

具有序列表中seqidno.10所示的碱基序列或seqidno.30所示的氨基酸序列的蛋白质，或

具有序列表中seqidno.11所示的碱基序列或seqidno.31所示的氨基酸序列的蛋白质，或

具有序列表中seqidno.12所示的碱基序列或seqidno.32所示的氨基酸序列的蛋白质，或

具有序列表中seqidno.13所示的碱基序列或seqidno.33所示的氨基酸序列的蛋白质，或

具有序列表中seqidno.14所示的碱基序列或seqidno.34所示的氨基酸序列的蛋白质，或

具有序列表中seqidno.1所示的碱基序列或seqidno.3所示的氨基酸序列的蛋白质，或

具有序列表中seqidno.1所示的碱基序列或seqidno.3所示的氨基酸序列的蛋白质，或

具有序列表中seqidno.17所示的碱基序列或seqidno.37所示的氨基酸序列的蛋白质，或

具有序列表中seqidno.18所示的碱基序列或seqidno.38所示的氨基酸序列的蛋白质，或

具有序列表中seqidno.19所示的碱基序列或seqidno.39所示的氨基酸序列的蛋白质，或

具有序列表中seqidno.20所示的碱基序列或seqidno.40所示的氨基酸序列的蛋白质。或

具有序列表中seqidno.21所示的碱基序列或seqidno.41所示的氨基酸序列的蛋白质。或

具有序列表中seqidno.22所示的碱基序列或seqidno.42所示的氨基酸序列的蛋白质。或

具有序列表中seqidno.23所示的碱基序列或seqidno.43所示的氨基酸序列的蛋白质。或

具有序列表中seqidno.24所示的碱基序列或seqidno.44所示的氨基酸序列的蛋白质。或

具有序列表中seqidno.2所示的碱基序列或seqidno.4所示的氨基酸序列的蛋白质。或

具有序列表中seqidno.2所示的碱基序列或seqidno.4所示的氨基酸序列的蛋白质。或

具有序列表中seqidno.27所示的碱基序列或seqidno.47所示的氨基酸序列的蛋白质。

附图说明

图1随机突变改造的尿酸酶调控蛋白hucr载体构建图。

图2突变体hucr-4与野生型莽草酸诱导比较图。

具体实施方式

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1构建突变文库

以psh质粒为模板，在0.2mmdatp和dgtp，1.0mmdctp和dttp，mmmgcl2，7μmmncl2的突变条件下。以-atggctagcatgttgaagaaaaaag-3’(forward)and-gtgctcgagtacctttccaacaccagc-3’(reverse)为引物进行pcr扩增，得到突变的pcr产物。将突变的pcr产物用ndei和nhei双酶切，酶切产物分别与经相同酶切的psh载体连接，连接产物分别转化至dhα的感受态细胞中，得到突变文库。

2制备可受莽草酸诱导的突变体hucr-4

向突变体文库加入含有100mg/l氨苄霉素并添加了20mm莽草酸的液体lb培养基中，在20rpm、37℃条件下培养12h。以流式细胞仪对报告基因rfp表达较强的细胞进行富集，获得可受莽草酸诱导的突变体hucr-4。

3突变体hucr-4和野生型hucr对比

将突变体hucr-4和野生型hucr用0mm、7.mm、10mm、17.mm、20mm一系列浓度的莽草酸进行诱导，在20rpm、37℃条件下培养12h，检测红色荧光蛋白，结果表明野生型hucr几乎不被莽草酸诱导，而突变体hucr-4可被外加莽草酸诱导高达14倍。

莽草酸含量与报告基因rfp的表达水平呈正相关，因此可以利用此检测系统表征莽草酸含量，构建莽草酸高通量筛选方法。

4建立转座子随机插入文库

将tn10转座子质粒(1μg)电转化至大肠杆菌dhαδaroa的感受态细胞中，37℃复苏1h后，将复苏液涂于含有1mmiptg和0mg/l卡纳霉素的lb平板上，得到转座子随机插入文库。

检测莽草酸产量

将parog^fbr电转化至大肠杆菌菌株dhαδaroa，之后涂于卡纳霉素平板(0μg/ml)，将得到的菌种以0.01od接种到lb培养基中，在20rpm、37℃条件下培养12h，检测莽草酸产量。

将突变体hucr-4和parog^fbr电转化至转座子随机插入文库，涂于含有100mg/l氨苄霉素和30mg/l氯霉素的lb平板上，37℃培养18h后挑选平板上红色较深的单菌落进行下一步复筛。将挑选到的接种到试管中，在20rpm、37℃条件下培养12h，测rfp值，选取荧光值最高的突变体检测莽草酸产量。

取1ml发酵液，离心(12,000×g)1分钟后，取上清。经0.22μm滤膜过滤后进行hplc测试。

hplc条件为：设备shimadzulc-20ahplcsystem，液相色谱柱为bio-radaminexhpx-87h色谱柱(10μm，7.8×300mm)，检测器为spd-m20a二极管阵列检测器，检测波长为210nm。分离条件为：流动相：mm的硫酸溶液，流速0.4ml/分钟。

莽草酸的出峰时间约为1.7分钟。以系列浓度的莽草酸进样，绘制莽草酸浓度和hplc出峰面积的标准曲线，最终计算测试样品的莽草酸浓度。

确定敲除基因

最终确定多个基因的插入失活使得莽草酸产量提高，其中4个基因/基因簇是首次发现的：succ，agp，hans，pphb，bglf，promoterofsdhcdab-sucabcdoperon，gnd。莽草酸产量分别提高到1.4、18.9、20.7、14.8、19.8、19.0、21.0mg/l。

7基因敲除验证

基因/基因簇succ，agp，nans，pphb，bglf，promoterofsdhcdab-sucabcdoperon，gnd被分别在三种不同类型的大肠杆菌宿主中敲除以验证功能。三种类型的大肠杆菌宿主分别为：dhα、bw2113、jm109。

将转化有pkd4的待敲除菌株接种，30℃培养过夜；次日1∶0接种至100mllb培养基(氨苄青霉素浓度为100mg/ml)，30℃培养至d00＝0.3时，加入l-阿拉伯糖至1mm，诱导1h(d00不能超过0.)，使pkd4上的exo、bet和gam三个蛋白充分表达。冰上预冷10min，4000r/min，4℃离心10min，弃培养基；用预冷10％甘油离心洗涤3次，浓缩100倍成1ml的感受态细胞，每管100μl。将同源臂引物扩增的卡纳霉素抗性基因片段约800ng加入感受态细胞，混匀，转入0.2cm电击杯中，用bio-rad电击仪作电转化。电击条件：200ψ，2μf，电击电压2.3kv，电击时间为4～ms，电击后迅速加入1ml的lb，20r/min，37℃培养1h，之后涂于卡纳霉素平板(0μg/ml)；12h后用pcr法鉴定长出的卡纳霉素抗性克隆。

dhα、jm109购自宝生物工程(大连)有限公司，之后敲除aroa基因，敲除方法同上。bw2113δaroa来自keiocollection(babat，arat，hasegawam，etal.constructionofescherichiacolik-12in-frame，single-geneknockoutmutants：thekeiocollection.[j].molecularsystemsbiology，2006，2(1)：2006.0008-2006.0008.)。

野生型菌株dhαδaroa中过表达arog^fbr后产量为7.8mg/l，在此菌基础上敲除基因/基因簇succ，agp，nans，pphb，bglf，promoterofsdhcdab-sucabcdoperon，gnd后，莽草酸产量分别提高到14.9，14.1，22.12.0，14.8，19.8，23.mg/l。

野生型菌株bw2113δaroa中过表达arog^fbr后产量为7.mg/l，在此菌基础上敲除基因/基因簇succ，agp，nans，pphb，bglf，promoterofsdhcdab-sucabcdoperon，gnd后，莽草酸产量分别提高到1.9，1.0，24.1，13.2，1.1，20.0，24.mg/l。

野生型菌株jm109δaroa中过表达arog^fbr后产量为7.1mg/l，在此菌基础上敲除基因/基因簇succ，agp，nans，pphb，bglf，promoterofsdhcdab-sucabcdoperon，gnd后，莽草酸产量分别提高到13.8，12.8，21.8，11.9，12.7，1.9，20.1，mg/l。

8酶arog^fbr随机突变文库构建

(1)引物

primeri为-tccgaattcatgaattatcagaacgacga-3’；

primerii为-agactgcagttacccgcgacgcgcttttac-3’。

(2)易错pcr反应体系

20μl体系中含1×taqdna聚合酶缓冲液、0.2mmdatp和dgtp，1mmdctp和dttp，0.3～0.8mmmn²⁺，1mmprimeri和primerii，模板dna为质粒parog^fbr约10ng。

(3)扩增与鉴定

94℃，min；94℃，1min；℃，1.min；72℃，1.min；30个循环；72℃，10min，用质量分数为0.8％的琼脂糖凝胶电泳鉴定易错pcr产物，利用胶回收试剂盒切胶回收pcr产物，于-20℃保存。

(4)文库构建

将上述易错pcr产物经胶回收纯化后，经ecori-psti双酶切，与同样双酶切的载体parog^fbr相连接，重组子引入dhα，提取质粒得到突变体文库。

将突变体hucr-4和突变体文库电转化至大肠杆菌dhαδaroa的感受态细胞中，涂布于筛选平板(胰蛋白胨.0g·l-1，酵母浸膏3.0g·l-1，氯化钠10.0g·l-1，100mg/l氨苄霉素，30mg/l氯霉素的lb平板，琼脂粉10.0g·l-1)，观察平板的单菌落的生长及变色情况.挑取颜色较深的红色的单菌接种于lb液体培养基中培养，之后收集菌体进行hplc复筛鉴定。通过对几株大肠杆菌突变菌种生产莽草酸的能力hplc测试，测试显示突变体arog^fbrm1到m20莽草酸产量较野生型大肠杆菌产量(7.8mg/l)提高

9arog^fbrdaph合成酶活性检测

将突变体arog^fbr用-atggctagcatgaattatcagaacgacgat-3’(forward)and-ctcgaattcttacccgcgacgcgctttta-3’(reverse)为引物进行pcr扩增，得到突变的pcr产物。将其用nhei和ecori双酶切，酶切产物分别与经相同酶切的pet28a载体(购自promega公司)用t4连接酶(购自宝生物公司)4℃连接得到质粒pet28a-arogm2。

将上述质粒转入bl21(de3)宿主菌中，获得的bl21(de3)/pet28a-arog。单菌落接种至含有卡那霉素(终浓度为0μg/ml)的lb液体培养基中，37℃培养12h，收集发酵液，将发酵液按照1％(体积百分含量)的接种量转接至100ml新鲜的lb液体培养基中，37℃培养至达到0.，再在培养基中加入无菌的iptg，使iptg在培养基中的终浓度为1mm在30℃进行诱导发酵。12h后结束发酵，将发酵液4000g离心10min收集菌体。

将菌体重悬于0ml浓度为0mm的结合缓冲液(tris-盐酸，ph8，300mmnacl，10mm咪唑)，超声破壁(200w，工作3s暂停3s，工作100次)，离心(1700g，4℃，30min)去除细胞碎片，收集上清液。将上述的上清液经0.22μm滤膜过滤后，利用镍柱进行纯化，纯化的条件为：漂洗缓冲液：0mmph8tris-hcl，300mmnacl，20mm咪唑；洗脱缓冲液：0mmph8tris-hcl，300mmnacl，20mm咪唑。收集流出液，经透析处理(透析液为0mm1，3-双((三羟甲基)甲基氨基)丙烷缓冲液(ph7.0)，透析袋的截留分子量8000-14000)后，得到纯化酶液。

dahp合成酶测定酶活依据两种反应底物pep和e4p在232nm的吸光度的差别(pep，ε＝2800，e4p，ε＝41)进行测定。所有试剂都要用0.22μm滤膜过滤后才可使用。反应在10mm的1，3-双((三羟甲基)甲基氨基)丙烷缓冲液(ph7.0)中进行，底物pep和e4p的终浓度为2-200mm，总体积1ml，在2℃预热min后加入2ul纯化后的dahp合成酶起始反应。利用酶标仪(synergymx，biotek，usa)检测反应液在232nm的od值变化情况(2℃)。一个酶活单位定义为标准反应条件下，1min可生成1μmoldahp所需酶蛋白量。

纯化酶液(突变)比活力为：

上述结果表明，突变体生成dahp的能力都有所提高。