一种原卟啉荧光碳点及制备方法和应用与流程

本发明属于高分子材料合成与制备技术领域，涉及一种原卟啉荧光碳点及其制备方法。

背景技术：

近年来，由于抗生素的滥用导致了“超级细菌”的出现和传播。所谓“超级细菌”是指这些细菌对于目前的抗生素具有多重耐药的特性，这对于临床创伤感染的治疗增添了很大的难度。因此发展新的抗感染策略迫在眉睫。光动力抗菌治疗方法，就是其中最具前景的新疗法之一，对于细菌、真菌和病毒引起的感染，特别是对于耐药菌感染显示很好的疗效。

原卟啉是众所周知的芳香族大环化合物广泛存在于自然界中。原卟啉为紫褐色结晶性粉末，易溶于甲醇，难溶于稀酸，不溶于水、氯仿、乙醚和丙酮等。研究表明，卟啉类光敏剂产生的光动力可以有效地灭活酵母细胞。其作用原理是由于培养基中的原卟啉通过光活化产生活性氧自由基使得菌体细胞膜的通透性发生了改变，进而破坏菌体正常生理代谢，从而导致菌体的死亡。原卟啉不溶于水，大大限制了原卟啉在生物领域的应用。而且溶解或分散较好的卟啉衍生物比疏水性或团聚的卟啉衍生物能更有效地杀死细菌。

综上所述，开发出一种具有良好水溶性的原卟啉抗菌剂的方法是很有必要的。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于克服原卟啉不溶于水的缺点，得到一种水溶性的原卟啉荧光碳点，并提出一种原卟啉荧光碳点的制备方法和应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种原卟啉荧光碳点，其特征在于，具有如下结构：

n＝13～15的正整数

进一步，所述原卟啉荧光碳点对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌有杀菌作用。

2、一种原卟啉荧光碳点的制备方法，采用水热法将原卟啉和聚乙烯亚胺在170-220℃下反应7-10h，经冷却、透析、过滤后得到原卟啉荧光碳点。

进一步，按重量份数计，原卟啉20-33份，聚乙烯亚胺50-80份。

进一步，所述聚乙烯亚胺的分子量mn＝550～650。

3、一种原卟啉荧光碳点在抗金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌方面的应用。

本发明的有益效果在于：制备得到的原卟啉荧光碳点不仅具有很好的水溶性，还完整保留了原卟啉的性质，卟啉类光敏剂产生的光动力可以有效地灭活酵母细胞，起到杀菌作用。该方法具有反应步骤简单，反应条件温和，危险性小，低毒等优点。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为制备原卟啉荧光碳点的反应示意图。

图2为原卟啉荧光碳点水溶液(c＝0.125mg/ml)的紫外吸收光谱。

图3为原卟啉荧光碳点水溶液(c＝0.125mg/ml)的荧光谱图。

图4为原卟啉荧光碳点的光漂白实验图。

图5为金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的生长曲线图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

本发明的原卟啉荧光碳点通过如图1所示的反应制得：以原卟啉和pei(mn＝550～650)为反应物，水热反应釜为反应容器，在170-220℃下进行水热反应7-10h；然后，待产物降至室温，将产物放入1000d透析袋用去离子水进行透析，透析完成后用0.22μm的针孔过滤器过滤便可得到原卟啉荧光碳点。

用制得的原卟啉荧光碳点进行光动力杀菌效果测试。在本方法中，选取金黄色葡萄球菌(s.aureus)、大肠杆菌(e.coli)、绿脓杆菌(p.aeruginosa)和表皮葡萄球菌(s.epidermidis)作为革兰氏阳性菌和阴性菌的代表，用于研究原卟啉荧光碳点的杀菌作用。

实施例1

原卟啉荧光碳点1的制备方法，包括以下步骤：

1)配2mg/ml的pei(mn＝550～650)溶液10ml，称量10mg原卟啉，一起加入到水热反应釜中，在220℃下反应10h；

2)反应完成后，冷却至室温，用1000d透析袋进行透析3天，之后再用0.22μm的针孔过滤器对透析后的产物进行过滤，所得滤液即为原卟啉荧光碳点。

实施例2

原卟啉荧光碳点2的制备方法，包括以下步骤：

1)配2mg/ml的pei(mn＝550～650)溶液10ml，称量10mg原卟啉，一起加入到水热反应釜中，在220℃下反应8h；

2)反应完成后，冷却至室温，用1000d透析袋进行透析3天，之后再用0.22μm的针孔过滤器对透析后的产物进行过滤，所得滤液即为原卟啉荧光碳点。

实施例3

原卟啉荧光碳点3的制备方法，包括以下步骤：

1)配2mg/ml的pei(mn＝550～650)溶液10ml，称量10mg原卟啉，一起加入到水热反应釜中，在180℃下反应8h；

2)反应完成后，冷却至室温，用1000d透析袋进行透析3天，之后再用0.22μm的针孔过滤器对透析后的产物进行过滤，所得滤液即为原卟啉荧光碳点。

实施例4

原卟啉荧光碳点4的制备方法，包括以下步骤：

1)配2mg/ml的pei(mn＝550～650)溶液10ml，称量15mg原卟啉，一起加入到水热反应釜中，在220℃下反应10h；

2)反应完成后，冷却至室温，用1000d透析袋进行透析3天，之后再用0.22μm的针孔过滤器对透析后的产物进行过滤，所得滤液即为原卟啉荧光碳点。

实施例5

原卟啉荧光碳点5的制备方法，包括以下步骤：

1)配4mg/ml的pei(mn＝550～650)溶液10ml，称量10mg原卟啉，一起加入到水热反应釜中，在220℃下反应10h；

2)反应完成后，冷却至室温，用1000d透析袋进行透析3天，之后再用0.22μm的针孔过滤器对透析后的产物进行过滤，所得滤液即为原卟啉荧光碳点。

实施例6

原卟啉荧光碳点6的制备方法，包括以下步骤：

1)配4mg/ml的pei(mn＝550～650)溶液10ml，称量20mg原卟啉，一起加入到水热反应釜中，在220℃下反应10h；

2)反应完成后，冷却至室温，用1000d透析袋进行透析3天，之后再用0.22μm的针孔过滤器对透析后的产物进行过滤，所得滤液即为原卟啉荧光碳点。

原卟啉荧光碳点的结构表征如图2、3、4所示：

图2是原卟啉荧光碳点水溶液(c＝0.125mg/ml)的紫外吸收光谱，从图中可以看出，350-700nm范围内出现了原卟啉的特征紫外吸收峰，说明了原卟啉与pei(mn＝550～650)反应后仍然保留着原卟啉的结构和性质。

图3是原卟啉荧光碳点水溶液(c＝0.125mg/ml)的荧光谱图，从图中可以看出，在激发波长为405nm，488nm和633nm时原卟啉荧光碳点发射出强烈的荧光。

图4是原卟啉荧光碳点的光漂白实验图，从图中可以看出，光照后的原卟啉会产生ros，所产生ros作用于显色指示剂。光照2min后，紫外峰值几乎不变，证明原卟啉荧光碳点产生氧自由基是相当快速的。原卟啉荧光碳点通过光活化产生活性氧自由基使得菌体细胞膜的通透性发生了改变，进而破坏菌体正常生理代谢，导致菌体的死亡，进一步证明了所制备的碳点具有杀菌作用。

实施例7

利用原卟啉荧光碳点进行杀菌效果检测，具体内容如下：

1.细菌的培养：从-20℃冰箱中取出装有菌株的冻存管，使之融化，然后接种于胰蛋白胨大豆肉汤(tryptonesoyabroth,tsb)培养基中，并在37℃摇床培养，备用。一般提前一天培养。

2.细菌生长曲线：细菌生长曲线是将少量的单细胞微生物接种到一定容积的液体培养基后，在适宜的条件下培养，定时取样测定细胞数量。以时间为横坐标，以活菌数的对数为纵坐标，可得出一条生长曲线，曲线显示了细菌生长繁殖的四个时期：迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期。具体步骤为(下述所用器材及液体均事先灭菌)：

(1)先将菌株用磷酸缓冲盐溶液(phosphatebuffersaline,pbs)稀释到1×10⁵；

(2)取两个4ml的离心管标为1号2号，在1号离心管加入1ml细菌溶液和2ml原卟啉荧光碳点溶液，2号离心管加入1ml细菌溶液和2mlpbs，混合均匀；

(3)取四个比色皿记为3号4号5号6号，3号4号各加入1ml1号离心管的混合溶液，5号6号各加入1ml2号离心管的混合溶液；

(4)用波长为635nm的激光照射10min,其中3号5号用100mw的激光强度，4号6号用120mw；

(5)之后将1号2号3号4号5号6号里的混合溶液放入37℃细菌烘箱里培养2h；

(6)再取6个4ml的离心管标为1号2号3号4号5号6号，各加入2mltsb，将上述培养2h后的细菌溶液各取100μl加入到对应编号离心管中(如：1号→1号)，混合均匀；

(7)将上述1-6号离心管的细菌溶液用移液枪加入到96孔板中，一个样一列，一个孔100μl；然后放入37℃细菌烘箱里培养，间隔2h测其od值，直至细菌生长进入衰亡期；

以时间为横坐标，以活菌数(od)的对数为纵坐标，做细菌生长曲线。

图5为sa,se的生长曲线：(a)sa在pbs中不同光照强度下的生长曲线，(b)sa在原卟啉碳点(c＝0.52mg/ml)溶液中不同光照强度下的生长曲线，(c)se在pbs中不同光照强度下的生长曲线，(d)se在原卟啉碳点(c＝0.52mg/ml)溶液中不同光照强度下的生长曲线。从图5中可以看出，相比于空白样，原卟啉荧光碳点对金黄色葡萄球菌(s.aureus)和表皮葡萄球菌(s.epidermidis)均显示出了很强的杀菌效果。

杀菌测试表明：原卟啉荧光碳点对金黄色葡萄球菌(s.aureus)和表皮葡萄球菌(s.epidermidis)有明显的杀菌作用。

最后值得说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。