一株发光细菌及其在百菌清残留检测中的应用的制作方法

本发明涉及一株发光细菌及其在百菌清残留检测中的应用，属于微生物技术领域。

背景技术：

百菌清(chlorothalonil,cht)，化学名为2,4,5,6-四氯-1,3-二氰基苯，是一种广谱保护性杀菌剂，农业生产中主要用于防治果蔬类真菌病害。由于百菌清对植物体具有良好的黏着性和使用的广泛性,因此百菌清及其代谢产物在果蔬、土壤及水中均有较大的残留。美国国家环境保护总署(u.s.epa)已将百菌清列为可能使人类致癌的物质之一，其对环境和食品安全具有潜在威胁。百菌清在土壤中经光、微生物或酶等作用后转化为羟基百菌清，其毒性、稳定性增加，并能溶于水，对环境和食品安全造成更为严重的威胁。目前百菌清的检测方法主要有气相色谱法和液相色谱法以及酶联免疫法，但是这些方法在实际应用中存在前处理复杂、仪器试剂昂贵等缺点。

发光细菌检测法是用于有害物质检测的生物方法，可通过发光细菌发光强度的变化来测定有害物质的浓度或评价其毒性，该方法具有灵敏、快速、成本低等优点，在食品安全和环境监测等领域应用日益广泛。

技术实现要素：

本申请的发明人拟于海水环境和海洋生物中分离筛选发光细菌，并初步应用于果蔬污染物百菌清残留的生物检测，以期建立百菌清检测的快速、简便方法。

本发明的目的之一，是提供一株发光细菌。本发明的发光细菌fc-11-1丰富了发光细菌物种资源,是不同于已报道的11种发光细菌的新型发光菌株。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一株发光细菌fc-11-1，已于2016年12月05日保藏在位于北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，保藏编号为cgmccno.13424，分类命名为vibriotoranzoniae，其具有以下特性：

(1)在暗室中发出明亮的蓝绿色可见光，具有发光特性；

(2)革兰氏阴性菌；

(3)在发光固体培养基上的菌落为圆形类似馒头状，表面光滑湿润，边缘整齐，超过24h后菌落周围呈锯齿状；

(4)油镜下观察，呈杆状或弧状；

上述发光细菌fc-11-1的分离方法，包括以下步骤：

(1)制备培养基

发光细菌固体培养基(分离培养基)：甘油3ml、酵母粉5g、胰蛋白胨5g、碳酸钙1g、琼脂20g、陈海水1000ml，ph值7.8-8.0，121℃灭菌20分钟；

发光细菌液体培养基：酵母粉5g、胰蛋白胨5g、氯化钠30g、磷酸氢二钠5g、磷酸二氢钾1g、甘油3ml，ph值7.6，121℃灭菌20分钟；

海水2216e琼脂斜面培养基：蛋白胨5g、酵母粉1g、磷酸铁0.01g、琼脂20g、陈海水1000ml，ph值7.6，121℃灭菌20分钟；

(2)将新鲜捕获的海鱼，于无菌环境下，用无菌3％nacl溶液冲洗鱼体表杂物后，分别采集5-6片鱼鳞、鱼鳃、80％鱼肠，然后分别放入含有玻璃珠的45ml无菌3％nacl溶液，并置于涡旋震荡器上震荡2-3分钟，充分混匀后，置于无菌超净台；

(3)分别吸取混匀后的鱼鳞、鱼鳃、鱼肠悬液200μl注入到海水2216e琼脂培养基平板中，再用涂布棒涂布均匀，静置1min，放入25℃培养箱中，倒置培养；

(4)用接种针挑取生长的菌落，划线接种于发光细菌固体培养基平板中，放入25℃培养箱中，倒置培养，直到有菌落生成，取出；置于暗室观察，对发出荧光的菌落做好标记，编号；

(5)用接种针挑取标记好的发光菌落，进行连续划线接种，直到得到可在暗室发出荧光的纯菌落。

上述陈海水，是从不被陆上污物污染的或很少混有淡水的地方取来的海水装入玻璃瓶储放在暗处数星期后形成的海水。

上述发光细菌fc-11-1的鉴定方法，包括以下步骤：

(1)观察平板菌落的形态大小、通过革兰氏染色观察细胞形态；

(2)biolog鉴定

按照biolog微生物自动鉴定仪提供的操作手册，调整接种菌悬液浊度接种至96孔gn2微孔鉴定板中，于25℃培养至第24小时、48小时、72小时，结合“人工”及“自动”两种读板模式，分别测定3次，得出鉴定结果。

(3)pcr模板的制备

将过夜培养的发光细菌菌悬液配制成10⁸cfu/ml(od600＝0.1)，取其中3μl转入装有100μl无菌双蒸水的1.5ml离心管中，在99℃水浴10min，10000g离心10min，冷却后取上清液作为pcr反应模板。可将提取的dna模板置于-20℃冰箱中保存。

(4)16srdnapcr扩增

发光细菌16srdnapcr扩增所用引物为细菌16srdna通用引物，上游引物27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’；下游引物1492r：5’-tacggttaccttgttacgactt-3’。

pcr扩增的体系(25μl)：gotaqgreenmastermix12.5μl，上游引物27f1μl，下游引物1492r1μl，模板dna2.5μl，ddh2o8μl。pcr扩增的程序为：95℃预变性3min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min。

pcr产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

(5)16srdnapcr产物测序及系统发育树构建

16srdnapcr产物经纯化后送宝生物工程(大连)有限公司测序。测序所得基因序列提交到ncbi网站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)进行blast比对。采用mega5.05软件以neighbor-joining统计方法自展1000次进行系统发育树的构建。

本发明的目的之二，是提供上述发光细菌在百菌清残留检测中的应用。本发明的发光细菌fc-11-1可用于果蔬中百菌清残留的检测，具有成本低、操作简单、不需要贵重或大型仪器设备等优点。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一株发光细菌在百菌清残留检测中的应用。

本发明的目的之三，是提供一种百菌清残留检测的方法。本发明的检测方法，具有反应灵敏、成本低、操作简单、不需要大型贵重仪器设备等优点。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种百菌清残留检测的方法，包括如下步骤：

(1)称取待测果蔬样品200g，匀浆或搅拌粉碎均质，得到待测样品；

(2)取步骤(1)得到的待测样品25g置于250ml锥形瓶中，加入60ml丙酮及质量百分比分数为50％的磷酸2ml，振摇2min，过滤，用20ml丙酮洗涤锥形瓶2次，滤液全部移入250ml分液漏斗中，并加入20g/l硫酸钠溶液100ml，摇匀后用60ml环己烷一共提取3次，静置分层后，提取液经无水硫酸钠漏斗干燥，减压浓缩至近干，后用氮气吹干，用25ml无菌双蒸水定容，涡旋混合，将其转移至试管中，得到百菌清提取物；

(3)制备浓度为0-100μg/kg的百菌清标准溶液；

(4)将分离得到的发光细菌fc-11-1单菌落接种于10ml发光细菌液体培养基中，25℃、150r/min振荡培养20h，即为种子液；将种子液1ml接种至150ml液体发光培养基中，25℃、150r/min振荡培养,得到测试用菌液；

(5)当步骤(4)得到的测试用菌液的发光强度每秒光子计数为3900000-4200000时,取步骤(2)得到的百菌清提取物与步骤(4)得到的测试用菌液等体积混合均匀,同时分别取步骤(4)得到的测试用菌液与步骤(3)得到的百菌清标准溶液等体积混合均匀，于25℃培养30min后，检测发光细菌发光强度，计算发光抑制效率，根据标准曲线计算得到待测果蔬样品中百菌清浓度。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，步骤(4)所述发光细菌液体培养基为酵母粉5g、胰蛋白胨5g、氯化钠30g、磷酸氢二钠5g、磷酸二氢钾1g、甘油3ml，ph值7.6，121℃灭菌20分钟。

进一步，步骤(5)所述发光抑制效率的计算公式为：

式中：

x％：发光抑制效率；

kc：未添加百菌清样品中发光细菌发光强度；

kt：待测溶液中发光细菌发光强度。

本发明的有益效果是：

1.本发明分离出一种发光细菌。本发明的发光细菌fc-11-1丰富了发光细菌物种资源,是不同于现有已报道的11种发光细菌的新型发光菌株。

2.本发明提供了一种发光细菌在百菌清残留检测中的应用。

3.本发明的发光细菌用于果蔬中百菌清残留的检测，具有成本低、操作简单、不需要贵重或大型仪器设备等优点。

附图说明

图1为发光细菌fc-11-1的菌落图。

图2为发光细菌fc-11-1的细胞形态观察图。

图3为发光细菌fc-11-1的生长和发光强度曲线图。

图4为发光细菌fc-11-1的系统发育图。

图5为百菌清浓度与fc-11-1发光抑制率标准曲线。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1发光细菌fc-11-1的分离、鉴定

如图1和图2所示，经分离纯化培养后获得1株发光细菌(图1)，在暗室中发出明亮的蓝绿色可见光，具有发光特性；革兰氏染色菌体呈现红色，因此可判断均为革兰氏阴性菌；在发光固体培养基上的菌落为圆形类似馒头状，表面光滑湿润，边缘整齐，超过24h后菌落周围呈锯齿状；油镜下观察，呈杆状或弧状；在黑暗中发射蓝绿色荧光。

实施例2biolog鉴定

发光细菌fc-11-1的biolog鉴定分析结果与数据库中标准菌株的相似性较低，无法鉴定到种。但由biolog鉴定系统统计鉴定结果(表1)得出的相似性(sim值0.128)和位距(dist值8.955)显示，与弧菌属具有较高的同源性，且其生理生化特征与aidelasa等描述的vibriotoranzoniae特征高度一致^[1]。

表1发光细菌fc-11-1的biolog鉴定结果

注：“+”表示反应阳性，“-”表示反应阴性。

实施例3培养时间对发光细菌生长和发光强度的影响

在发光培养基中，25℃、150rpm/min振荡培养条件下，培养时间对发光细菌fc-11-1生长和发光强度(指每秒的光子计数,微弱发光仪测得)的影响(图3)。由图3可以看出，发光细菌fc-11-1的发光与生长不具有同步性，细菌浓度达到od600nm＝0.1时，即开始发光。当该发光细菌生长进入对数生长期，细菌密度大概达到od600nm＝0.7时，该发光细菌可持续稳定发光达12h。在实际检测中，起始发光时间短、持续稳定发光时间长的菌种能够缩短检测周期且易于操作控制，在这一点上,说明fc-11-1适合应用于有毒物质的检测。

实施例416srdna序列测定及系统发育分析

发光细菌fc-11-1的16srdna序列，长度为1471bp，测序所得结果提交到ncbi进行比对，如表2显示。结合形态学鉴定结果及实验菌株16srdna序列的最高相似性可得知，分离得到的发光细菌与vibriotoranzoniae相似性最高，达100％。

表2发光细菌fc-11-1的16srdna序列相似性

分离得到的发光细菌fc-11-1比对结果进行系统发育树分析结果，如图4显示。

生理生化鉴定和分子生物学鉴定结果证明，本发明分离得到的发光细菌fc-11-1为vibriotoranzoniae，这种发光细菌在国内未见报道。

实施例5发光细菌fc-11-1发光状态对其用于百菌清检测的影响

将分离得到的发光细菌fc-11-1单菌落接种于10ml液体培养基中，25℃、150r/min振荡培养20h，即为种子液。将种子液1ml接种至150ml液体发光培养基中，25℃、150r/min振荡培养。在发光条件下，每隔4h将菌液移至百菌清浓度为0、20、40、60、80、100μg/kg的试管中。反应体系中百菌清溶液与菌液等体积混合均匀后于25℃、150r/min振荡培养30min，测定发光强度，每组各3个平行，结果取平均值。取样至24h。以百菌清浓度为横坐标，以对发光细菌fc-11-1发光抑制率为纵坐标建立标准曲线，如表3。表3结果证明，发光细菌的起始发光强度在3900000-4200000，线性方程的r²值都大于0.98，满足检测要求。

表3发光细菌fc-11-1不同发光状态对其用于百菌清检测的影响

实施例6作用时间对发光细菌fc-11-1用于百菌清检测的影响

将分离得到的发光细菌fc-11-1单菌落接种于10ml液体培养基中，25℃、150r/min振荡培养20h，即为种子液。将种子液1ml接种至150ml液体发光培养基中，25℃、150r/min振荡培养。测定发光强度达到3900000-4200000，将菌液分别移至百菌清浓度为0、20、40、60、80、100μg/kg的试管中。反应体系中百菌清溶液5ml，菌液5ml。混合均匀后于25℃、150r/min分别振荡培养15min、30min、60min，测定发光强度，每组各3个平行，结果取平均值。以百菌清浓度为横坐标，以对发光细菌fc-11-1发光抑制率为纵坐标建立标准曲线，如表4所示。表4结果证明，发光细菌用于百菌清检测的作用时间为30min时，其线性方程为y＝0.3975x+0.3682，r²值大于0.99，明显优于作用时间为15min和60min的条件。

表4百菌清与发光细菌fc-11-1最佳作用时间的确定

实施例7发光细菌fc-11-1在草莓中百菌清残留检测的应用

(1)称取新鲜待测不加内标的草莓200g，匀浆后，用tris缓冲液将样品的ph调至7.0-7.6；

(2)将(1)中草莓匀浆样品25ml置于250ml锥形瓶中，加入60ml丙酮及质量百分比分数为50％的磷酸2ml，充分振摇2min，过滤，用20ml丙酮洗涤锥形瓶2次，滤液全部移入250ml分液漏斗中，并加入20g/l硫酸钠溶液100ml，摇匀后用60ml环己烷一共提取3次，静置分层后，提取液经无水硫酸钠漏斗干燥，减压浓缩至尽干，后用氮气吹干，用25ml无菌双蒸水定容，涡旋混合1min，将其转移至试管中，得到百菌清提取物；

(3)制备百菌清不同添加浓度的草莓汁样品

分别取步骤(1)中所得草莓汁25ml添加百菌清标准品，使其百菌清终浓度分别达到10、20、50、100、200μg/kg，得到外源添加百菌清草莓样品，同时制备百菌清浓度为0、20、40、60、80、100μg/kg的标准溶液，以用于标准曲线的绘制；

(4)将分离得到的发光细菌fc-11-1单菌落接种于10ml液体培养基中，25℃、150r/min振荡培养20h，即为种子液；将种子液1ml接种至150ml液体发光培养基中，25℃、150r/min振荡培养,得到测试用菌液；

(5)当步骤(4)得到的测试用菌液的发光强度达到每秒光子计数为3900000-4200000时,取步骤(2)得到的百菌清提取定容液5ml与步骤(4)得到的测试用菌液5ml与混合均匀,同时分别取步骤(4)得到的测试用菌液5ml与步骤(3)得到的百菌清浓度为0、20、40、60、80、100μg/kg的标准溶液5ml混匀，于25℃培养30min后，检测发光细菌发光强度，计算发光抑制效率，根据标准曲线计算得到百菌清浓度，并计算回收率等指标，结果见表5、图5。

表5不同百菌清添加浓度在草莓中的回收率(n＝6)

样品检测中，当草莓中百菌清添加浓度低于20μg/kg时，回收率较低，在90％以下，随着添加浓度的增大，当高于50μg/kg时，百菌清回收率均在90％以上，精密度在4.95％-10.73％，符合生物检测的要求。

实施例8发光细菌fc-11-1在冷冻菠菜中百菌清残留检测的应用

(1)称取冷冻菠菜200g，搅拌均质；

(2)制备百菌清不同添加浓度的冷冻菠菜样品

分别取步骤(1)中所得冷冻菠菜25g添加百菌清标准品，使其百菌清终浓度分别达到10、20、40、50、100、200μg/kg，得到外源添加百菌清菠菜样品，同时制备百菌清浓度为0、20、40、60、80、100μg/kg的标准溶液，以用于标准曲线的绘制；

(3)各取25g菠菜样品，同实施例7中步骤(3)进行样品前处理，提取百菌清，待用；

(4)同实施例7中步骤(4)、(5)制备发光细菌悬液并与待测样品或百菌清标准溶液反应，测定发光细菌发光强度，计算发光受抑制情况，根据标准曲线计算测得的百菌清浓度，并计算回收率等指标，结果见表6。

表6不同百菌清添加浓度在冷冻菠菜中的回收率(n＝6)

样品检测中，当添加菠菜中百菌清浓度为10、20、40μg/kg时，回收率均在90％以下，但浓度在40μg/kg时，回收率已达到89.98％。随着添加浓度增大到50μg/kg时，回收率均在90％以上，精密度在3.07％-8.88％之间，符合生物检测的要求。

结果表明该发光细菌法用于果蔬中百菌清的残留检测其检测低限可达到50μg/kg。

参考文献

[1].aidelasa,anal.dieguez,jesusl.romalde，vibriotoranzoniaesp.nov.,anewmemberofthesplendiduscladeinthegenusvibrio[j].systematicandappliedmicrobiology,2013,(36):96-100.

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

〈110〉烟台出入境检验检疫局检验检疫技术中心

〈120〉一株发光细菌及其在百菌清残留检测中的应用

〈160〉1

〈170〉patentinversion3.5

〈210〉1

〈211〉1471

〈212〉dna

〈213〉vibriotoranzoniae

〈400〉1

ctaacacatgcaagtcgagcggtaacgacactaacaatccttcgggtgcgttaatgggcgtcgagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaaattgccttgatgtgggggataaccattggaaacgatggctaataccgcatgatgcctacgggccaaagagggggaccttcgggcctctcgcgtcaagatatgcctaggtgggattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgatcagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttcgggttgtaaagtactttcagttgtgaggaagggggtaacgttaatagcgctatctcttgacgttagcaacagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcgagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcatgcaggtggttcattaagtcagatgtgaaagcccggggctcaacctcggaactgcatttgaaactggtgaactagagtactgtagaggggggtagaatttcaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctgaaggaataccagtggcgaaggcggccccctggacagatactgacactcagatgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtctacttggaggttgtggccttgagccgtggctttcggagctaacgcgttaagtagaccgcctggggagtacggtcgcaagattaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaatccagcggagacgcaggagtgccttcgggagctctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatccttgtttgccagcgagtcatgtcgggaactccagggagactgccggtgataaaccggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggcgcatacagagggcagcgagccagcgatggtaagcgaatcccaaaaagtgcgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtgaatcagaatgtcacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggctgcaaaagaagtaggtagtctaaccttcgggaggacgcttaccactttgtggttcatgactggggtgaagtcgtaacaaggta1471