一类磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶激活剂及应用的制作方法

本发明涉及作为磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶激活剂的一系列化合物，以及这些化合物在治疗和预防各种炎症、氧化损伤、神经退行性病变、及铁死亡相关疾病的药物中的应用。

背景技术：

磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(gpx4，或phgpx)能还原细胞内的各种活性氧物种(ros)，是最主要的保护细胞膜免受脂质过氧化物损伤的酶。激活gpx4的保护作用对于治疗炎症、氧化损伤、神经退行性病变、及其它铁死亡参与的疾病有很好的效果。

gpx4与炎症。炎症的发生与发展是一个多分子参与的复杂过程，花生四烯酸(arachidonicacid,aa)代谢网络是其中的核心网络，gpx4在aa代谢中发挥重要作用(yang,k.etal.dynamicsimulationsonthearachidonicacidmetabolicnetwork.ploscomput.biol.3,523-530(2007).；yang,k.etal.findingmultipletargetoptimalinterventionindisease-relatedmolecularnetwork.mol.syst.biol.4,228(2008).)。aa通过三条脂氧合酶(lox)通路被转化为对应的羟基过氧化二十碳四烯酸(hpete)之后，gpx4催化还原hpete生成羟基二十碳四烯酸(hete)。当gpx4高效还原5-hpete时，下游白三烯类促炎因子的产量会明显降低，从而达到抗炎的效果。另外，gpx4催化还原生成的15-hete会进一步被代谢为脂氧素(lxs)类分子，可以抑制中性粒细胞的趋化运动，促进炎症的消除(kuhn,h.etal.regulationofenzymaticlipidperoxidation:theinterplayofperoxidizingandperoxidereducingenzymes.freeradic.biol.med.33,154-172(2002).；schnurr,k.etal.theselenoenzymephospholipidhydroperoxideglutathioneperoxidasecontrolstheactivityofthe15-lipoxygenasewithcomplexsubstratesandpreservesthespecificityoftheoxygenationproducts.j.biol.chem.271,4653-4658(1996).)。

gpx4与铁死亡。铁死亡是一种依赖于细胞内铁离子存在的非凋亡式细胞死亡方式，在2012年首次报道。铁死亡与神经退行性变、组织缺血再灌注损伤、中风、心血管、肾衰竭以及糖尿病并发症等疾病的发生和发展密切相关(yang,w.s.etal.ferroptosis:deathbylipidperoxidation.trendscellbiol.26,165-176(2016).)。2014年，yang等人发现gpx4是铁死亡的核心调控者(yang,w.s.etal.regulationofferroptoticcancercelldeathbygpx4.cell156,317-331(2014).)，gpx4激活剂可以抑制铁死亡的发生，被用于治疗铁死亡相关的疾病。

目前还没有报道可以直接激活gpx4酶活性的化合物，也没有gpx4激活剂进入临床试验。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一系列有机杂环化合物作为磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(gpx4)激活剂。

本发明的目的还在于提供上述有机杂环化合物在制备治疗和预防各种炎症、氧化损伤、神经退行性病变、及铁死亡相关疾病等各种gpx4活性相关疾病的药物中的应用。

本发明通过使用蛋白表面口袋探测程序cavity对gpx4的别构位点进行预测，发现了适合小分子结合的潜在别构位点，并针对其进行了虚拟筛选。通过体外活性测试，一系列分子被证实为gpx4激活剂。借助液相色谱-质谱联用技术分析，激活剂分子在人多形核细胞的炎症模型展现出减少炎症因子生成，提高抑炎因子浓度的效果。另外，在人纤维肉瘤细胞ht-1080的铁死亡模型中，我们发现使用gpx4激活剂可以抑制铁死亡诱导剂erastin诱导的铁死亡发生。

本发明提供的化合物具有如下结构通式：

其中x代表直链或支链烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环基；y代表氢、胺基、烷基或环烷基取代的胺基、取代或未取代的含1-2个氮原子的杂环基、或者取代或未取代的同时含氮及氧原子的杂环基。

对于x：

上述直链或支链烷基优选为c1～c6的直链或支链烷基，更优选为c1～c3的烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基等。

上述环烷基优选c3～c7的环烷基，更优选为c5～c6的环烷基，例如环戊基、环己基。

上述芳基优选为c6～c7的芳基，例如苄基、苯基等。

上述杂环基包括脂杂环基和芳杂环基，优选c2～c6的脂杂环基和芳杂环基。

所述脂杂环基包括但不限于杂环烷基、内酯基、内酰胺基、环形二酸酐基、环形酰亚胺基等。

所述杂环烷基优选为c2～c6的杂环烷基，可以是含1-2个o、s和/或n原子的三元至六元的杂环烷基，例如环乙氧基、环硫乙基、氮丙啶基、四氢呋喃基、四氢吡咯基、四氢噻吩基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基等。

所述内酯基优选为c2～c5的内酯基，例如丙内酯基(即β内酯基，四元环)、丁内酯基(即γ内酯基，五元环)等。

所述内酰胺基优选为c2～c5的内酰胺基，例如丙内酰胺基(即β内酰胺基，四元环)、丁内酰胺基(即γ内酰胺基，五元环)等。

所述环形二酸酐基优选为c2～c5的环形二酸酐基，例如马来酸酐基、丁二酸酐基、戊二酸酐基等。

所述环形酰亚胺基优选为c2～c5的环形酰亚胺基，例如海因基(乙内酰脲基)、马来酰亚胺基、琥珀酰亚胺基、戊二酰亚胺基、尿嘧啶基等。

上述芳杂环基优选为c2～c6的含有1-2个o、s和/或n原子的杂环芳基，更优选为c3～c5的杂环芳基，例如呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡啶基、嘧啶基等。

所述环烷基、芳基和杂环基上的取代基优选为卤素、c1～c4的烷基、c1～c4的烯基、c1～c4的含氮或氧原子的基团，例如氯、氟、甲基、甲氧基、氰基、羧酸甲脂、硝基等。

对于y：

上述烷基或环烷基取代的胺基优选为c1～c5烷基或环烷基取代的胺基，更优选为c1～c3烷基取代的胺基，例如2-氨基乙基。

上述含1-2个氮原子的杂环基例如哌嗪基、哌啶基等，杂环基上可具有一个或多个c1～c4的烷基取代基，例如甲基取代的哌嗪基。

上述同时含氮及氧原子的杂环基例如噁唑烷基，氧杂哌嗪基，杂环基上可具有一个或多个c1～c4的烷基取代基，例如1-甲基-3-氧代哌嗪基等。

上述通式化合物的具体例子有：

1)4-(3-(4-氯苄基)硫脲基)苯磺酰胺；

2)4-(3-(4-甲基哌嗪-1基)硫脲基)苯磺酰胺；

3)4-(3-(2-羟乙基)硫脲基)苯磺酰胺；

4)4-(3-苄基硫脲基)苯磺酰胺；

5)4-(3-叔丁基硫脲基)苯磺酰胺；

6)4-(3-环戊基硫脲基)苯磺酰胺；

7)4-(3-环己基硫脲基)苯磺酰胺；

8)4-(3-苯基硫脲基)苯磺酰胺；

9)4-(3-环己基甲基硫脲基)苯磺酰胺；

10)4-(3-环庚基硫脲基)苯磺酰胺；

11)4-(3-((1r，4r)-4-甲基环己基)硫脲基)苯磺酰胺；

12)4-(3-(2-甲基环己基)硫脲基)苯磺酰胺；

13)4-(哌啶-1-硫代甲酰胺基)苯磺酰胺；

14)4-(3-(吡啶-3-基)硫脲基)苯磺酰胺；

15)4-(3-(2-羟基环己基)硫脲基)苯磺酰胺；

16)4-(3-(2，4-氧杂咪唑基)硫脲基)苯磺酰胺；

17)n-(2-氨基乙基)-4-(3-环戊基硫脲基)苯磺酰胺盐酸盐；

18)n-(2-氨基乙基)-4-(3-环己基硫脲基)苯磺酰胺盐酸盐。

本发明包括任何具有激活gpx4活性的、分离的消旋或光学活性形式的式i化合物。

本发明的化合物或其药用盐在gpx4的体外活性测试中均显示出了激活活性，说明其为gpx4的激活剂。

本发明的化合物或其药用盐在人多形核细胞的炎症模型实验中，展现出减少炎症因子生成，提高抑炎因子浓度的效果。

本发明的化合物或其药用盐在人纤维肉瘤细胞ht-1080的铁死亡模型中，显示出抑制铁死亡诱导剂erastin诱导的铁死亡发生的作用。

将本发明的化合物或其药用盐作为有效成分，添加常规药物载体，可制备用于治疗或预防各种炎症、氧化损伤、神经退行性病变、及铁死亡相关疾病等各种gpx4活性相关疾病的药物。

上述药用盐为所述化合物与无机酸或有机酸形成的盐，所述无机酸包括盐酸、硫酸、磷酸、硝酸等；所述有机酸包括柠檬酸、琥珀酸、枸橼酸、醋酸、酒石酸、甲磺酸等。

上述药物载体包括无毒固态、半固态或液态的填充剂、稀释剂、佐剂、包裹材料等制剂辅料，根据治疗目的、给药途径的需要将药物组合物制成各种剂型。

附图说明

图1显示了蛋白表面探测程序cavity预测出的gpx4别构位点，所预测的潜在别构位点(图中蛋白结构的右侧所示)位于已知底物结合位点(图中蛋白结构的左侧所示)的对侧。

图2是pkumdl-lc-101与gpx4分子对接图，图中分子与蛋白间的氢键以虚线表示。

图3显示实施例4中pkumdl-lc-101在人多形核细胞的炎症模型中的实验结果，pkumdl-lc-101在人多形核细胞中使得5-hete∶ltb4的浓度比例升高(a)，并使12-lox和15-lox通路下游的12-hete和15-hete的含量升高(b)。

图4显示实施例5中pkumdl-lc-101对人纤维肉瘤细胞ht-1080的铁死亡模型的影响，pkumdl-lc-101在ht-1080细胞中能够抑制erastin诱导的铁死亡。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，表示实践本发明的方法，其对本发明的范围无任何限制。本领域技术人员可能找到对于他们而言显而易见的实现本发明的其他方法，均应认为那些方法被包括在本发明的范围之内。

实施例1、gpx4激活剂的发现

一、gpx4别构位点的预测

我们使用蛋白表面口袋探测程序cavity对gpx4的别构位点进行了预测，寻找蛋白表面适合小分子结合的位点。cavity程序的计算流程为：第一步，通过纯几何的擦除球方法对蛋白质表面进行探测，寻找蛋白质表面可能的配体结合位点；第二步，结合几何结构与物理化学性质信息，根据经验公式对蛋白结合小分子的能力进行打分。我们采用默认参数对gpx4突变体u46c的结构(pdb编号2obi)进行了分析，最终确定了一个适合结合小分子的可能的别构口袋，如图1所示，该别构位点位于图中所示蛋白结构的右侧，在已知底物结合位点(左侧)的对侧。

二、gpx4别构分子的虚拟筛选

针对预测的别构位点，采用分子对接的方法，对包含197,276个化合物的specs数据库进行虚拟筛选。我们使用glide程序的sp(standardprecision)模式先进行粗略的刚性对接，从197,276个化合物中选出打分排名前10,000的化合物。之后使用glide程序xp(extraprecision)模式，考虑化合物和蛋白质残基的侧链柔性再次精细对接，从10,000个化合物中选出打分排名前2,000的化合物。最后，对排名前2,000的化合物，根据它们的预测结合构象进行人工挑选。选出的251个化合物在体外酶活性测试中进一步验证活性。化合物pkumdl-lc-101即为筛选得到的活性化合物之一。

实施例2、激活剂分子的设计合成

一、pkumdl-ld-101类似物的设计

根据活性化合物pkumdl-ld-101与gpx4结合的对接模型(见图2)和分子二维结构，我们进一步对化合物的芳香环进行替换或将磺酰胺替换为n-取代磺酰胺，设计一系列化合物。

二、pkumdl-ld-101类似物的合成根据设计，我们从specs库中购买了4-(3-(4-甲基哌嗪-1基)硫脲基)苯磺酰胺(pkumdl-ld-102)和4-(3-(2-羟基乙基)硫脲基)苯磺酰胺(pkumdl-ld-103)两个类似物。对于购买不到的设计分子，通过化学合成得到。

1.以pkumdl-ld-104为例，描述部分类似物的合成。

我们参考已报道的方法，合成4-异硫氰酸酯基苯磺酰胺(mohameds.a.el-gabyetal.synthesis,characterizationandinvitroantimicrobialactivityofnovel2-thioxo-4-thiazolidinonesand4,4′-bis(2-thioxo-4-thiazolidinone-3-yl)diphenylsulfones.eurjmedchem.2009,44,4148-4152)。然后，用4-异硫氰酸酯基苯磺酰胺与苄胺加成，得到4-(3-苄基硫脲基)苯磺酰胺。

4-氨基苯磺酰胺(17.20g,100mmol)溶于200ml水中，加入50ml浓盐酸，室温下加入硫光气(11.50g,100mmol)反应30分钟，过滤得到4-异硫氰酸酯基苯磺酰胺，水洗干燥，得到产品18.62g，产率87％

214mg(1mmol)4-异硫氰酸酯基苯磺酰胺溶于5mletoh，加入1mmol苄胺，室温搅拌，薄层色谱(tlc)监测反应进程，直到原料消失，过滤不溶物即得到pkumdl-ld-104，真空干燥得到产品289mg。产率为90％。

采用上述方法可制备如下化合物：

pkumdl-ld-105：4-(3-叔丁基硫脲基)苯磺酰胺；

pkumdl-ld-106：4-(3-环戊基硫脲基)苯磺酰胺；

pkumdl-ld-107：4-(3-环己基硫脲基)苯磺酰胺；

pkumdl-ld-108：4-(3-苯基硫脲基)苯磺酰胺；

pkumdl-ld-109：4-(3-环己基甲基硫脲基)苯磺酰胺；

pkumdl-ld-110：4-(3-环庚基硫脲基)苯磺酰胺；

pkumdl-ld-111：4-(3-((1r，4r)-4-甲基环己基)硫脲基)苯磺酰胺；

pkumdl-ld-112：4-(3-(2-甲基环己基)硫脲基)苯磺酰胺；

pkumdl-ld-113：4-(哌啶-1-硫代甲酰胺基)苯磺酰胺；

pkumdl-ld-114：4-(3-(吡啶-3-基)硫脲基)苯磺酰胺；

pkumdl-ld-115：4-(3-(2-羟基环己基)硫脲基)苯磺酰胺；

pkumdl-ld-116：4-(3-(2，4-氧杂咪唑基)硫脲基)苯磺酰胺。

所得化合物的产率为70％～90％。

同样的合成方法，也用于放大量制备化合物pkumdl-ld-101，产率为92％。

2.以pkumdl-ld-117为例，描述其余化合物的合成。

n-boc-乙二胺2.40g(15mmol)溶于250ml二氯甲烷中，0℃下加入2ml三乙胺和2.33g(10mmol)4-乙酰氨基苯磺酰氯。室温反应1小时，减压蒸馏除去溶剂，残留物中加入50ml水，50mletoh，1.60g(40mmol)naoh，回流反应3h；2m的盐酸调ph到7，乙酸乙酯萃取反应液，有机相饱和食盐水洗涤，na2so4干燥,滤除干燥剂，旋蒸除去溶剂，得到粗产物，经柱色谱分离，得到n-(n-boc-氨基乙基)-4-氨基苯磺酰胺1.70g,¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.39(d,j＝8.7hz,2h),7.13(t,j＝5.8hz,1h),6.76(t,j＝5.8hz,1h),6.67–6.55(m,2h),5.93(s,2h),2.93(q,j＝6.7hz,2h),2.65(q,j＝6.7hz,2h),1.35(s,9h).

取1.57gn-(n-boc-氨基乙基)-4-氨基苯磺酰胺溶于20mlthf，加入0.5ml硫光气，室温反应8h，过滤干燥得到n-(n-boc-氨基乙基)-4-异硫氰酸基苯磺酰胺1.20g。

n-(n-boc-氨基乙基)-4-异硫氰酸基苯磺酰胺357mg溶于5mletoh，加入1mmol环戊胺室温反应直到原料消失，过滤得到n-(n-boc-氨基乙基)-4-(3-环戊基硫脲基)苯磺酰胺410mg，产率93％。

400mgn-(n-boc-氨基乙基)-4-(3-环戊基硫脲基)苯磺酰胺溶于5mletoh，加入0.5ml1m的氯化氢乙醇溶液，室温搅拌3h，过滤得到白色固体，真空干燥得到产品pkumdl-ld-117298mg，产率85％。

采用上述方法制备了pkumdl-ld-118。

化合物的表征数据列入表1，其中在核磁共振波谱仪varianmercury400m(氘代dmso，tms参比)上得到¹hnmr光谱数据，在brukersolarixxr得到质谱数据。购买的pkumdl-ld-102与pkumdl-ld-103的核磁氢谱是specs网站提供的。

表1.目标化合物表征数据

实施例3、gpx4的体外活性测试

gpx4酶活性的测定是通过监测反应动力学实现的。gpx4催化还原型谷胱甘肽还原叔丁基过氧化物，自身被氧化成氧化型谷胱甘肽。氧化型谷胱甘肽可以在谷胱甘肽还原酶存在时被nadph还原，同时nadph被消耗。我们检测nadph在460nm处的荧光发射谱的下降(激发波长为335nm)。实验的具体做法为：将小分子的dmso溶液10μl与纯化后的gpx4蛋白孵育，gpx4蛋白置于185μl测活缓冲液中(tris-hcl，100mm，ph7.4；edta，5mm；tritonx-100，0.1％；nadph，0.2mm；还原型谷胱甘肽，3mm；谷胱甘肽还原酶，1unit/ml)。使用恒温振荡培养器在37℃以650rpm的转速振荡孵育5min。加入5μl叔丁基过氧化物(终浓度25μm)的水溶液，启动反应，并用荧光酶标仪监测460nm下nadph的消耗量随时间的变化。使用60s以内反应初速率对蛋白活性进行评估，此时nadph消耗随时间增长呈线性。

我们对所有化合物进行gpx4的体外活性测试，表现出激活gpx4效果的列入表2。

表2.化合物对gpx4激活

实施例4、化合物在人多形核细胞的炎症模型实验中对花生四烯酸网络代谢产物的影响

抽取2周未服用非甾类抗炎药物的健康志愿者静脉血液。通过ficoll密度离心法，从新鲜血液中分离出多形核细胞(纯度95％)，重悬于pbs缓冲液中，使细胞浓度在1×10⁶个每毫升左右。小分子溶解于dmso中并加入到细胞悬浮液中，dmso终浓度为0.25％。多形核细胞与小分子在37℃先孵育15分钟(空白对照组与dmso孵育)，之后，加入终浓度为10μm的钙离子载体a23187，2mmca²⁺以及2mmmg²⁺，120分钟之后在300μl样品加入700μl冷甲醇中终止反应。加入前列腺素b2作为内标。溶液在氮吹仪下吹干，固体用甲醇重悬，离心之后通过液相色谱-质谱联用检测各种代谢产物浓度。

在未加任何gpx4激活剂时，人多形核细胞被a23187刺激炎症以后，5-lox，12-lox，15-lox通路流量上涨，aa、5-hete、白三烯b4(ltb4)、eoxinc4(exc4)、12-hete、15-hete、20-hete等化合物的浓度显著上升。当gpx4的活性被激活时，12-lox和15-lox通路下游的12-hete和15-hete的含量应该升高。另一方面，在5-lox通路中，gpx4和lta4h会竞争同一个底物5-hpete，因此gpx4的活性被激活时5-hete∶ltb4的比例会升高。gpx4激活剂pkumdl-lc-101可以在人多形核细胞中浓度依赖的激活gpx4的酶活性，使得代谢物5-hete∶ltb4的比例升高，同时12-hete和15-hete的含量升高(见图3)。

这些结果说明本发明的化合物展现出减少炎症因子生成，提高抑炎因子浓度，促进炎症消退的效果。

实施例5、gpx4激活剂对人纤维肉瘤细胞ht-1080的铁死亡模型的影响

最近，gpx4被发现是一种新型细胞死亡方式——铁死亡的核心调控者。为了证明使用gpx4激活剂可以达到抑制铁死亡发生的目的，我们测试了gpx4激活剂pkumdl-lc-101对erastin诱导的铁死亡的影响。在人纤维肉瘤细胞ht-1080中加入eratin(era)会限制细胞中还原型谷胱甘肽的产生，进而抑制依赖于还原型谷胱甘肽的gpx4的活性，诱发铁死亡。实验中，将ht-1080细胞与gpx4激活剂预先孵育30分钟，然后加入致死量的erastin(终浓度10μm)。二十四小时之后，使用mts方法测定细胞的存活率。

ht-1080细胞培养在含有10％fbs，1％非必需氨基酸和1％pen-strep的dmem培养基中，在含有5％co2的37℃培养箱中培养。实验前一天，以2,000个细胞每孔的密度将细胞种到96孔板中。实验当天，将培养基换成含有不同浓度gpx4激活剂的新鲜dmem培养基，在37℃培养箱中孵育30分钟。孵育结束后，加入终浓度为10μm的erastin诱导铁死亡发生。二十四小时后，使用promegamts试剂盒测定细胞存活率。流程如下：在每孔中加入10μlcelltiteraqueousone溶液，之后在含有5％co2的37℃培养箱中孵育1～4小时。孵育结束后，使用bioteksynergy4多功能酶标仪测定490nm波长处的吸收。

在ht-1080细胞中加入gpx4激活剂pkumdl-lc-101，提高了细胞存活率，阻止铁死亡的发生(见图4)。激活剂浓度达到125μm时能拯救40％的细胞。

这些结果说明激活gpx4确实可以阻止铁死亡的发生，我们发现的gpx4激活剂在细胞中可以保护细胞不发生铁死亡。

本发明化合物可激活gpx4活性。细胞实验中，化合物激活gpx4后，展现出减少致炎因子生成，提高抑炎因子浓度的效果，使得花生四烯酸代谢网络整体向有利于炎症消除的状态调整。同时，本发明化合物在细胞实验中，显示出抑制铁死亡发生的作用。