一株忽地笑内生细菌伯克霍尔德氏菌HDXY‑02及其应用的制作方法

本发明属于微生物领域，具体涉及一株忽地笑内生伯克霍尔德氏菌(burkholderiasp.)hdxy-02，同时还涉及一种防治植物真菌病害的伯克霍尔德氏菌hdxy-02的培养方法及用途。

背景技术：

水稻纹枯病又称云纹病，由立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)感染得病，多在高温高湿条件下发生。纹枯病在南方稻区造成的灾害尤为严重，是当前水稻生产上的主要病害之一，该病可使水稻不能抽穗，或抽穗的秕谷较多，粒重下降。由于抗水稻纹枯病的水稻品种的缺乏，目前化学杀菌剂仍然是防治水稻纹枯病的有效手段，其中井冈霉素和艾米是应用的主要农药，艾米的大量使用会对环境造成污染，而且耐艾米的纹枯病菌的出现率也有较大提高；另外，近年来，随着井冈霉素的持续使用，田间也发现了抗井冈霉素的菌株。因此，寻找新的防治水稻纹枯病的措施成为植物病害防治工作的重中之重。

作为植物微生态系统的天然成员，某些内生细菌可通过产生抗生素、水解酶类等抗菌活性物质来抑制病原菌，以达到防治植物病害的目的。利用微生物防治植物真菌病害具有对环境无污染、对人畜无害、减缓病原菌抗药性产生等优点，已成为当前防治植物病害的热点。从棉花、水稻、辣椒、番茄等作物中分离到了多株对植物病害具有良好防治效果的内生细菌，其中有的己经进入应用阶段，并产生了一定的社会效益和环境效益。

前期从忽地笑根中分离到一株具有抗真菌活性的伯克霍尔德氏菌hdxy-02，该菌株对多种植物病原真菌具有较好防效，尤其是对水稻纹枯病菌抑制效果最好。伯克霍尔德氏菌作为生防菌可对植物病害进行防治，其可被制为生物杀菌剂，能够部分替代化学农药，已有几株伯克霍尔德氏属的生防菌被递交到美国环保署(epa)并登记作为生物农药。因此，该属菌株在农业生产和环境保护中可起到重要的作用，有良好的应用前景。

技术实现要素：
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本发明的目的是提供一株对病原真菌具有良好拮抗活性的伯克霍尔德氏菌(burkholderiasp.)hdxy-02，所述伯克霍尔德氏菌(burkholderiasp.)hdxy-02菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.14054，保藏日期为2017年4月20日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

所述伯克霍尔德氏菌hdxy-02的生物学特性为：革兰氏染色阴性(g^─)，细胞为短杆状，无芽孢，好氧，氧化酶试验阳性，明胶液化反应阳性、接触酶反应阳性；在牛肉膏蛋白胨培养基固体培养基上菌落呈淡黄色，圆形，边缘整齐表面光滑，隆起。

所述伯克霍尔德氏菌hdxy-02，来源于健康的忽地笑根部，对水稻纹枯病具有良好生防效果。扩增所述菌株hdxy-02的16srdna序列，经ncbi在线比对，结合生理生化试验结果确定菌株hdxy-02为伯克霍尔德氏菌。

本发明的另一个目的是在于提供了一种防治植物真菌病害的伯克霍尔德氏菌hdxy-02的培养方法。包括伯克霍尔德氏菌hdxy-02在发酵培养基中培养的步骤。

所述的伯克霍尔德氏菌hdxy-02或以伯克霍尔德氏菌hdxy-02为活性成分的菌剂在生产中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的又一目的是提供一种制备生防菌剂的方法，该菌剂的活性成分为所述的伯克霍尔德氏菌hdxy-02。通过制备含有伯克霍尔德氏菌hdxy-02的发酵液或含有伯克霍尔德氏菌hdxy-02的发酵液经过滤后得到的无菌发酵上清液，所述的无菌发酵上清液使用伯克霍尔德氏菌hdxy-02发酵液经过离心取得的上清液，再经过细菌滤器过滤获得。制备方法简便易行，未使用有机溶剂，对环境安全无污染。

本发明还提供上述伯克霍尔德氏菌hdxy-02在抑制水稻纹枯病菌中的应用。所述伯克霍尔德氏菌hdxy-02的发酵产物能有效抑制水稻纹枯病菌菌丝的生长。

上述忽地笑内生细菌hdxy-02在抑制病原真菌中的应用，即伯克霍尔德氏菌hdxy-02对病原真菌的抑制作用还包括：水稻稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、棉花枯萎病菌和油菜菌核病菌，因此，该忽地笑内生细菌hdxy-02可应用于防治水稻纹枯病、水稻稻瘟病、小麦赤霉病、棉花枯萎病和油菜菌核病。

本发明提供的一种伯克霍尔德氏菌hdxy-02，是一株忽地笑内生细菌，对水稻纹枯病菌抑菌作用强。菌株hdxy-02对多种病原真菌具有抑菌作用，具有非常广泛的抑菌谱。上述菌株hdxy-02培养条件简单，易于保存和生产，生长速度快，在植物病害生物防治中起到非常重要的作用，特别是对水稻纹枯病菌的防治具有重要的意义，可作为一种具有良好开发应用前景的广谱型杀菌剂。

附图说明：

图1为伯克霍尔德氏菌hdxy-02的菌落形态。

图2为伯克霍尔德氏菌hdxy-02的16srdna序列的电泳图谱。

图3为伯克霍尔德氏菌hdxy-02对水稻纹枯病菌的拮抗作用结果图。

图4为伯克霍尔德氏菌hdxy-02无菌发酵上清液对水稻纹枯病菌菌丝生长的影响。

具体实施方式：

以下结合实施例并附图，对本发明的具体实施方式作进一步的详述。

以下实施例中所使用的培养基配方为：

pda固体培养基配方：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容至1l，ph自然；

na培养基配方：牛肉浸膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水定容至1l，ph7.3；

nb培养基配方：牛肉浸膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水定容至1l，ph7.3。

实施例1：内生菌的分离

取忽地笑根适量，在超净工作台上用70％乙醇浸泡1min，再用0.1％升汞浸泡6min，选择性地使用70％乙醇浸泡1min，使用无菌水冲洗3-5次。称取1g表面灭菌的根浸于10ml水中在无菌研钵中研碎，静置后取上清液用无菌水做梯度稀释，取适当的稀释度在na平板上均匀涂布，培养皿干后在28℃下倒置培养，2-3d后，将不同大小、颜色及形态的菌落挑取至新的na平板上进行划线纯化，对分离到的待测单菌落进行编号，并用甘油保藏法将纯化好的菌落置于超低温冰箱中备用。

实施例2：菌株hdxy-02对多种病原真菌的拮抗作用

na培养基活化分离到的内生细菌，进行拮抗试验，采用pda平板培养基，采用平板对峙法，无菌打孔器打取直径为6mm的供试真菌菌饼，置于直径为90mm的pda平板中央，培养2-3d后，将活化的内生菌接种于距菌块3cm的两侧，28℃恒温培养3-5天。以只接病原菌，不接分离菌株为对照，定时观察，测量内生菌对供试病原真菌之间的抑菌带宽度和菌落半径，作为判断其拮抗能力的指标。获得一株对多种植物病原菌具有拮抗作用的内生菌hdxy-02。图3为菌株hdxy-02对水稻纹枯病菌的拮抗作用效果图。

试验结果表明，本发明伯克霍尔德氏菌hdxy-02对水稻纹枯病菌(rhizoctorziasolani)、小麦赤霉病菌(fusariumtgraminearumt)、水稻稻瘟病菌(magnaportheoryzae)、油菜菌核病菌(sclerotinialibertiana)和棉花枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum)这5种病原真菌均具有抑菌作用。结果如表1所示，尤其是对水稻纹枯病菌的抑制效果最佳，抑制率达到72％以上，因此菌株hdxy-02为一株对病原真菌具有较强抑制作用的菌株。

表1菌株hdxy-02与多种植物病原真菌对峙试验结果

实施例3：本发明菌株hdxy-02的16srdna序列的克隆分析

提取菌株hdxy-02基因组dna，以此作为模板，采用细菌通用引物pcr扩增其16srdna片段。取pcr产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，将pcr产物回收纯化，送上海生工测序。pcr所用引物为：16s-27：5’-agagtttgatcctggctcag-3’；16s-1492:5’-ggttaccttgttacgactt-3’。pcr反应体系(25μl)：稀释dna模板lμl；dntp2μl；引物16s-27lμl；引物16s-1492lμl；10×pcrbuffer2.5μl；taqdna聚合酶0.2μl；灭菌超纯水补足至终体积25μl。pcr反应条件为94℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃1.5min，28个循环；72℃10min。

16srdna序列(seqidno.1所示)blast分析结果表明本发明菌株与伯克霍尔德氏菌(burkholderiasp.)同源性达到99％。结合菌株的菌落形态、生理生化试验结果及16srdna序列分析，将菌株hdxy-02鉴定为伯克霍尔德氏菌(burkholderiasp.)。

实施例4：菌株hdxy-02的培养方法

具体步骤如下：a、挑取菌株hdxy-02至5mlnb培养液中活化22-26h，温度28-30℃，摇床转速180-220r/min；

b、将步骤(a)中活化的菌株hdxy-02培养液吸取1ml(接种量2％)接种到含有50ml发酵培养基(发酵培养基配方：蛋白胨10-20g，甘油5-15ml，磷酸氢二钾1-3g，硫酸镁0.5-2g，定容至1l，ph6.5-7.5)的250ml三角瓶中，温度28-30℃，摇床转速180-220r/min，震荡培养48h-72h；

c、将步骤(b)获得的发酵液于4℃条件下5000-8000rpm离心10-20min，再经细菌滤器(0.22μm)过滤得到无菌发酵上清液；

d、用无菌水将菌体洗涤3-5次，制成其菌悬液。将无菌发酵上清、菌悬液置于4℃条件下保存备用。

实施例5：菌株hdxy-02的无菌发酵液对水稻纹枯病菌菌丝生长的抑制作用

a、将菌株hdxy-02接种至5mlnb培养液中活化24h，将活化的hdxy-021ml接种到含有50ml发酵培养基的250m1三角瓶中，28℃，200rpm，振荡培养48h。将发酵液置4℃，8000rpm离心10min，上清液用细菌滤器(0.22μm)过滤，得到无菌发酵液。

b、将发酵上清液按1％、5％、10％、15％、20％、25％和30％的比例加入pda固体培养基中，每个平板上接种直径为5mm的菌菌丝块，每个处理3次重复，取3次平行试验得结果，28℃培养，于5d后测量水稻纹枯病菌的菌落直径并记录相关数据。

试验结果见图4，菌株hdxy-02不同浓度无菌发酵液均能够抑制水稻纹枯病菌菌丝的生长，且随着浓度的增加抑制率逐渐加强。pda平板上观察菌株hdxy-02不同浓度的无菌发酵滤液对水稻纹枯病菌菌丝生长的抑制效果可见菌丝生长受到抑制，生长缓慢的现象。

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<110>江苏省中国科学院植物研究所

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