本发明涉及一种利用表面活性剂制备高酯化活性脂肪酶的方法，属于酶工程技术领域。
背景技术：
脂肪酶(ec3.1.1.3)，即三酰甘油酯水解酶，是一种广泛存在于动物、植物和多种微生物中的生物催化剂，最早发现于1901年，其主要催化功能在于可以在水-脂界面水解长链三脂酰甘油酯。脂肪酶之所以在生物催化中倍受关注，除了其具有催化化合物酯键水解的能力外，还由于脂肪酶在非水相中可以催化反向的酯化反应和转酯化反应，因而在生物化工领域受到广泛的重视。脂肪酶能够进行非常特殊的化学转化(生物转化)使得它们在食品，洗涤剂，化妆品，有机合成和制药工业中日益流行。例如加工食品，治理废水，生物表面活性剂的合成，处理木材纤维素纸浆纸树脂，手性药物的生物合成等。此外，脂肪酶还具有稳定性佳，转化效率高等优点，在芳香酯、生物柴油、手性化合物的生产中具有良好的应用价值。
虽然脂肪酶都具有催化各种化合物酯键水解的能力，但是能够催化非水相酯化反应的脂肪酶种类却非常有限，绝大部分微生物脂肪酶都不表现出明显的催化非水相酯合成的能力。有些脂肪酶在异源表达之后也只表现出显著的水解活性，相对于其野生型的脂肪酶严重丧失了催化酯类合成的能力。这一现象严重制约了脂肪酶在工业生产中的应用。
一些蛋白质修饰技术可以用来调节和提高酶的活性，如有机溶剂修饰、固定化技术等，但这些技术往往无法从本质上改变脂肪酶的催化性能。表面活性剂也可以用于调节脂肪酶的催化活性，一般以提高脂肪酶的水解活性为主。利用表面活性剂改善脂肪酶催化非水相活性的研究近年来已有报道，包括合成特定的表面活性剂处理脂肪酶形成“包衣酶”或者形成反胶束，增加酶蛋白在非水相中的溶解性；以某些表面活性剂处理脂肪酶后再除去表面活性剂的分子印迹技术等。这些技术虽然有时效果明显，但一般处理较为复杂，而且通常不具有通用性。开发一些简单方便而且较为通用的提高脂肪酶催化非水相酯合成活性的技术具有显著的实际应用价值。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明通过直接利用表面活性剂，在水溶液中与可溶性脂肪酶蛋白相互作用，改变脂肪酶的微结构，通过冷冻干燥获得满足脂肪酶非水相催化的具有高酯化活性的脂肪酶，并考察了对不同脂肪酶的效用，对于其他脂肪酶的改造和制备也提供了有价值的方案。
本发明提供了一种利用表面活性剂制备脂肪酶提高其催化酯合成活性的方法。本发明采用添加表面活性剂的方法对脂肪酶进行处理，通过冷冻干燥获得了具有催化酯合成能力的脂肪酶，解决了许多脂肪酶不表现酯化活性以及脂肪酶在工程菌异源表达后丧失酯合成能力的问题，为拓宽脂肪酶的工业应用奠定了基础。
所述提高脂肪酶催化酯合成活性的方法，是直接在可溶性脂肪酶的水性溶液中添加表面活性剂进行混合，提供疏水环境，使微结构发生调整的脂肪酶重新恢复合成酯的能力，获得高的酯合成活性。
在本发明的一种实施方式中，所述酯合成活性是指在非水相中催化酯合成的活性。
在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶的水性溶液，是直接将脂肪酶(粉)溶解于水性溶液得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述水性溶液可以是水、各种缓冲溶液等。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲溶液可以是磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液、tiris缓冲液等。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为25-100mmol·l-1ph6.5-8.0的缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为25mmol·l-1ph7.5的磷酸缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶包括但不限于华根霉脂肪酶r27rcl、米根酶脂肪酶rol、洋葱假单胞菌脂肪酶pcl、南极假丝酵母脂肪酶calb等。
在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶可以是异源表达的脂肪酶、工程菌表达的脂肪酶，或者其他任何相对于野生酶来说酯化活力下降或消失的脂肪酶。
在本发明的一种实施方式中，所述可溶性脂肪酶水溶液中，纯酶的蛋白浓度介于0.1至0.4mg·ml-1之间，以保证蛋白能够完全的和表面活性剂发生作用。
在本发明的一种实施方式中，所述表面活性剂可以是两性离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂等中的一种或者两种以上组合。不同表面活性剂对不同脂肪酶效果不同。但不限于上述表面活性剂
在本发明的一种实施方式中，所述两性离子表面活性剂为3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(chaps)、聚乙二醇辛基苯基醚(tritonx-100)、1-肉豆蔻-2-酰基-顺式-丙三基-磷脂胆碱(lpc14)、1,2-二己酰卵磷脂(dic6pc)、1-月桂蔻-2-酰基-顺式-丙三基-磷脂胆碱(lpc12)、1-棕榈蔻-2-酰基-顺式-丙三基-磷脂胆碱(lpc16)、1-月桂蔻-2-酰基-顺式-丙三基-磷酸-1-甘油(lpg12)、1-肉豆蔻-2-酰基-顺式-丙三基-磷酸-1-甘油(lpg14)、1-棕榈蔻-2-酰基-顺式-丙三基-磷酸-1-甘油(lpg16)、1,2-二庚酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(dhpc)等中的一种或者两种以上组合。
在本发明的一种实施方式中，所述非离子表面活性剂为十二烷基-β-d-麦芽糖苷(ddm)、辛乙烯二醇单正十二烷基酯(c12e8)、十烷基-β-d-麦芽糖苷(dm)、十一烷基-β-d-麦芽糖苷(udm)、辛基-β-d-吡喃葡萄糖苷(og)、聚辛乙二醇单癸醚(c10e8)中的一种或者两种以上组合。
在本发明的一种实施方式中，阳离子表面活性剂ctab等多种。
在本发明的一种实施方式中，所述表面活性剂水溶液短期内4℃储存备用。
在本发明的一种实施方式中，蛋白溶液与表面活性剂是按照体积比1:0.5～1:2进行混合。
在本发明的一种实施方式中，蛋白溶液与表面活性剂是按照体积比1:1混合。
在本发明的一种实施方式中，表面活性剂的终浓度在0.1倍临界胶束浓度(0.1xcmc)到200倍临界胶束浓度(200xcmc)之间。
在本发明的一种实施方式中，表面活性剂的终浓度在10倍临界胶束浓度(10xcmc)到200倍临界胶束浓度(200xcmc)之间。
在本发明的一种实施方式中，表面活性剂的终浓度为100倍临界胶束浓度。
在本发明的一种实施方式中，添加的表面活性剂的添加量为终浓度1-500mm。
在本发明的一种实施方式中，添加的表面活性剂的添加量为终浓度10mm。
在本发明的一种实施方式中，添加表面活性剂后，可以进一步提高华根霉脂肪酶r27rcl、米根酶脂肪酶rol、洋葱假单胞菌脂肪酶pcl、南极假丝酵母脂肪酶calb等的酯化活性和/或总酯化活性回收率。
在本发明的一种实施方式中，所述方法还包括混合后的去除水分步骤。
本发明的第二个目的是提供一种非水相催化酯合成活性提高的脂肪酶制剂，所述脂肪酶制剂是将脂肪酶溶于水性溶液后直接添加表面活性剂进行混合，然后去除水分得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述去除水分为干燥，可以是冷冻干燥。
在本发明的一种实施方式中，所述水性溶剂可以是水或者缓冲溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶可以是异源表达的脂肪酶、工程菌表达的脂肪酶，或者其他任何相对于野生酶来说酯化活力下降或消失的脂肪酶。
本发明的第三个目的是提供所述脂肪酶制剂在催化酯合成反应方面的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述酯合成反应为非水相酯合成反应。
本发明的第四个目的是提供所述脂肪酶制剂在食品领域、化工领域、生物领域、制备药物、环境领域、石油领域等的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用，包括但不限于应用于洗涤剂、化妆品、治理废水、生物表面活性剂的合成、处理木材纤维素纸浆纸树脂、手性药物的生物合成、芳香酯生产、生物柴油生产、手性化合物生产等。
本发明的有益效果：
(1)蛋白质的构象及性质与其所处的环境紧密相关，本发明通过添加表面活性剂，模拟细胞膜疏水微环境对脂肪酶进行体外活性调节，实现脂肪酶酯合成能力的提高，成功获得了高酯化活性的脂肪酶制剂。
(2)本发明的方法对毕赤酵母pichiapastoris表达的华根霉脂肪酶r27rcl、商品化米根酶脂肪酶rol、商品化洋葱假单胞菌脂肪酶pcl、商品化南极假丝酵母脂肪酶calb等多种脂肪酶均可适用，能够使脂肪酶酯化活性从无变有或者提高8-30倍、总酯化活性回收率达105％-1733％。
具体实施方式
脂肪酶测定方法：
(1)对硝基苯酚棕榈酸酯(pnpp)法测定脂肪酶水解活力：
脂肪酶水解pnpp产生对硝基苯酚和棕榈酸，对硝基苯酚在ph8.0的缓冲中显黄色，且在410nm波长处有最大的吸收峰，通过测定对硝基苯酚在410nm处的吸收值可测定脂肪酶的活力。
反应底物：
底物一：0.25g阿拉伯胶+0.52g脱氧胆酸钠用50mmol·l-1的ph＝8.0的磷酸buffer定容至450ml。底物二：0.015gpnpp溶于5ml异丙醇。底物一和二混合后备用。
终止液(g·l-1)：naoh40g，edta钠盐93.05g。反应终止后加入62μl。
测定方法：
在2.4ml的上述底物中，加入0.1ml适当稀释的酶液(空白对照用稀释的失活酶液代替)，40℃条件下反应2min后测定410nm处的吸光度。
酶活定义：
40℃条件下每分钟产生1μmol对硝基苯酚的酶量为一个脂肪酶水解酶活单位。
计算公式：
酶活(u·ml-1)＝(v×a410×106)/(ε×t×v’)
其中：v—反应体积(ml)；ε—摩尔消光系数(ml·mmol-1)；t—反应时间(min)；v’—酶液体积(ml)
(2)气相色谱法测定脂肪酯化活力：
反应底物：
底物一：取48.5ml正辛酸加入250ml容量瓶，正庚烷定容。
底物二：取17.5ml无水乙醇加入250ml容量瓶，正庚烷定容。
内标：
2-己醇/庚烷(35g·l-1)
标准样品：
取10g正辛酸乙酯加入1000ml容量瓶，正庚烷定容。
测定方法：
分别取1ml两种反应底物于5ml具塞塑料管中，加入约20mg脂肪酶粉(或冻干粉)，40℃，150r·min-1下振荡反应30min。膜过滤或离心除去脂肪酶，取0.4ml滤液或上清液，加入0.1ml内标2-己醇，混匀，以气相色谱法根据辛酸乙酯标样与内标峰面积之比测定反应液中辛酸乙酯的含量。
气相色谱仪为agilent6820，色谱柱为ac20(peg20000)，配备氢火焰离子检测器，以氮气为载气。气相色谱分析条件为：色谱柱初始温度90℃，保持1min，10℃·min-1升温至200℃，保持5min，检测器温度250℃，进样器温度250℃。
酶活定义：
在测定条件下，每分钟转化形成1μmol辛酸乙酯所需的酶量定义为1个脂肪酶有机相合成酶活单位。
计算公式：
a样—待测样品与内标峰面积之比
a标—标准标样与内标峰面积之比
s标—标准样品的浓度(g·l-1)
v—反应液体积(l)
172—产物(正辛酸乙酯)分子量(g·mol-1)
30—反应时间(min)
m—反应酶粉质量(mg)
实施例1：提高脂肪酶催化酯合成活性的操作方法
以1：1的体积比将制备好的高浓度表面活性剂溶液母液添加到脂肪酶蛋白水溶液中，脂肪酶蛋白的终浓度为0.25mg·ml-1，表面活性剂溶液的终浓度为10mm。充分混合后进行样品的冷冻干燥，干燥保存备用。
实施例2：商品化华根霉脂肪酶r27rcl酯化活力的恢复
商品化的华根霉脂肪酶r27rcl购自江苏一鸣生物科技有限公司，具有较高的水解活性，但催化酯合成的能力较低。将该脂肪酶酶粉复溶后取上清进行活性调节处理(蛋白终浓度0.2mg·ml-1，表面活性剂终浓度10mm；10mm在表1的表面活性剂的0.1xcmc～200xcmc之间)，结果如表1所示，添加lpc14时，酯化活性由5.5u·mg-1提高到47.6u·mg-1，总酯化活性回收率达到769％，而水解活性没有明显的变化，由115.7u·mg-1变为116.1u·mg-1。
表1活性调节前后的华根霉脂肪酶r27rcl的酯化活性和水解活性对比
实施例3：商品化米根酶脂肪酶rol酯化活力的恢复
商品化的米根酶脂肪酶rol购买自sigma-aldrich公司，非固定化酶制剂粉末，复溶后取上清进行活性调节处理(蛋白终浓度0.2mg·ml-1，表面活性剂终浓度10mm)，结果如表2所示，添加lpc14时，酯化活性由0.4u·mg-1提高到12.2u·mg-1，总酯化活性回收率达到1733％。
表2活性调节前后的米根酶脂肪酶rol的酯化活性和水解活性对比
实施例4：商品化洋葱假单胞菌脂肪酶pcl酯化活力的恢复
商品化洋葱假单胞菌脂肪酶pcl购买自sigma-aldrich公司，非固定化酶制剂粉末，复溶后取上清进行活性调节处理(蛋白终浓度0.2mg·ml-1，表面活性剂终浓度10mm)，结果如表3所示，添加ddm时，酯化活性由2.5u·mg-1提高到55.6u·mg-1，总酯化活性回收率达到1435％。
表3活性调节前后的洋葱假单胞菌脂肪酶pcl的酯化活性和水解活性对比
实施例5：商品化南极假丝酵母脂肪酶calb酯化活力的恢复
商品化南极假丝酵母脂肪酶calb购买自sigma-aldrich公司，非固定化酶制剂粉末，复溶后取上清进行活性调节处理(蛋白终浓度0.12mg·ml-1，表面活性剂终浓度10mm)，结果如表4所示，添加ddm时，酯化活性由7.8u·mg-1提高到101.9u·mg-1，总酯化活性回收率达到700％。
表4活性调节前后的南极假丝酵母脂肪酶calb的酯化活性和水解活性对比
实施例6：不同表面活性剂浓度对商品化华根霉脂肪酶r27rcl酯化活力的恢复
商品化的华根霉脂肪酶r27rcl购自江苏一鸣生物科技有限公司，具有较高的水解活性，但催化酯合成的能力较低。将该脂肪酶酶粉复溶后取上清进行活性调节处理(蛋白终浓度0.2mg·ml-1)，结果如表5所示，在添加不同浓度lpc14时酯化活性有明显的变化，结果如表5所示，酯化活性在较高的表面活性剂浓度下(100xcmc)提高明显。
表5不同浓度lpc14对华根霉脂肪酶r27rcl酯化活性和水解活性的影响
实施例7：不同表面活性剂lpc14浓度对商品化米根酶脂肪酶rol酯化活力的恢复
商品化的米根酶脂肪酶rol购买自sigma-aldrich公司，非固定化酶制剂粉末，复溶后取上清进行活性调节处理(蛋白终浓度0.2mg·ml-1)，在添加不同浓度lpc14时酯化活性有明显的变化，结果如表6所示，酯化活性在较高的表面活性剂浓度下(10x-100xcmc)有较为明显的提高。
表6不同浓度lpc14对米根霉脂肪酶rol酯化活性和水解活性的影响
实施例8：不同表面活性剂ddm浓度对商品化洋葱假单胞菌脂肪酶pcl酯化活力的恢复
商品化洋葱假单胞菌脂肪酶pcl购买自sigma-aldrich公司，非固定化酶制剂粉末，复溶后取上清进行活性调节处理(蛋白终浓度0.2mg·ml-1)，在添加不同浓度ddm时酯化活性有明显的变化，结果如表7所示，酯化活性在较高的表面活性剂浓度下(10x-100xcmc)有着较为明显的提高。
表7不同浓度ddm对洋葱假单胞菌脂肪酶pcl酯化活性和水解活性的影响
实施例9：不同表面活性剂浓度对商品化南极假丝酵母脂肪酶calb酯化活力的恢复
商品化南极假丝酵母脂肪酶calb购买自sigma-aldrich公司，非固定化酶制剂粉末，复溶后取上清进行活性调节处理(蛋白终浓度0.12mg·ml-1)，在添加不同浓度ddm时酯化活性有明显的变化，结果如表8所示，酯化活性在较高的表面活性剂浓度下(100xcmc)有较为明显的提高。
表8不同浓度ddm对南极加丝酵母脂肪酶calb酯化活性和水解活性的影响
综上，本发明通过模拟蛋白所处的细胞疏水微环境对脂肪酶进行体外活性调节，成功获得了高酯化活性的脂肪酶制剂。工程菌巴斯德毕赤酵母pichiapastoris表达的华根霉脂肪酶r27rcl经处理后酯化活性由5.5u·mg-1提高到47.6u·mg-1，总酯化活性回收率达到769％；商品化米根酶脂肪酶rol经处理后酯化活性由0.4u·mg-1提高到12.2u·mg-1，总酯化活性回收率达到1733％；商品化洋葱假单胞菌脂肪酶pcl经处理后酯化活性由2.5u·mg-1提高到55.6u·mg-1，总酯化活性回收率达到1435％；商品化南极假丝酵母脂肪酶calb经处理后酯化活性由7.8u·mg-1提高到101.9u·mg-1，总酯化活性回收率达到700％。不同表面活性剂浓度对于脂肪酶酯化活性的恢复有着较为明显的影响，其中较高浓度(10x-100xcmc)下的表面活性剂能够更好的提高脂肪酶酯化活性。酯化活性相对比活力及总活力回收率的共提高，表明体外模拟细胞疏水环境的活性调节处理对脂肪酶的酯化活性产生了积极影响，并且不仅针对华根霉脂肪酶有效，而在一定程度上对多种脂肪酶具有普遍适用性。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。