一种从细茎石斛中碱提的水溶性中性多糖及其制备方法与流程

本发明涉及中药材加工技术领域，尤其涉及一种从细茎石斛中碱提的水溶性多糖及其制备方法。

背景技术：

石斛为传统名贵中草药，其化学成分和药理活性引人瞩目。目前，石斛属植物化学成分的研究主要以低极性的小分子为主，石斛多糖由于组成复杂、结构相似，其分离纯化和结构鉴定较为困难，研究起步较晚，研究成果也少。近年来，由于现代分析技术的发展，石斛多糖的研究由于其独特的药理特性，逐渐引起人们的重视。细茎石斛是传统药用石斛的主要来源植物，具有抗肿瘤、降血脂的功效。多糖在石斛中的含量较高，一般含量为10～20wt％，但是含有的多糖种类非常多，据报道，石斛中多糖种类超过二十种以上，且酸性多糖含量较多。石斛中多糖的抗肿瘤、降血脂功效究竟是由哪一种多糖，还是多种多糖共同作用的结果，还一直是目前研究的前沿课题。因此，提取纯化得到一种多糖，阐述其结构及其功效，对石斛多糖应用于医药保健领域非常重要。

目前国内外文献中对细茎石斛多糖的研究仅限于热水提取的多糖，对其他石斛多糖的研究也主要限于石斛多糖混合物的提取及总多糖功效的研究，对石斛中某一纯多糖的提取纯化、结构及其功效的则很少涉及。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有高效降血糖作用的高纯度细茎石斛水溶性中性多糖以及该多糖的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下方案实现：

一种从细茎石斛中碱提的水溶性中性多糖，所述水溶性多糖的重均分子量为0.9～1.2万，由葡萄糖残基、半乳糖残基、木糖残基、甘露糖残基和阿拉伯糖残基链接组成；其主链由β-(1→3)-d-、β-(1→4)-d-葡萄糖残基和β-(1→3)-d-、β-(1→4)-d-半乳糖残基组成，支链由甘露糖残基和阿拉伯糖残基组成，高度支化，且含有10～20wt％末端木糖残基。

所述水溶性中性多糖的重复结构单元结构如下：

上述水溶性多糖的制备方法如下：

s1：将干燥的细茎石斛粉碎并脱脂；

s2：将脱脂后的细茎石斛粉碎物置于生理盐水中高温浸泡，后分离出残渣；

s3：将步骤s2得到的残渣置于碱液中处理，后离心收集上清液；

s4：将上清液中和至中性，并依次经过脱色、脱蛋白、透析和浓缩得粗多糖水溶液；

s5：将粗多糖水溶液进行离子交换处理，收集蒸馏水级份，依次经过浓缩、冷冻干燥得水溶性中性多糖。

步骤s1中，干燥的细茎石斛粉碎后，采用有机溶剂通过索氏提取去除脂肪。优选的，所述有机溶剂为乙酸乙酯和丙酮，干燥的细茎石斛粉碎后，依次用乙酸乙酯、丙酮通过索氏提取去除脂肪。

步骤s2中，脱脂后的细茎石斛粉碎物置于111～131℃的生理盐水中高温浸泡15～45min。分离出的残渣置于生理盐水中高温浸泡并分离，重复操作3～5次。

步骤s3中，所述碱液为1～2m的naoh水溶液，所述naoh水溶液中含有0.4～0.7wt％的nabh4。残渣置于碱液中于室温条件下搅拌2～4h。

步骤s4中，所述上清液用醋酸中和至中性。

步骤s5中，所述的离子交换处理为将粗多糖水溶液过deae纤维素离子交换柱。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本申请提供了一种能制备出高纯度的水溶性中性多糖的方法。该多糖的主链由β-(1→3)-d-、β-(1→4)-d-葡萄糖残基和β-(1→3)-d-、β-(1→4)-d-半乳糖残基组成，支链由甘露糖残基和阿拉伯糖残基组成，高度支化，且含有10～20wt％末端木糖残基，具有显著的降血糖作用。

附图说明

图1为实施例1多糖dmp-1的红外光谱图；

图2为实施例1多糖dmp-1单糖组分的气相色谱图。

具体实施方式

为了让本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明作进一步阐述。

实施例1

一种从细茎石斛中碱提的水溶性中性多糖的制备方法，包括如下步骤：

s1：购买滇产细茎石斛，晒干粉碎后以依次用乙酸乙酯和丙酮通过索氏提取回流4h脱脂；

s2：将脱脂后的细茎石斛粉碎物干燥后浸泡在0.9％的nacl水溶液中，在121℃高温条件下浸泡30min，分离出残渣，该残渣继续浸泡在0.9％的nacl水溶液中，在121℃高温条件下浸泡30min，重复操作三次；

s3：将步骤s2得到的残渣置于1mnaoh的水溶液(含0.5wt％nabh4)中，室温搅拌2h，后离心收集上清液；

s4：上清液使用醋酸中和至中性；用30wt％h2o2脱色至浅黄色，离心得到浅黄色澄清溶液；该溶液用sevag法除去游离的蛋白质，将氯仿和正丁醇混合液(体积比为5:1)与多糖溶液混合，剧烈搅拌30min，用分液漏斗静置分层除去变性蛋白质，反复进行5次；然后分别用自来水、蒸馏水经再生纤维素膜透析袋(mwcut-off3500,usa)透析4天和3天，然后45℃真空旋转蒸发浓缩，得到粗多糖水溶液；此粗多糖水溶液包含各种酸性多糖和所需的中性多糖；

s5：将粗多糖水溶液离心过滤得到澄清溶液后，加入deae纤维素离子交换柱中，通过在deae纤维素阴离子树脂上的吸附差别，用蒸馏水作为流动相，收集蒸馏水级份，其中含所需的中性多糖，最后浓缩、冷冻干燥得到水溶性中性多糖纯品dmp-1。

通过尺寸排除色谱(sec)、元素分析、红外光谱(ir)、单糖组成气相色谱(gc)、甲基化分析表明，该细茎石斛多糖dmp-1是一种多糖纯品，纯度高于96％，具有高度分支结构的杂多糖，由葡萄糖残基、半乳糖残基、木糖残基、甘露糖残基和阿拉伯糖残基链接组成，该多糖的主链由β-(1→3)-d-、β-(1→4)-d-葡萄糖残基和β-(1→3)-d-、β-(1→4)-d-半乳糖残基组成，支链由甘露糖残基和阿拉伯糖残基组成，高度支化，且含有12.5wt％末端木糖残基。该细茎石斛多糖dmp-1可溶解于水和二甲基亚砜(dmso)，不溶解于甲醇、乙醇和丙酮。

该水溶性中性多糖的重复结构单元结构如下：

图1示出细茎石斛多糖dmp-1红外光谱(ir)，在1700cm^-1处无吸收峰，说明dmp-1中不含糖醛酸，为一种中性多糖。该多糖dmp-1的元素分析结果见附表1，c：h：o约等于1：2：1，未含n元素，表明该多糖dmp-1未含蛋白质，其元素含量与多糖结构一致。将dmp-1强酸水解为单糖后，再乙酰化，然后进行气相色谱分析(见图2)，可得到该多糖的单糖组成，多糖dmp-1由葡萄糖残基、半乳糖残基、木糖残基、甘露糖残基和阿拉伯糖残基链接组成，其摩尔比为0.474：0.296：0.146：0.068：0.016。将dmp-1完全甲基化后，再乙酰化，然后进行气相色谱-质谱联用(gc-ms)分析(见附表2)，可得到dmp-1的单糖键接方式。dmp-1的gc-ms结果表明该多糖dmp-1为一种高度支化的多糖，其主链主要由β-(1→3)-d-、β-(1→4)-d-葡萄糖残基和β-(1→3)-d-、β-(1→4)-d-半乳糖残基组成，支链由甘露糖残基和阿拉伯糖残基组成，含有12.5wt％末端木糖残基。该多糖dmp-1通过激光光散射-尺寸排除色谱(lls-sec)测试结果表明，其重均分子量为1.01万。

附表1.细茎石斛多糖dmp-1元素分析结果

附表2.细茎石斛多糖dmp-1单糖组成及键接方式结果

细茎石斛多糖dmp-1的降血糖作用：将caco-2细胞接种于96孔板，3天后，换成含100μg/ml多糖dmp-1样品、5mm葡萄糖的pbs溶液，4h后取pbs上清液，测定pbs中剩余的葡萄糖浓度。结果显示：空白对照组未被吸收的葡萄糖光密度为0.052，多糖dmp-1组未被吸收的葡萄糖光密度为0.060，高于空白对照组，说明多糖dmp-1可以减缓caco-2肠道上皮细胞对葡萄糖的吸收。

将细茎石斛多糖dmp-1以50mg/kg剂量口服灌胃给c57bl/6小鼠，1小时后进行口服糖耐量实验。结果显示：1小时后，空白对照组中小鼠血液中葡萄糖含量为12mmol/l，多糖dmp-1组中小鼠血液中葡萄糖含量仅为8mmol/l，说明多糖dmp-1可以降低口服糖耐量实验中的血糖水平，即可以降低餐后血糖。

实施例2

一种从细茎石斛中碱提的水溶性中性多糖的制备方法，包括如下步骤：

s1：购买滇产细茎石斛，晒干粉碎后以依次用乙酸乙酯和丙酮通过索氏提取回流4h脱脂；

s2：将脱脂后的细茎石斛粉碎物干燥后浸泡在0.9％的nacl水溶液中，在111℃高温条件下浸泡45min，分离出残渣，该残渣继续浸泡在0.9wt％的nacl水溶液中，在111℃高温条件下浸泡45min，重复操作五次；

s3：将步骤s2得到的残渣置于1mnaoh的水溶液(含0.4wt％nabh4)中，室温搅拌4h，后离心收集上清液；

s4：上清液使用醋酸中和至中性；用30wt％h2o2脱色至浅黄色，离心得到浅黄色澄清溶液；该溶液用sevag法除去游离的蛋白质，将氯仿和正丁醇混合液(体积比为5:1)与多糖溶液混合，剧烈搅拌60min，用分液漏斗静置分层除去变性蛋白质，反复进行5次；然后分别用自来水、蒸馏水经再生纤维素膜透析袋(mwcut-off3500,usa)透析4天和3天，然后45℃真空旋转蒸发浓缩，得到粗多糖水溶液；此粗多糖水溶液包含各种酸性多糖和所需的中性多糖；

s5：将粗多糖水溶液离心过滤得到澄清溶液后，加入deae纤维素离子交换柱中，通过在deae纤维素阴离子树脂上的吸附差别，用蒸馏水作为流动相，收集蒸馏水级份，其中含所需的中性多糖，最后浓缩、冷冻干燥得到水溶性中性多糖纯品dmp-2。

通过尺寸排除色谱(sec)、元素分析、红外光谱(ir)、单糖组成气相色谱(gc)、甲基化分析表明，该细茎石斛多糖dmp-2是一种多糖纯品，纯度高于95％，具有高度分支结构的杂多糖，由葡萄糖残基、半乳糖残基、木糖残基、甘露糖残基和阿拉伯糖残基链接组成，该多糖的主链由β-(1→3)-d-、β-(1→4)-d-葡萄糖残基和β-(1→3)-d-、β-(1→4)-d-半乳糖残基组成，支链由甘露糖残基和阿拉伯糖残基组成，高度支化，且含有13.0wt％末端木糖残基。该细茎石斛多糖dmp-2可溶解于水和二甲基亚砜(dmso)，不溶解于甲醇、乙醇和丙酮。

该水溶性中性多糖的重复结构单元结构如下：

多糖dmp-2的元素分析结果见附表3，结果表明c：h：o约等于1：2：1，未含n元素，表明该多糖dmp-2未含蛋白质，其元素含量与多糖结构一致。将多糖dmp-2完全甲基化后，再乙酰化，然后进行气相色谱-质谱联用(gc-ms)分析(见附表4)，可得到dmp-2的单糖键接方式。dmp-2的gc-ms结果表明，该多糖dmp-2为一种高度支化的多糖，其主链主要由β-(1→3)-d-、β-(1→4)-d-葡萄糖残基和β-(1→3)-d-、β-(1→4)-d-半乳糖残基组成，支链由甘露糖残基和阿拉伯糖残基组成，含有13.0wt％末端木糖残基。该多糖dmp-2通过激光光散射-尺寸排除色谱(lls-sec)测试结果表明，其重均分子量为1.12万。

附表3.细茎石斛多糖dmp-2元素分析结果

附表4.细茎石斛多糖dmp-2单糖组成及键接方式结果

细茎石斛多糖dmp-2的降血糖作用：将caco-2细胞接种于96孔板，3天后，换成含200μg/ml多糖dmp-2样品、5mm葡萄糖的pbs溶液，4h后取pbs上清液，测定pbs中剩余的葡萄糖浓度。结果显示：空白对照组未被吸收的葡萄糖光密度为0.052，多糖dmp-2组未被吸收的葡萄糖光密度为0.065，高于空白对照组，说明多糖dmp-2可以减缓caco-2肠道上皮细胞对葡萄糖的吸收。

将细茎石斛多糖dmp-2以100mg/kg剂量口服灌胃给c57bl/6小鼠，1小时后进行口服糖耐量实验。结果显示：1小时后，空白对照组中小鼠血液中葡萄糖含量为12mmol/l，多糖dmp-2组中小鼠血液中葡萄糖含量仅为6mmol/l，说明多糖dmp-2可以降低口服糖耐量实验中的血糖水平，即可以降低餐后血糖。

实施例3

一种从细茎石斛中碱提的水溶性中性多糖的制备方法，包括如下步骤：

s1：购买滇产细茎石斛，晒干粉碎后以依次用乙酸乙酯和丙酮通过索氏提取回流4h脱脂；

s2：将脱脂后的细茎石斛粉碎物干燥后浸泡在0.9wt％的nacl水溶液中，在131℃高温条件下浸泡15min，分离出残渣，该残渣继续浸泡在0.9wt％的nacl水溶液中，在131℃高温条件下浸泡15min，重复操作三次；

s3：将步骤s2得到的残渣置于2mnaoh的水溶液(含0.7wt％nabh4)中，室温搅拌2h，后离心收集上清液；

s4：上清液使用醋酸中和至中性；用30wt％h2o2脱色至浅黄色，离心得到浅黄色澄清溶液；该溶液用sevag法除去游离的蛋白质，将氯仿和正丁醇混合液(体积比为5:1)与多糖溶液混合，剧烈搅拌60min，用分液漏斗静置分层除去变性蛋白质，反复进行5次；然后分别用自来水、蒸馏水经再生纤维素膜透析袋(mwcut-off3500,usa)透析4天和3天，然后45℃真空旋转蒸发浓缩，得到粗多糖水溶液；此粗多糖水溶液包含各种酸性多糖和所需的中性多糖；

s5：将粗多糖水溶液离心过滤得到澄清溶液后，加入deae纤维素离子交换柱中，通过在deae纤维素阴离子树脂上的吸附差别，用蒸馏水作为流动相，收集蒸馏水级份，其中含所需的中性多糖，最后浓缩、冷冻干燥得到水溶性中性多糖纯品dmp-3。

通过尺寸排除色谱(sec)、元素分析、红外光谱(ir)、单糖组成气相色谱(gc)、甲基化分析表明，该细茎石斛多糖dmp-3是一种多糖纯品，纯度高于96％，具有高度分支结构的杂多糖，由葡萄糖残基、半乳糖残基、木糖残基、甘露糖残基和阿拉伯糖残基链接组成，该多糖的主链由β-(1→3)-d-、β-(1→4)-d-葡萄糖残基和β-(1→3)-d-、β-(1→4)-d-半乳糖残基组成，支链由甘露糖残基和阿拉伯糖残基组成，高度支化，且含有13.8wt％末端木糖残基。该细茎石斛多糖dmp-3可溶解于水和二甲基亚砜(dmso)，不溶解于甲醇、乙醇和丙酮。

该水溶性中性多糖的重复结构单元结构如下：

多糖dmp-3的元素分析结果见附表5，结果表明c：h：o约等于1：2：1，未含n元素，表明该多糖dmp-3未含蛋白质，其元素含量与多糖结构一致。将多糖dmp-3完全甲基化后，再乙酰化，然后进行气相色谱-质谱联用(gc-ms)分析(见附表6)，可得到dmp-3的单糖键接方式。dmp-3的gc-ms结果表明，该多糖dmp-3为一种高度支化的多糖，其主链主要由β-(1→3)-d-、β-(1→4)-d-葡萄糖残基和β-(1→3)-d-、β-(1→4)-d-半乳糖残基组成，支链由甘露糖残基和阿拉伯糖残基组成，含有13.8wt％末端木糖残基。该多糖dmp-3通过激光光散射-尺寸排除色谱(lls-sec)测试结果表明，其重均分子量为0.92万。

附表5.细茎石斛多糖dmp-3元素分析结果

附表6.细茎石斛多糖dmp-3单糖组成及键接方式结果

细茎石斛多糖dmp-3的降血糖作用：将caco-2细胞接种于96孔板，3天后，换成含150μg/ml多糖dmp-3样品、5mm葡萄糖的pbs溶液，4h后取pbs上清液，测定pbs中剩余的葡萄糖浓度。结果显示：空白对照组未被吸收的葡萄糖光密度为0.052，多糖dmp-3组未被吸收的葡萄糖光密度为0.062，高于空白对照组，说明多糖dmp-3可以减缓caco-2肠道上皮细胞对葡萄糖的吸收。

将细茎石斛多糖dmp-3以80mg/kg剂量口服灌胃给c57bl/6小鼠，1小时后进行口服糖耐量实验。结果显示：1小时后，空白对照组中小鼠血液中葡萄糖含量为12mmol/l，多糖dmp-3组中小鼠血液中葡萄糖含量仅为7mmol/l，说明多糖dmp-3可以降低口服糖耐量实验中的血糖水平，即可以降低餐后血糖。

对比例1

一种细茎石斛多糖的制备方法，包括如下步骤：

s1：购买滇产细茎石斛，晒干粉碎后以依次用乙酸乙酯和丙酮通过索氏提取回流4h脱脂；

s2：将脱脂后的细茎石斛粉碎物干燥后置于1mnaoh的水溶液(含0.5wt％nabh4)中，室温搅拌2h，后离心收集上清液；

s3：上清液使用醋酸中和至中性；用30wt％h2o2脱色至浅黄色，离心得到浅黄色澄清溶液；该溶液用sevag法除去游离的蛋白质，将氯仿和正丁醇混合液(体积比为氯仿：正丁醇＝5:1)与多糖溶液混合，剧烈搅拌30min，用分液漏斗静置分层除去变性蛋白质，反复进行5次；然后分别用自来水、蒸馏水经再生纤维素膜透析袋(mwcut-off3500,usa)透析4天和3天，然后45℃真空旋转蒸发浓缩，得到粗多糖水溶液；

s4：将粗多糖水溶液离心过滤得到澄清溶液后，加入deae纤维素离子交换柱中，通过在deae纤维素阴离子树脂上的吸附差别，用蒸馏水作为流动相，收集蒸馏水级份，最后浓缩、冷冻干燥得到多糖dmp-4。

通过尺寸排除色谱(sec)对多糖dmp-4进行纯度分析，结果表明多糖dmp-4为一种多糖混合物，由多种多糖组成，其平均分子量为5.2万。由于该多糖dmp-4为多种多糖的混合物，无法分析其结构，无法确定哪一种多糖有降血糖作用。

对比例2

本对比例与实施例1类似，区别在于，碱液中不含nabh4，制备的多糖为dmp-5。

通过尺寸排除色谱(sec)、元素分析、红外光谱(ir)、单糖组成气相色谱(gc)、甲基化分析表明，该多糖dmp-5结构与降血糖作用与多糖dmp-1基本相同，但此法得到的多糖dmp-5产率只有实施例1中多糖dmp-1产率的60％，表明碱液中不含nabh4会氧化中性多糖，降低产率。

上述实施例仅为本发明的其中具体实现方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些显而易见的替换形式均属于本发明的保护范围。