一种中短链酰基辅酶A合成酶的应用的制作方法

本发明涉及一种中短链酰基辅酶a合成酶的应用，特别涉及一种中短链酰基辅酶a合成酶在制备2-庚烯酰辅酶a、环己甲酰辅酶a中的应用，属于酶工程技术领域。

背景技术：

辅酶a(coenzymea，coa)是酶促反应期间有助于酰基活化和转移的关键辅因子，在脂肪酸、大环内酯(macrolides)、芳香族化合物的生物合成，分解代谢或氧化过程，糖类的修饰，以及酶调控等广泛的生物学途径中发挥重要作用。据估计，已知的酶当中有4％使用coa作为辅因子。

酰基coa(acyl-coa)是coa的巯基(-sh)共价连接至游离羧酸的羧基(-cooh)形成的临时化合物，作为酰基供体在初级和次级代谢中是必不可少的。大环内酯、聚醚(polyethers)、多烯(polyenes)、黄酮类(flavonoids)、芪类(stilbenes)等化合物是发掘具有药用价值的天然产物的重要来源，而上述聚酮类次级代谢物的生物合成均涉及各类中、短链酰基coa(medium,short-chainacyl-coa)作为结构单元。多样的酰基coa作为起始或延伸单元在聚酮合酶(pks)的催化下整合入聚酮分子的骨架。

到目前为止，研究人员仍不得不依赖各种酰基辅酶a、¹³c-标记的酰基coa、放射性标记的¹⁴c-酰基coa进行聚酮类天然药物生物合成的研究实验。当前，仅有sigma-aldrich等极少数国外公司可以提供商品化的酰基coa试剂，但品种十分有限且价格极其昂贵，每克的价格高达12.2–53.6万元，如表1(sigma-aldrich公司的商品化酰基coa试剂信息)所示：

表1

正是由于现有的商品化的酰基coa衍生物的品种相当有限，而且一些种类在经济上令人望而却步或商业上无法获得，使用化学方法亦难以合成，国内对于能够自主合成各种形式的新的酰基coa衍生物的需求十分迫切。

目前，已有报道的底物广谱性最宽、合成酰基coa种类最丰富的酰基coa合成酶的产物仅限于丙二酰coa(malonyl-coa)、甲基丙二酰coa(methylmalonyl-coa)、乙基丙二酰coa(ethylmalonyl-coa)、甲氧基丙二酰coa(methoxymalonyl-coa)、羟基丙二酰coa(hydroxymalonyl-coa)，而对于能够合成更多其他的酰基coa的酶未见报道。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供一种中短链酰基辅酶a合成酶的应用。

本发明技术方案如下：

一种中短链酰基辅酶a合成酶在制备2-庚烯酰辅酶a、环己甲酰辅酶a中的应用。

上述应用，步骤如下：

(1)制备氨基酸序列如seqidno.2所示的中短链酰基辅酶a合成酶；

(2)利用步骤(1)制得的中短链酰基辅酶a合成酶配制如下反应体系：

100mm4-羟乙基哌嗪乙磺酸；质量体积百分比10％甘油，单位g/ml；100mm氯化镁；15～50mm2-庚烯酸、2-庚烯酸的钠盐、环己烷甲酸或环己烷甲酸的钠盐；20mm三磷酸腺苷；5mm辅酶a；10μm纯化的丙二酰辅酶a合成酶；ph7.5；

(3)上述反应体系在20～24℃条件下反应7.5～10h，终止反应，去除酶蛋白，经纯化，干燥，即得。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，制备氨基酸序列如seqidno.2所示的中短链酰基辅酶a合成酶采用如下方法：

使用引物matbf和matbr经pcr反应扩增天蓝色链霉菌的丙二酰辅酶a合成酶基因matb，然后通过构建表达载体和工程菌，诱导表达，然后经ni-nta镍柱纯化丙二酰辅酶a合成酶，即得；

所述引物matbf和matbr的核苷酸序列如下：

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matbr:5’-atcggatagctcgagtcagtcacggttcagcgcccgctt-3’。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，去除酶蛋白为采用超滤离心过滤去除。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，所述的纯化为采用hplc色谱进行纯化。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，所述干燥为采用真空冷冻干燥方法进行。

上述中短链酰基辅酶a合成酶(丙二酰辅酶a合成酶)的编码基因来源于天蓝色链霉菌zm12(购自中国科学院合成生物学重点实验室)的matb基因，全长1458bp(碱基对)，如seqidno.1所示，其氨基酸序列全长485个残基，如seqidno.2所示，分子量50.6kda。该酶具有较大的n-末端体(残基1–387)和较小的c-末端盖(残基388–485)。该酶以羧酸或其盐、atp、coa为底物，催化多种酰基coa的生物合成。

上述丙二酰辅酶a合成酶的两步反应机理如图1所示：

在腺苷酸形成反应中，atp的α-磷酸受到羧酸衍生物的羧基攻击形成酰基-腺苷酸中间体和焦磷酸(ppi)；在硫酯形成反应中，coa置换单磷酸腺苷(amp)以产生酰基coa和amp。

发明人通过深入研究本发明所述的丙二酰辅酶a合成酶发现，该酶具有非常广泛的羧酸底物耐受性，这颠覆了原有对该类丙二酰辅酶a合成酶的认知，该酶不仅能以1,3-二羧酸及其c-2取代衍生物为底物，还能以直链和具有环状结构的单羧酸为底物，如利用2-庚烯酸(2-heptenate)、环己烷甲酸(cyclohexanecarboxylicacid)生成2-庚烯酰-coa和环己甲酰-coa。因此，本发明所述的丙二酰辅酶a合成酶能广泛地适应短链或中链、二羧酸或单羧酸底物，并催化其形成相应的酰基辅酶a产物。

有益效果

本发明首次公开了通过中短链酰基辅酶a合成酶制备2-庚烯酰辅酶a和环己甲酰辅酶a的技术方案，克服了现有技术中仅能认为丙二酰辅酶a合成酶只能以1,3-二羧酸或其盐作为底物，催化它们形成相应的酰基辅酶a产物，如丙二酰coa、甲基丙二酰coa、乙基丙二酰coa、甲氧基丙二酰coa、羟基丙二酰coa，而不可能催化以单羧酸为底物的反应的技术偏见，拓宽了该酶的应用范围。

附图说明

图1为丙二酰辅酶a合成酶的两步反应机理；

图2为n-末端his6-标签融合的丙二酰辅酶a合成酶的sds-page检测图；

图中：t、s分别是lb培养基、15℃、0.5mmiptg诱导条件下的表达宿主菌的总蛋白和上清液(对照)；

ft为flow-through流出液；

15为15mm咪唑浓度下的洗脱液；

150为150mm咪唑浓度下的洗脱液；

500为500mm咪唑浓度下的洗脱液；

m为蛋白质分子量标准(pagerulerbroadrangeunstainedproteinladeder)；

图3为试验组与对照组的hplc-ms检测结果；

图中：1)对照组，2)试验组。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

生物样品来源

天蓝色链霉菌zm12为现有已知菌株，购自中国科学院合成生物学重点实验室；

辅酶a购自西格玛奥德里奇(中国)公司。

设备来源

实施例中的超滤采用ultra-0.5超滤离心过滤装置；

检测使用hplc耦联ms(esimassspectrometry，电喷雾电离质谱)，通过分析超滤除蛋白后的少量样品，确定并核对酰基coa产物的保留时间(retentiontime)、紫外吸收峰形(uvabsorptionpeakshape)和分子量(molecularweight)；

纯化采用制备型hplc色谱柱；

干燥采用maxidrylyo真空浓缩/冻干系统(heto-holten，丹麦)。

实施例1

1.表达载体和工程菌的构建

使用引物matbf和matbr，以天蓝色链霉菌基因组dna为模板，pcr扩增目的基因matb。经纯化后的pcr产物使用ndei和xhoi双酶切后再次纯化，连接至经过相同酶切处理并且去磷酸化的含有n-末端his6-标签的表达载体pet-28a(+)。形成的质粒pet-28a(+)-matb经dna测序验证后转化入宿主菌e.colibl21(de3)用于蛋白表达。

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2.丙二酰辅酶a合成酶的表达和纯化

起始培养物生长过夜后用于接种添加50mg/l卡那霉素的37℃预温的lb培养基。当od600＝0.4时，15℃冷却培养基，用0.5mm异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)诱导蛋白表达。16h后，通过离心收获细胞，重悬于裂解缓冲液(质量体积百分比为10％的甘油，g/ml，0.5mnacl，100mmhepesph7.5)中，超声处理，并16,000g离心45min以除去细胞碎片。无细胞裂解液通过用裂解缓冲液平衡的镍-nta柱。用含有15mm咪唑的裂解缓冲液洗涤该柱，并用含有150mm咪唑的裂解缓冲液洗脱蛋白。

聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)检测，结果如图2所示，目的蛋白即为n-末端his6-标签融合的丙二酰辅酶a合成酶，分子量52.8kda。使用thermoscientificnanodrop1000测定最终蛋白浓度为62.7μm。

实施例22-庚烯酰辅酶a生物合成的体外试验

丙二酰辅酶a合成酶的反应体系如表2所示，按顺序依次添加各组分，在22℃反应条件下恒温静置过夜。

表2

对照组的反应体系如试验组，不同之处在于，丙二酰辅酶a合成酶预先经过96℃热失活处理10min。反应样品经过ultra-0.5centrifugalfilterdevices超滤除蛋白后用于hplc-ms(high-resolutionpositive-esimassspectrometry，高分辨率正电喷雾电离质谱)分析，hplc方法见表3。

表3用于质谱检测的hplc方法[溶剂a：10mm醋酸铵(nh4oac)水溶液，溶剂b：乙腈(ch3cn)，流速＝1ml/min，在260nm检测反应产物(腺嘌呤、coa基团)]

表3

使用prominencemodularhplc(日本岛津公司)和dikma反相色谱柱(agilent1200，zorbaxeclipsexdb-c18，250×4.6mm，5μm)，耦联ltq-obitrapvelospro质谱仪(thermoscientific公司)，通过hplc-hr-esims分析样品，在正离子模式下质荷比(m/z)扫描范围110-1200，检测结果如图3所示；

结果显示，试验组2)在保留时间16.75min出现新增的产物峰a(2-庚烯酰辅酶a)，其m/z的观测值为878.1981(理论值为878.19565，误差仅有2.8ppm)。同时，试验组2)和对照组1)均观测到底物峰b(coa，m/z观测值766.4，理论值766.1)。

放大制备2-庚烯酰辅酶a的反应体系如前所述，不同之处在于：反应后的体系经过酶失活，超滤除蛋白，再用制备型hplc分离2-庚烯酰辅酶a产物，使用maxidrylyo真空浓缩/冻干系统(heto-holten，丹麦)冷冻真空干燥，所得色谱纯2-庚烯酰辅酶a冻干粉末封装于安瓿瓶置-80℃保存。

实施例3环己甲酰辅酶a生物合成的体外试验

反应体系除底物需替换为终浓度16mm环己烷甲酸(naoh调ph至7.2)外，其余组分和反应条件与表3相同。后续制备步骤参照实施例2，分离得到10mg环己甲酰辅酶a纯品。检测结果如下：

¹h-nmr(核磁共振)数据(300mhz，d2o)：δ:0.56(s,h-10'),0.69(s,h-11'),1.55(m,h-5),2.26(t,j＝6.9hz,h-4'),2.40(t,j＝6.9,h-6),2.55(t,j＝8.1hz,h-4),2.75(t,j＝6.0hz,h-1'),3.11(t,j＝6.0,h-3andh-7),3.27(m,h-2'andh-5'),3.35(m,h-5”),3.64(m,h-5”),3.82(s,h-7'),4.04(brs,ch2-9'),4.39(brs,h-4”),5.98(d,j＝7.5hz,h-1”),8.08(s,adenine-ch),8.35(s,adenine-ch)。esi-ms质谱数据[负离子模式(negativeionmode)，m/z]：876.0[m-h]^-，437.5[m-2h]^2-。

对比例

按照2012年美国crosby等人公开的来自沼泽红假单胞菌(rhodopseudomonaspalustriscga009)的丙二酰辅酶a合成酶的制备方法制备丙二酰辅酶a合成酶，采用实施例2和实施例3中的方法制备2-庚烯酰辅酶a和环己甲酰辅酶a。

经检测，反应体系中未发现2-庚烯酰辅酶a和环己甲酰辅酶a的生成。沼泽红假单胞菌的丙二酰辅酶a合成酶不能催化2-庚烯酸、环己烷甲酸这样中短不饱和直链或具有环状结构的单羧酸转变为相应的酰基辅酶a的反应。

以上所述仅是本发明的一个实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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<110>刘,超

<120>一种中短链酰基辅酶a合成酶的应用

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