氨基正己酰氨基甲环酰氨基正己酰碱性氨基酸，其合成，活性和应用的制作方法

本发明涉及(n-氨基正己酰氨甲环酰)-氨基正己酰-aa(式中aa为l-asp残基和l-glu残基)，涉及它们的制备方法,涉及它们的抗肿瘤活性,涉及它们的抗肿瘤转移活性,以及涉及它们的抗炎活性活性，因而本发明涉及它们在制备抗肿瘤药物，抗肿瘤转移药物和抗炎药物中的应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术

侵袭和转移过程是恶性肿瘤的基本生物学特征，是肿瘤研究工作的困境之一。癌症转移是肿瘤患者发病和死亡的主要原因，约占癌症死亡人数的90％。目前对肿瘤浸润转移的研究已从不同方面进行了深入的探讨。其中，尿激酶型纤溶酶原激活物(upa)系列在肿瘤侵袭转移中的作用成为当今研究的热点之一。尿激酶型纤溶酶原激活物(upa)系统，这是一种丝氨酸蛋白酶家族，在肿瘤的浸润转移起着至关重要的作用。该系统包括尿激酶型纤溶酶原激活物(upa)、尿激酶受体(upar)、纤溶酶原激活物抑制剂(pai)，该系统涉及多种生理和病理过程，包括细胞迁移，血管生成，炎症，胚胎发育，肿瘤生长和转移。

氨基正己酸能与纤溶酶原激活物产生竞争性抑制，使纤溶酶原不能激活为纤溶酶，是临床上治疗纤溶性出血药物。氨甲环酸与纤溶酶原结合，同样能发挥抗纤溶作用。两者分别能通过阻止upa/upar相互作用和抑制纤溶酶活化来达到抑制upa系统的相关作用。氨基正己酸和氨甲环酸抑制upa系统的最低有效剂量分别为3.8mmol/kg和3.2mmol/kg。发明人认为它们的毒副作用与它们的最低有效剂量高有直接关系。发明人认识到先将两种已知的upa系统抑制剂合理组合，再连接氨基酸而构建的新型u-pa抑制剂在低剂量下就应具有抗肿瘤、抗肿瘤转移和抗炎三重作用。根据这种认识，经过3年探索，发现用酸性氨基酸(l-asp、l-glu)修饰的氨基正己酰甲环酰氨基正己酸衍生物在0.5μmol/kg剂量下不仅具有抗肿瘤转移活性，而且同时具有抗肿瘤和抗炎的活性。因为药物的毒副作用都可以随剂量降低而消失，所以有效剂量比氨基正己酸和氨甲环酸至少降低6400倍表明了这种结构修饰有突出的技术效果。根据这些发现，发明人提出了本发明。

技术实现要素：

本发明的第一个内容是提供下式的(n-氨基正己酰氨甲环酰)-氨基正己酰-aa(式中aa为l-asp残基和l-glu残基)。

本发明的第二个内容是提供(n-氨基正己酰氨甲环酰)-氨基正己酰-aa(aa为l-asp残基和l-glu残基)的合成方法，该方法包括：

(1)boc-氨甲环酸与氨基正己酸甲酯缩合得boc-氨甲环酰基氨基正己酸甲酯(1)；

(2)boc-氨甲环酰基-氨基正己酸甲酯在氯化氢的乙酸乙酯溶液中脱boc得氨甲环酰基氨基正己酸甲酯(2)；

(3)boc-氨基正己酸与氨甲环酰基氨基正己酸甲酯(2)缩合得(n-boc-氨基正己酰氨甲环酰)-氨基正己酸甲酯(3)；

(4)化合物3皂化脱甲基得到(n-boc-氨基正己酰氨甲环酰)-氨基正己酸(4)；

(5)化合物4在氯化氢的乙酸乙酯溶液中脱boc得(n-氨基正己酰氨甲环酰)-氨基正己酸(7)；

(6)化合物4与aa-obzl(aa为l-asp残基和l-glu残基)缩合得(n-boc-氨基正己酰氨甲环酰)-氨基正己酰基氨基酸苄酯(5a,b)。

(7)化合物5a,b先氢解脱苄氧羰基、再在氯化氢的乙酸乙酯溶液中脱boc得到(n-氨基正己酰基氨甲环酰)-氨基正己酰-aa(6a,b)(aa为l-asp残基和l-glu残基)。

本发明的第三个内容是评价(n-氨基正己酰氨甲环酰)-氨基正己酰-aa(aa为l-asp残基和l-glu残基)抑制c57bl/6小鼠抗肺癌转移活性。

本发明的第四个内容是评价(n-氨基正己酰氨甲环酰)-氨基正己酰-aa(aa为l-asp残基和l-glu残基)对s180小鼠肿瘤生长的抑制应用。

本发明的第五个内容是评价(n-氨基正己酰氨甲环酰)-氨基正己酰-aa(aa为l-asp残基和l-glu残基)对icr小鼠炎症的抑制作用。

附图说明

图1(n-氨基正己酰氨甲环酰)-氨基正己酰-aa的合成路线.5a和6a中aa为l-asp残基；5b和6b中aa为l-glu残基。i)二环己基碳二亚胺(dcc),1-羟基苯并三唑(hobt),n-甲基吗啉(nmm),干燥四氢呋喃(thf)；ii)氯化氢的乙酸乙酯溶液(4m)；iii)ch3oh,2mnaoh；iv)pd/c,h2,ch3oh；氯化氢的乙酸乙酯溶液(4m)。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备(n-boc-氨甲环酰)-氨基正己酸甲酯(1)

将0.69g(2.68mmol)boc-氨甲环酸混悬于50ml干燥四氢呋喃中，在0℃下依次加入0.66g(3.20mmol)二环己基碳二亚胺(dcc)和0.44g(3.26mmol)1-羟基苯并三唑(hobt)，搅拌30min。然后加入0.49g(2.70mmol)氨基正己酸甲酯，并用n-甲基吗啉(nmm)调节溶液ph至9，室温搅拌6h,tlc(二氯甲烷/甲醇＝30/1)显示反应完成。减压浓缩除去溶剂，残留物用50ml乙酸乙酯溶解，过滤。滤液先后用20ml饱和nahco3溶液洗涤3次，20ml饱和nacl溶液洗涤3次，20ml饱和khso4溶液洗涤3次，20ml饱和nacl溶液洗涤3次，20ml饱和nahco3溶液洗涤3次，20ml饱和nacl溶液洗涤3次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥12h。过滤，滤液减压浓缩至干，得到0.83g(80％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/e)：385[m+h]⁺。

实施例2制备n-氨甲环酰基-氨基正己酸甲酯·盐酸盐(2)

搅拌下将6.00g(15.62mmol)化合物1与60ml氯化氢的乙酸乙酯溶液(4m)在-10℃缓慢混合，并保持-10℃搅拌5h。tlc(二氯甲烷/甲醇＝30/1)显示反应完成。减压浓缩除去溶剂，残留物用无水乙酸乙酯溶解，得到的溶液减压浓缩。该操作重复3次。固体再用无水乙醚充分悬浮，去乙醚，得到的无色固体直接用于下一步反应。esi-ms(m/e):322[m+h]⁺。

实施例3制备(n-boc-氨基正己酰氨甲环酰)-氨基正己酸甲酯(3)

采用实施例1的方法从3.36g(14.55mmol)boc-氨基正己酸和4.67g(14.57mmol)化合物2得到淡黄色固体。该固体用乙酸乙酯充分磨洗，得到6.20g(85％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/e)：498[m+h]⁺。

实施例4制备(n-boc-氨基正己酰氨甲环酰)-氨基正己酸(4)

将6.20g(12.47mmol)化合物3溶于20ml甲醇，0℃用naoh水溶液(2m)调节ph至12。控制0℃和ph12搅拌4h，tlc(二氯甲烷/甲醇＝25/1)显示反应完成。反应混合物用饱和khso4溶液调节ph至7，减压浓缩。残留物继续用饱和khso4溶液调节ph至2，用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯层合并，用饱和nacl溶液洗涤至中性。乙酸乙酯相用无水硫酸钠干燥12h。过滤，滤液减压浓缩至干，得到4.60g(76％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/e)：484[m+h]⁺。

实施例5制备(n-氨基正己酰氨甲环酰)-氨基正己酸(7)

采用实施例2的方法，从1.30g(2.69mmol)化合物4得到0.87g(84％)标题化合物，为无色固体。mp236-239℃；(c＝0.1，h2o).esi-ms(m/e):384[m+h]⁺.ir(cm^-1):3265,3081,2927,2857,1633,1557,1470,1416,1396,1362,1327,1235,1210,726,697.¹h-nmr(300mhz,d2o):δ/ppm＝3.11(t,j＝6.6hz,2h),2.98(d,j＝6.6hz,2h),2.93(t,j＝7.8hz,2h),2.20(t,j＝7.2hz,2h),2.12(t,j＝7.2hz,2h),2.09(m,1h),1.76(m,4h),1.67～1.55(m,4h),1.52～1.40(m,5h),1.37～1.24(m,6h),0.93(m,2h)。

实施例6制备(n-boc-氨基正己酰氨甲环酰)-氨基正己酰天冬氨酸苄酯(5a)

采用实施例1的方法，从3.00g(6.21mmol)化合物4和3.01g(6.21mmol)tos·asp(obzl)-obzl得0.90g(19％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/e)：779[m+h]⁺。

实施例7制备(n-boc-氨基正己酰氨甲环酰)-氨基正己酰谷氨酸苄酯(5b)

采用实施例1的方法，从4.00g(8.28mmol)化合物4和2.51g(6.91mmol)tos·glu(obzl)-obzl得2.33g(43％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/e)：793[m+h]⁺。

实施例8制备(n-氨基正己酰氨甲环酰)-氨基正己酰天冬氨酸(6a)

将0.81g(1.04mmol)化合物5a溶于20ml甲醇中，加入80mgpd/c，室温通10h氢气，tlc(二氯甲烷/甲醇＝5/1)显示反应完成。过滤除去pd/c，滤液减压浓缩至干。残留物在-10℃与5ml氯化氢的乙酸乙酯溶液(4m)缓慢混匀，保持-10℃搅拌5h。tlc(乙酸乙酯/水/冰醋酸＝3/1/1)显示反应完全。减压浓缩，残留物用无水乙酸乙酯溶解，压浓缩，残留物用无水乙酸乙酯溶解。该操作重复3次。得到的固体用无水乙醚充分悬浮，静置，去乙醚。得到的无色固体在0℃用饱和nahco3溶液调节无色固体ph至7，用c18柱层析纯化，得420mg(66％)标题化合物，为无色固体。mp263-264℃.(c＝0.1，h2o).esi-ms(m/e):499[m+h]⁺.ir(cm^-1):3295,3081,2929,2855,1634,1552,1387,1233,995,832,684.¹h-nmr(300mhz,d2o):δ/ppm＝4.03(dd,j1＝8.7hz,j2＝4.2hz,1h),3.09(t,j＝6.3hz,2h),2.96(d,j＝6.6hz,2h),2.90(t,j＝7.5hz,2h),2.61(dd,j1＝15.6hz,j2＝3.9hz,1h),2.44(dd,j1＝15.6hz,j2＝9.3hz,1h),2.21(m,4h),2.13(m,1h),1.76(m,4h),1.67～1.52(m,6h),1.49～1.40(m,3h),1.37～1.26(m,6h),0.93(m,2h)。

实施例9制备(n-氨基正己酰氨甲环酰)-氨基正己酰谷氨酸(6b)

采用实施例8的方法，从0.91g(1.15mmol)化合物5b得到285mg(0.48％)标题化合物，为无色固体。mp251-252℃.(c＝0.1，h2o).esi-ms(m/e):513[m+h]⁺.ir(cm^-1):3292,3086,2929,2857,1635,1548,1392,1234,1207,697.¹h-nmr(300mhz,d2o):δ/ppm＝4.03(dd,j1＝8.7hz,j2＝4.2hz,1h),3.09(t,j＝6.3hz,2h),2.96(d,j＝6.6hz,2h),2.90(t,j＝7.5hz,2h),2.16(m,5h),2.06(m,2h),1.95(m,1h),1,82(m,1h),1.73(m,4h),1.64～1.47(m,6h),1.45～1.34(m,3h),1.31～1.18(m,6h),0.90(m,2h)。

实施例10测定化合物6a,b的抗肿瘤转移活性

本测定模型用lewis小鼠肺癌细胞(llc,购自atcc)接种,选用dmem培养基(含10％经灭活的胎牛血清,1×10⁵u/l青霉素和100mg/l链霉素),按照贴壁细胞培养方法每两天传代一次，富集细胞。待细胞生长状态良好并处于对数生长期时消化细胞，用生理盐水调整细胞密度至1×10⁷个/ml。胎盘蓝染色，使活细胞计数>95％。取近交系c57bl/6雄性小鼠(spf级,体重20±2g)，左手固定小鼠。用75％乙醇对小鼠右前肢腋窝皮肤消毒。右手持1ml无菌注射器往小鼠腋部皮下注射llc肿瘤细胞悬液，每只小鼠注射0.2ml。小鼠接种10天后，长出直径约4-5mm的肿瘤即为瘤源。接种10天的lewis肺癌荷瘤小鼠乙醚麻醉，脱颈椎处死。用75％乙醇浸泡10min，消毒，在超净工作台上剥离瘤体。选择生长良好的肿瘤组织在无菌平皿中剪碎，置于玻璃制造的组织匀浆器内。按瘤块重比生理盐水体积为1比3(g比ml)的比例加温度为4℃的生理盐水，轻轻研磨制成细胞悬液。细胞悬液过200目细胞筛制单细胞悬液。用生理盐水调单细胞悬液的细胞密度至1.5×10⁷个/ml。胎盘蓝染色，使活细胞计数>95％。左手固定近交系c57bl/6雄性小鼠，用75％的乙醇对小鼠右前肢腋窝皮肤消毒。右手持1ml无菌注射器于小鼠腋部皮下注射瘤细胞悬液，每只注射0.2ml。接种10天后小鼠长出直径4-5mm的肿瘤，按测得的肿瘤体积将接种小鼠随机分组。每组12只小鼠。接种肿瘤的第11天小鼠或口服公认的抗肿瘤转移肽rgds的生理盐水溶液(剂量为20μmol/kg/天)或口服化合物6a,b的生理盐水溶液(剂量为0.5μmol/kg/天)或口服化合物7的生理盐水溶液(剂量为5μmol/kg/天)或口服生理盐水(剂量为10ml/kg/天)，每天给1次药，连续给药12天，每隔两天测量并记录肿瘤体积。最后一次给药的次日测量瘤体积，乙醚麻醉脱颈椎处死，取小鼠的肿瘤称重，取小鼠的肺并计算肿瘤肺部转移的瘤节数。用t检验对数据进行统计分析。结果见表1。在0.5μmol/kg剂量下化合物6a,b不仅有效地抑制肿瘤肺转移，而且活性与剂量比它们高400倍的rgds及剂量比它们高10倍的化合物7没有显著性差异。这些数据表明，本发明有显著的技术效果。

表1化合物6a-b的抗肿瘤转移活性

a)与生理盐水比p<0.01,与rgds及化合物7比p>0.05；n＝12.

实施例11测定化合物6a,b的抗肿瘤生长活性

测定前将阿霉素,化合物7和化合物6a,b都用生理盐水溶解,用于s180小鼠给药。在无菌环境中取接种于雄性icr小鼠10天生长旺盛的s180腹水瘤液，用生理盐水稀释成(1:2)的液体充分混合，将肿瘤细胞悬液用新鲜配制的0.2％台盼蓝染色，混匀后按白细胞计数方法计数，染蓝色者为死细胞，不染色者为活细胞。按细胞浓度＝4大方格内活细胞数/4×10⁴×稀释倍数＝细胞数/ml计算细胞密度，按细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％计算细胞存活率。将存活率大于90％的瘤液用匀浆法制成密度为2.0×10⁷个/ml的细胞悬液。该细胞悬液接种于小鼠右腋皮下(0.2ml/只)，制造s180荷瘤小鼠。接种24h后s180荷瘤小鼠每日腹腔注射阿霉素的生理盐水溶液(剂量为2μmol/kg/天g)或每日口服化合物7的生理盐水溶液(剂量为5μmol/kg/天)或每日口服化合物6a,b的生理盐水溶液(剂量为0.5μmol/kg/天)。每天给药一次，连续给药12天。最后一次给药的次日测量瘤体积，乙醚麻醉脱颈椎处死，然后用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位，剪开皮肤钝性剥离肿瘤并称重。用瘤重(均值±sdg)表示疗效，数据用t检验和方差分析。结果见表2。在0.5μmol/kg剂量下化合物6a,b不仅有效地抑制肿瘤肺转移，而且活性与剂量比它们高10倍的化合物7没有显著性差异。这些数据表明，本发明有显著的技术效果。

表2化合物6a,b对s180小鼠肿瘤生长的影响

a)与生理盐水比p<0.01,与化合物7比p>0.05；n＝12.

实施例12测定化合物6a,b的抗炎活性

因为二甲苯引起的小鼠耳肿胀被公认为急性炎症模型，所以本发明在二甲苯引起的小鼠耳肿胀模型上测定化合物6a,b的治疗作用。因为阿司匹林是治疗急性炎症的阳性药，所以本发明选择阿司匹林为阳性对照药。icr雄性小鼠(体重42±3g)在温度为22℃的环境静息2天,自由饮水和进食。之后，随机分为生理盐水组(剂量为0.2ml/只)，阿司匹林组(剂量为1.11mmol/kg)，化合物7组(剂量为5μmol/kg)及化合物6a,b组(剂量为0.5μmol/kg)，每组12只小鼠。测定时小鼠按所在组或口服生理盐水，或口服阿司匹林，或口服化合物7，或口服化合物6a,b。给药30min后,往小鼠的左耳廓均匀涂抹30μl二甲苯,2h后小鼠接受乙醚麻醉，断颈处死,剪下左右两耳,用7mm的打孔器在两耳的相同位置取圆形耳片,称重,求出两耳肿胀差值作为肿胀度。即肿胀度＝左耳圆片重量–右耳圆片重量。结果见表3。在0.5μmol/kg剂量下化合物6a,b不仅能有效地抑制二甲苯引起的小鼠耳肿胀，而且活性与剂量比它们高10倍的化合物7没有显著性差异。这些数据表明，本发明有显著的技术效果。

表3化合物6a,b对二甲苯引起的小鼠耳肿胀的影响

a)与生理盐水比p<0.01,与化合物7比p>0.05；n＝12。