用于识别超氧阴离子的荧光探针及其制备方法和应用、光纤探头及其制备方法与流程

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本发明涉及一种用于识别超氧阴离子的荧光探针及其制备方法和应用、光纤探头及其制备方法，属于荧光探针技术领域。

背景技术：

超氧阴离子属于氧自由基一种，生物体内的氧自由基有其特定的生理功能，也有一定致病作用。很多疾病的病理生理过程均有超氧阴离子介导。肾脏是一个高血流量器官，在肾脏摄氧中只有25％氧为肾脏组织细胞生存所需要，其余氧主要供肾小管重吸收用，肾小管重吸收越多，耗氧约多。正常情况下，肾脏的抗氧化能力与不断产生的氧自由基的氧化能力之间保持相对动态平衡。肾脏疾病患者机体清除自由基能力降低，如果氧自由基产生异常增多，导致肾脏组织损伤，肾脏细胞就会缺血缺氧。

超氧阴离子能引起蛋氨酸、组氨酸、半胱氨酸等蛋白质结构和功能改变。带单电子的氧自由基和生物膜上的多不饱和脂肪酸作用，使得多不饱和脂肪酸与蛋白质之间比例失衡,细胞膜的液体性、通透性及流动性发生改变，因而造成多种细胞膜体系的损伤。溶酶体膜通透性升高，会导致溶酶体酶的外漏、加速细胞自身的溶解；线粒体膜能损伤肾小球系膜细胞、肾小管上皮和通透性与流动性发生改变可造成氧化磷酸化障碍。肾小球毛细血管基底膜和肾小管上皮细胞膜受损可致肾小球滤过性增大，出现蛋白尿、血尿；肾小管重吸收、运转及分泌功能障碍，出现糖尿、多尿、尿崩、低钾低钠及代谢性酸中毒等。

希夫碱是指含有亚胺或甲亚胺特性基团(-rc＝n-)的一类化合物，其杂化轨道上的n原子具有孤对电子，易与有空轨道的金属离子配位，故其是一类性能优良的配体。甲亚胺特性基团(-rc＝n-)在超氧阴离子作用下，会发生氧化断键，使化合物结构改变，造成荧光性能的变化。因此，使用此类化合物对超氧阴离子进行有效、快速、简单易行的检测，对于人类生活和自然环境都有着极其重大的意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于识别超氧阴离子的荧光探针，该探针具有针对超氧阴离子的荧光敏感性，可与超氧阴离子作用，并导致荧光淬灭，通过探测荧光即可快速识别超氧阴离子，检测灵敏度高。

本发明还提供了一种上述用于识别超氧阴离子的荧光探针的制备方法及其应用、光纤探头及其制备方法。

为了实现以上目的，本发明的用于识别超氧阴离子的荧光探针所采用的技术方案是：

用于识别超氧阴离子的荧光探针，具有式ⅰ所示的结构：

式ⅰ中，ar与ar’为荧光基团。ar和ar’分别独立地选自苯基、喹啉基、异喹啉基、稠环基、取代基取代的苯基或取代基取代的稠环基，取代基独立地选自羟基或碳原子数为1～4的烷基，r1为碳原子数为1～4的烷基，r2为羟基或氢。

优选的，所述稠环基选自萘基，蒽基，苝基或芘基。

优选的，ar和ar’独立地选自萘基、苯基、芘基或甲基取代的苯基。

优选的，ar与ar’为荧光基团。

本发明的用于识别超氧阴离子的荧光探针的制备方法所采用的技术方案为：

上述用于识别超氧阴离子的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：在酸性催化剂的催化作用下，将式ⅱ、式ⅲ所示的化合物在溶剂a中反应，即得；

式ⅱ中，ar为荧光基团。ar选自苯基、喹啉基、异喹啉基、稠环基、取代基取代的苯基或取代基取代的稠环基，取代基独立地选自羟基或碳原子数为1～4的烷基。

式ⅲ中，ar’为荧光基团。ar’选自苯基、喹啉基、异喹啉基、稠环基、取代基取代的苯基或取代基取代的稠环基，取代基独立地选自羟基或碳原子数为1～4的烷基，r1为碳原子数为1～4的烷基，r2为羟基或氢。

所述酸性催化剂选自甲酸、乙酸、硫酸、盐酸、sio2-al2o3、b2o3-al2o3中的一种或多种。

所述溶剂a选自苯、甲苯、乙醇、丙醇、乙醚、四氢呋喃、氯仿中的一种或多种。

所述反应的方程式如下：

所述酸性催化剂与式ⅱ化合物的摩尔比为1:1～100。

所述式ⅱ、式ⅲ化合物的摩尔比为1:0.3～2.7。

所述溶剂a的加入量为：每克式ⅱ化合物对应加入5～100ml溶剂a。

所述反应的温度为55～85℃，时间4～15h。

反应完毕后，先蒸发溶剂，然后浓缩溶液，采用冰水混合物冷却后，收集沉淀，纯化，即得。纯化可采用重结晶或层析分离的方法。重结晶所用溶剂可与溶剂a相同，如采用氯仿、甲醇、乙醇等。

本发明的修饰纤维探头所采用的技术方案为：采用上述用于识别超氧阴离子的荧光探针修饰的光纤探头。

上述光纤探头的制备方法，包括如下步骤：

1)将锥形化的光纤进行表面羟基化处理，得到羟基化锥形光纤；

2)将步骤1)所得的羟基化锥形光纤、3-氨基丙基三乙氧基硅烷加入醇类化合物中浸泡，然后在反应体系中加入氨水继续进行浸泡，干燥，得预处理光纤；

3)将上述荧光探针、缩合剂和步骤2)所得的预处理光纤加入溶剂b中反应，即得。

所采用的光纤为石英材质。

步骤1)中，所述锥形化的光纤可以采用包括如下步骤的方法制备：将光纤先用浓硫酸浸泡1～2h，然后将光纤插入氢氟酸和氟化铵的混合溶液中浸泡，即得。所述混合溶液是将质量分数为30～50％的氢氟酸和质量分数为15～30％的氯化铵溶液按照体积比为75～85:15～25进行混合得到的。

可以采用依次在piranha溶液、氢氟酸、piranha溶液中浸泡的方法将锥形化的光纤进行表面羟基化处理。所述piranha溶液是将h2o2溶液和浓硫酸混合得到的。优选的，h2o2溶液的质量分数为30％。浓硫酸的质量分数为98.3％。h2o2溶液和浓硫酸的体积比为3:7。

将锥形化的光纤进行表面羟基化处理时，采用的氢氟酸的质量分数为30～50％。对锥形化的光纤进行表面羟基化处理后，依次采用水和乙醇进行清洗。

步骤2)中，所述醇类化合物为甲醇、乙醇、丙醇或丁醇。

步骤2)中，在醇类化合物中浸泡的时间为10～30min，在反应体系中加入氨水后浸泡的时间为1h～3h。氨水中nh3的质量分数为25％～28％。氨水可以提供碱性条件促进水解。加入的氨水和醇类化合物的体积比为1～3:7～9。

步骤3)中，所述溶剂b选自甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、丙酮、水中的一种或多种。

步骤3)中，所述缩合剂选自edc(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)+nhs(n-羟基硫代琥珀酰亚胺)；或者dcc(二环己基碳二亚胺)中的一种或多种。

步骤3)中，所述反应的温度为室温，时间为8～16h。

本发明的技术方案还在于：上述荧光探针在识别或检测超氧阴离子方面的应用。

本发明的有益效果：

本发明中荧光探针具有针对超氧阴离子的荧光敏感性，可与超氧阴离子反应，并导致荧光淬灭，通过探测荧光即可快速识别超氧阴离子，检测灵敏度较高，适用于超氧阴离子的便捷检测。同时，该荧光探针也可用于制备超氧阴离子探测用荧光传感器。

本发明中用于识别超氧阴离子的荧光探针和光纤探头，能快速识别溶液中的超氧阴离子，灵敏度较高，适于超氧阴离子的便捷检测。

本发明中荧光探针及光纤探头的制备工艺简单，操作简便，适于大规模工业化生产及应用。

附图说明

图1为是实施例1中的荧光探针的红外光谱图；

图2为实施例1中荧光探针对不同浓度超氧阴离子自由基(从上至下，超氧阴离子自由基的浓度分别为：0μmol/l，2μmol/l，4μmol/l，6μmol/l，8μmol/l，10μmol/l，15μmol/l，20μmol/l，25μmol/l)的荧光光谱识别图；

图3为实施例1中的光纤探头的紫外照射成像图。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的说明。

各实施例中采用的氢氟酸和氟化铵混合溶液是将质量分数为40％的氢氟酸和质量分数为25％的氟化铵溶液按照体积为8：2进行混合得到的；在将锥形化的光纤进行羟基化的过程中采用的氢氟酸的质量分数为40％；piranha溶液是将质量分数为30％的h2o2溶液和质量分数为98.3％的浓硫酸按照体积比为3:7进行混合得到的；所采用的氨水中nh3的质量分数为25％；所采用的光纤的材质为石英。

实施例1

本实施例的用于识别超氧阴离子的荧光探针，其结构式为：

上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

取0.5g对氨基苯甲酸溶于15ml无水乙醇，用滴液漏斗滴加到含0.65g香草醛的25ml无水乙醇中，再加入0.5ml冰乙酸作为催化剂，60℃回流搅拌12h，蒸出大部分溶剂有黄色固体析出，采用冰水混合物冷却后进行抽滤，然后用无水乙醇洗涤，再用无水乙醇重结晶，即得；反应方程式如下：

本实施例的光纤探头采用上述用于识别超氧阴离子荧光探针制备得到，制备方法包括如下步骤：

1)将光纤先用浓硫酸浸泡1h，然后垂直插入氢氟酸和氟化铵混合溶液中浸泡，得到锥形化的光纤；

2)将锥形化的光纤依次在piranha溶液、氢氟酸溶液、piranha溶液中浸泡，然后依次用水和乙醇进行清洗，得到羟基化锥形光纤；

3)将所得的羟基化锥形光纤、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(apteos)加入乙醇溶液中浸泡20min，然后在反应体系中加入氨水(氨水和乙醇的体积比为2：8)，再浸泡1.5h，取出光纤，在烘箱内干燥，得到预处理光纤；

4)将上述荧光探针、预处理光纤、edc+nhs加入甲醇中，在室温反应8h，即得。

本实施例的荧光探针在识别或检测超氧阴离子方面的应用。

将本实施例的荧光探针进行红外光谱测试，测试所得的红外光谱图见图1。由图1可知，～1628cm^-1附近的红外振动峰表明荧光探针分子结构中存在席夫碱结构。

采用荧光法对本实施例的荧光探针的荧光光谱进行检测：将本实施例的荧光探针配制成10μmol/l的溶液，然后加入邻苯三酚产生超氧阴离子，当溶液中超氧阴离子自由基的浓度(单位：μmol/l)不同时，荧光探针对超氧阴离子自由基的荧光光谱识别如图2所示。从图2中可以看出，随着超氧阴离子浓度的增加，溶液的荧光强度显著增强。

对本实施例的光纤探头进行超氧阴离子显微荧光成像测试，测试结果见图3。在接触超氧阴离子之前呈现出明亮的绿色荧光，接触后，荧光消失。

实施例2

本实施例的用于识别超氧阴离子的荧光探针，其结构式为：

上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

取0.5g8-氨基-3-喹啉羧酸溶于15ml甲苯，用滴液漏斗滴加到含0.17g8-羟基-4-甲氧基-2-萘甲醛的20ml甲苯中，再加入0.5ml冰乙酸作为催化剂，85℃回流搅拌15h，蒸出大部分溶剂有黄色固体析出，采用冰水混合物冷却后进行抽滤，然后用少量无水乙醇洗涤，再用无水乙醇重结晶，即得；反应方程式如下：

本实施例的光纤探头采用上述用于识别超氧阴离子荧光探针制备得到，制备方法包括如下步骤：

1)将光纤先用浓硫酸浸泡2h，然后垂直插入氢氟酸和氟化铵混合溶液中浸泡，得到锥形化的光纤；

2)将锥形化的光纤依次在piranha溶液、氢氟酸溶液、piranha溶液中浸泡，然后依次用水和乙醇进行清洗，得到羟基化锥形光纤；

3)将所得的羟基化锥形光纤、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(apteos)加入乙醇溶液中浸泡10min，然后在反应体系中加入氨水(氨水和乙醇的体积比为2：8)，再浸泡1h，取出光纤，在烘箱内干燥，得到预处理光纤；

4)将上述荧光探针、预处理光纤、dcc加入甲醇中，在室温反应12h，即得。

本实施例的荧光探针在识别或检测超氧阴离子方面的应用。

实施例3

本实施例的用于识别超氧阴离子的荧光探针，其结构式为：

上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

取2.5g10-羟基-8-甲氧基蒽-2-甲醛溶于20ml苯，用滴液漏斗滴加到含3.1g9-氨基苝-3甲酸的150ml苯中，再加入0.5ml冰乙酸作为催化剂，85℃回流搅拌4h，蒸出大部分溶剂有固体析出，采用冰水混合物冷却后进行抽滤，然后用少量无水乙醇洗涤，再用无水甲醇重结晶，即得；反应方程式如下：

本实施例的光纤探头采用上述用于识别超氧阴离子荧光探针制备得到，制备方法包括如下步骤：

1)将光纤先用浓硫酸浸泡1.5h，然后垂直插入氢氟酸和氟化铵混合溶液中浸泡，得到锥形化的光纤；

2)将锥形化的光纤依次在piranha溶液、氢氟酸溶液、piranha溶液中浸泡，然后依次用水和乙醇进行清洗，得到羟基化锥形光纤；

3)将所得的羟基化锥形光纤、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(apteos)加入乙醇溶液中浸泡30min，然后在反应体系中加入氨水(氨水和乙醇的体积比为2：8)，再浸泡2.5h，取出光纤，在烘箱内干燥，得到预处理光纤；

4)将上述荧光探针、预处理光纤、dcc加入甲醇中，在室温反应12h，即得。

本实施例的荧光探针在识别或检测超氧阴离子方面的应用。

实施例4

本实施例的用于识别超氧阴离子的荧光探针，其结构式为：

上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

取2.6g6-氨基2-芘甲酸溶于15ml无水乙醇，用滴液漏斗滴加到含1.7g4-甲基-3甲氧基-5-羟基苯甲醛的100ml无水乙醇中，再加入0.2gb2o3-al2o3作为催化剂，75℃回流搅拌12h，蒸出大部分溶剂有固体析出，采用冰水混合物冷却后进行抽滤，然后用少量无水乙醇洗涤，再用无水乙醇重结晶，即得；反应方程式如下：