吩噻嗪‑吡啶化合物及其用途的制作方法

相关申请

本申请要求2016年6月14日提交的第62/350,025号美国临时申请的优先权，出于所有目的特此将所述申请的内容通过引用整体并入本文。

发明背景

恶性肿瘤是威胁人类的致命疾病。世界卫生组织(who)于2014年公布的全球癌症报告表明，癌症患者正在快速增加。据估计，发病率到2035年时将达到2.4千万例。此外，几乎一半的新发癌症病例发生在亚洲，并且大多数发生在中国。虽然手术、放射治疗、化学治疗和免疫治疗是治疗癌症的传统方式，但是这些方法具有一些局限性，包括副作用、响应不良，因此亟需发现新型替代治疗。光动力疗法(pdt)是新兴的治疗方式，并且在肿瘤性疾病的治疗中已经被批准用于临床应用中。pdt的治疗过程涉及以下方面：(1)将光敏药物(光敏剂)通过口服或静脉内向对象给药，并且由于正常组织与发病组织之间的代谢差异，光敏剂将优先积聚在病理组织中；(2)采用具有特定波长的光照射靶组织以活化光敏剂；(3)活化的光敏剂将能量转移至周围分子以产生细胞毒性自由基或自由基离子(i型机制)；或者活化的光敏剂将能量转移至分子氧，以产生单线态氧(ii型机制)。两种途径直接或间接导致细胞破坏或死亡，而单独的光或光敏剂作用很小。

与传统治疗相比，pdt具有许多优点，例如安全性、靶向能力、微创性以及快速恢复。pdt不仅能直接杀死肿瘤细胞，而且还启动抗肿瘤免疫系统，因此预防肿瘤复发和转移。选择性地攻击并杀死肿瘤细胞而对周围正常组织具有最小损害或甚至无损害的独特特性使得pdt成为有前景的治疗。

此外，根据光敏剂的固有荧光和选择性定位能力，还可以将光敏剂用于医学诊断，其被称为光动力诊断(pdd)。随着新型光源、光纤和其它相关技术的发展，pdt的适应症已从浅表肿瘤扩展至深层组织肿瘤。还可以将pdt用于治疗一些良性疾病，例如微生物感染。近年来，由微生物、尤其是耐抗生素病原体引起的传染性疾病的全球发生正日益增加，其已经变成人类健康的重大威胁。与肿瘤细胞类似，病原微生物具有类似的性质，包括快速繁殖和代谢，因此亟需新型治疗以解决耐药性问题。独特的作用机制、突出的优点和可重复性使得pdt成为治疗传染性疾病的有前景的替代方案。

然而，有效的pdt治疗中关键要素为所使用的光敏剂。理想的光敏剂应具有高量子产率(qy)-包括单线态氧量子产率(soqy)和荧光量子产率(fqy)、在近红外区域(600nm-900nm)的强吸收、良好的选择性、低的暗毒性、稳定的组成、明确定义的结构且容易制备。光卟啉(photofrin)是由fda批准的第一光敏剂，但是其具有许多缺点，例如短波长吸收、复杂的不稳定的组成。随后开发的光敏剂主要基于四-吡咯结构以及一些临床前测试的光敏剂和经临床测试的光敏剂，例如菌绿素、texafrin、二氢卟酚e6和purlytin，所述四-吡咯结构例如美国和欧洲批准的原卟啉ix(ppix)及其前药氨基乙酰丙酸(ala)，欧洲、挪威和冰岛批准的temopofin，俄罗斯批准的磺化铝酞菁。尽管基于卟啉的光敏剂已经快速发展，但是这类化合物的结构相对复杂，制备和纯化困难，工业生产成本高，并且具有相对强的皮肤光敏性。

吩噻嗪是一类具有独特结构且制备简单的非卟啉基化合物。这类化合物还具有稳定的组成、高量子产率、弱的暗毒性、良好的肿瘤选择性、长且强的波长吸收，并且可以在i型和ii型光化学途径中都起作用。大多数这些化合物是带正电荷的并且具有良好的水溶性，这有助于降低或避免在水溶液中聚集的可能性。此外，尽管大多数光敏剂在光动力抗微生物试验中对革兰氏阳性菌是有效的，但是它们通常对革兰氏阴性菌表现出差的效果或甚至无效。吩噻嗪化合物对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都是有效的，因为它们固有的阳离子性质，其可以通过电子相互作用易于与带负电荷的膜结合。例如，亚甲蓝(mb)-吩噻嗪化合物的典型类似物，已经用于光消毒血液产品、使牙腔灭菌和杀死微生物，包括人免疫缺陷病毒(hiv)、乙型肝炎和丙型肝炎。然而，亚甲蓝还具有局限性，例如低稳定性。近年来，wainwright等人相继报道了一系列mb类似物的光动力效应，新型亚甲蓝(nmb)和二甲基亚甲蓝对肿瘤细胞和微生物显示了比mb更好的光活性(1998，2012)。在下文中，stanleyb.brown报道了一系列对称和不对称的mb类似物，被命名为ppa904的具有正丁基侧链的衍生物显示了比mb更好的光活性，并且其对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的光动力灭活也是有效的(2002,2008)。完成了使用ppa904的pdt治疗慢性下肢溃疡的ii期临床试验，并且其显示了优异的疗效。因此，需要具有优异的生理化学和光动力学性质的新型有效的非卟啉基光敏剂。本发明的吩噻嗪已经显示出其为令人惊讶地有效的光敏剂，满足该需求和其它相关需求。

发明的简要概述

在第一方面，本发明提供式(i)的吩噻嗪-吡啶化合物或其盐：

其中：r¹和r³各自为r²为h或卤素；r⁴为h、卤素、-nh2、-oh、-cn、-no2、-coch3、-cf3、c1-c10烷基、c1-c10烷氧基、c1-c10卤代烷基、c3-c6环烃基、

r⁵为h、卤素、-cn、-no2、-coch3、-cf3、c1-c12烷基、c1-c12烷氧基、c1-c6烷氧基羰基、c3-c6环烃基或-nh(c2-c10烷基)；r⁶和r⁷各自独立地为h、c1-c12烷基、c3-c6环烃基、c3-c12烯基、c3-c12炔基、-nh(c2-c10烷基)、-n(c2-c10烷基)2或被一个或多个氨基取代的c2-c10烷基、芳基、cnh2ny、ycnh2n-1y，或者当合起来时，r⁶和r⁷与和它们都连接的氮形成5元至7元杂环，其中所述杂环的任一碳原子可以任选地被-o-、-s-、-so2-或-nr⁹-替换；各个r⁸独立地为h、卤素、-no2、-cn、-coch3、-cf3、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、c3-c6环烃基或芳基；各个r⁹独立地为h、c1-c10烷基、c1-c8烷基酰基或c2-c9烷基磺酰基；各个n独立地为2至6的整数；各个x独立地选自c1-c5亚烷基、o、s、nh或nr¹⁰；各个y独立地为f、cl、br、i、oh、ome、oc2h5、oc3h7、cn或ococh3；各个r¹⁰独立地为c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、-no2、-cn、-coch3或芳基；z^-为有机抗衡阴离子或无机抗衡阴离子。

在一些实施方案中，r⁴为h、c1-c10烷基、c1-c10烷氧基或c3-c6环烃基。在一些实施方案中，r⁴为h、-ch3、-c2h5、-c3h7、-och3、-oc2h5、-oc4h9、-环丙基、-环丁基、-环戊基或-环己基。在一些实施方案中，r⁶和r⁷各自独立地为h、甲基、乙基、丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、-ch2(ch2)2nh2、-ch2(ch2)3nh2、-ch2(ch2)4nh2、-ch2(ch2)5nh2、-n(ch3)(ch2)2nh2、-n(ch3)(ch2)3nh2、-n(ch3)(ch2)4nh2或-n(ch3)(ch2)5nh2。在一些实施方案中，当合起来时，r⁶和r⁷与和它们都连接的氮形成5元至7元杂环，其中所述杂环的任一碳原子可以任选地被-o-、-s-、-so2-或-nr⁹-替换。在一些实施方案中，r⁶和r⁷为其中r¹¹为h、c1-c10烷基、c1-c8烷基酰基或c2-c9烷基磺酰基。在一些实施方案中，r⁶和r⁷各自独立地为h或c1-c12烷基。在一些实施方案中，r⁶和r⁷形成六元氮杂氧杂环或氮杂硫杂环。在一些实施方案中，r⁶和r⁷形成在一些实施方案中，z^-为卤化物离子、no2-、ch3co2-、no2^-、ch3co2^-、cf3co2^-、clo4^-、hso4^-、h2po4^-、scn^-、f4b^-、乳酸根、柠檬酸根、酒石酸根、苹果酸根、乙醇酸根、甘油酸根、葡萄糖酸根、谷氨酸根或天冬氨酸根。在一些实施方案中，z^-为f^-、cl^-、br^-、i^-、ch3coo^-、cf3coo^-或hso4^-。

在第二方面，吩噻嗪-吡啶具有式ii的结构：

在第三方面，吩噻嗪-吡啶具有式iii的结构：

在第四方面，吩噻嗪-吡啶化合物为5-氨基-9-(二乙基氨基)-3-甲基吡啶并[3,2-a]吩噻嗪-7-鎓氯化物、9-(二乙基氨基)-3-甲基-5-(丙基氨基)吡啶并[3,2-a]吩噻嗪-7-鎓氯化物、9-(二乙基氨基)-3-甲基-5-(戊基氨基)吡啶并[3,2-a]吩噻嗪-7-鎓氯化物、9-(二乙基氨基)-5-(庚基氨基)-3-甲基吡啶并[3,2-a]吩噻嗪-7-鎓氯化物、5-(癸基氨基)-9-(二乙基氨基)-3-甲基吡啶并[3,2-a]吩噻嗪-7-鎓氯化物、9-(二乙基氨基)-3-甲基-5-(甲基氨基)吡啶并[3,2-a]吩噻嗪-7-鎓氯化物、9-(二乙基氨基)-5-(二丙基氨基)-3-甲基吡啶并[3,2-a]吩噻嗪-7-鎓氯化物、9-(二乙基氨基)-5-(二戊基氨基)-3-甲基吡啶并[3,2-a]吩噻嗪-7-鎓氯化物、5-(3-氨基丙基氨基)-9-(二乙基氨基)-3-甲基吡啶并[3,2-a]吩噻嗪-7-鎓氯化物、9-(二乙基氨基)-3-甲基-5-(3-(甲基氨基)丙基氨基)吡啶并[3,2-a]吩噻嗪-7-鎓氯化物、9-(二乙基氨基)-6-碘-3-甲基-5-(丙基氨基)吡啶并[3,2-a]吩噻嗪-7-鎓氯化物或9-(二丁基氨基)-3-甲基-5-(丙基氨基)吡啶并[3,2-a]吩噻嗪-7-鎓氯化物。

除了其以上所述的化学结构以外，本发明的吩噻嗪-吡啶化合物为光敏剂。换言之，它们共享相同或类似的功能特征，即在接收激发光(例如，在约600nm-900nm的波长范围内)时能够产生细胞毒性自由基或自由基离子(i型机制)或产生单线态氧(ii型机制)，以便通过引起靶细胞死亡或损害靶细胞并使其不能独立存活来抑制靶细胞增殖。

在第五方面，本发明提供包含(1)光敏剂和(2)药学上可接受的赋形剂的药物组合物，所述光敏剂例如具有式i的通用结构并且在上文和本文中进行描述的化合物。

在第六方面，本发明提供用于抑制细胞增殖的方法。所述方法包括以下步骤：(a)使靶细胞与有效量的本文所述的吩噻嗪-吡啶化合物接触，所述靶细胞通常经历不适当的增殖，例如恶性肿瘤细胞或传染性细菌细胞；以及(b)使所述化合物与在其附近的靶细胞一起暴露于具有约600nm-900nm的适当波长(例如，约600nm-700nm)的光下，然后通过由光活化的吩噻嗪-吡啶化合物产生的细胞毒性自由基/自由基离子或单线态氧，该吩噻嗪-吡啶化合物引起靶细胞死亡。在一些实施方案中，靶细胞为肿瘤细胞或癌细胞。在一些实施方案中，靶细胞为细菌细胞，其可以是革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，例如大肠杆菌或金黄色葡萄球菌。在一些实施方案中，靶细胞在对象的体内，所述对象例如人或动物对象。因此，本文所述的方法有效地提供用于治疗对象的增殖性疾病的治疗方法，所述增殖性疾病包括多种类型的癌症或涉及诸如细菌和病毒的微生物病原体的感染。可以以这种方式治疗的肿瘤/癌症包括肺癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、结肠癌、食管癌、口腔癌、淋巴瘤、阴茎癌、前列腺癌、皮肤癌、妇科癌、胃肠道间质瘤、头部肿瘤、颈部肿瘤、眼部肿瘤等。可以以这种方式治疗的细菌感染包括由革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌(例如，大肠杆菌或金黄色葡萄球菌)引起的感染。在一些实施方案中，本文所述的方法有效地提供用于治疗眼科疾病(amd)、关节炎、动脉粥样硬化和再狭窄的治疗方法。可以采用多种给药途径将化合物递送至对象，包括口服摄取、局部施用和注射(例如皮下、静脉内、肌内、腹膜内和瘤内注射)。

在第七方面，本发明提供了组合物，其中本文所述的吩噻嗪-吡啶化合物与增殖细胞或众多增殖细胞一起存在，所述增殖细胞例如恶性增殖细胞(例如，肿瘤细胞或癌细胞)或良性增殖细胞(例如，细菌细胞，其可以是革兰氏阳性菌细胞或革兰氏阴性菌细胞，例如大肠杆菌或金黄色葡萄球菌)。在一些实施方案中，本发明提供了组合物，其中本文所述的吩噻嗪-吡啶化合物与良性增殖性疾病(包括但不限于葡萄酒色痣(pws)、狼疮和痤疮)、病毒感染(包括但不限于hiv、生殖器疣、乙型肝炎和丙型肝炎)，或寄生虫感染(包括但不限于利什曼原虫和疟原虫)一起存在。在某些情况下，组合物可以在暴露于或浸于约600nm-900nm波长的光时存在。

在第八方面，本发明提供组合物，其中本文所述的吩噻嗪-吡啶化合物由于其固有的荧光性质和易于集中在肿瘤和患病组织中的能力而可以用作诊断剂。

在相关方面，本发明提供本文所述的吩噻嗪-吡啶化合物在制造用于治疗疾病或病症的药物中的用途，在所述疾病或病症中存在不适当或不期望的细胞增殖，例如癌症或微生物感染(例如，细菌感染)。可以将表现出光动力活性的吩噻嗪-吡啶化合物与一种或多种生理上可接受的赋形剂一起配制用于向已经被诊断患有疾病或病症的对象给药。可以将吩噻嗪-吡啶化合物进行配制用于经由多种途径给药，所述途径例如口服摄取、局部施用或注射，包括皮下、静脉内、肌内、腹膜内和瘤内注射。

此外，本发明提供利用本文所述的吩噻嗪-吡啶化合物的用于各种物体(例如纺织品、皮革、手术台、包装材料)、生物医学材料(例如人工器官、医用导管和组织修复材料)、流体(例如水、血液样品)以及食物、饮料和家居用品的灭活和杀菌的组合物或方法。

附图简述

图1示出了化合物8、14、23和24在不存在(实心符号)和存在(空心符号)光(635nm激光)下对mda-mb-231细胞的细胞毒性作用。

图2示出了通过监测1,3-二苯基异苯并呋喃(dpbf)在光照(630nmled灯)下于etoh中的衰减率，所制备的化合物(所有都为2μm)的¹o2产生效率。

图3示出了在不存在光和存在光下使用2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(dcfh-da)作为探针，ht29细胞中细胞内活性氧(ros)产生效率。

图4示出了使用630nmled灯(106mw/cm²)在不同照射时间下对ht29细胞的光动力活性，所有都为0.5μm。

图5示出了使用635nm激光在不同光剂量下化合物14对mda-mb-231细胞的光动力活性。

图6示出了金黄色葡萄球菌(s.aureus)对化合物8的细胞摄入。

图7a和图7b分别示出了在不存在光时化合物(8、14、23和24)对金黄色葡萄球菌(a)和大肠杆菌(e.coli)(b)的细胞毒性。

图8a和图8b分别示出了在存在光(635nm激光)时化合物(8、14、23和24)对金黄色葡萄球菌(a，光剂量＝30j/cm²)和大肠杆菌(b，光剂量＝50j/cm²)的细胞毒性。

图9a和图9b分别示出了在存在不同光剂量时化合物14对金黄色葡萄球菌(a)和大肠杆菌(b)的细胞毒性。

定义

本文所用的术语“卤素”是指氟、氯、溴和碘。

本文所用的术语“烷基”是指具有所示碳原子数的直链或支链的、饱和的脂肪族基团。例如，c1-c6烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基等。其它烷基包括但不限于庚基、辛基、壬基、癸基等。烷基可以包括任意数目的碳，例如1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、3-4、3-5、3-6、4-5、4-6和5-6个。烷基通常是单价的，但可以是二价的，例如当烷基使两个部分连接在一起时。

本文所用的术语“烷氧基”是指具有氧原子的上文所定义的烷基，所述氧原子将烷基连接至连接点。烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、2-丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等。烷氧基还可以被本文所述的多种取代基取代。例如，烷氧基可以被卤素取代以形成“卤代烷氧基”基团。

本文所用的术语“卤代烷基”是指其中一些或全部的氢原子被卤素原子取代的上文所定义的烷基。卤素(卤代)优选表示氯或氟，但也可以是溴或碘。例如，卤代烷基包括三氟甲基、氟甲基等。术语“全氟”定义了所有的氢原子都被氟取代的化合物。例如，全氟苯基是指1,2,3,4,5-五氟苯基，全氟甲基是指1,1,1-三氟甲基，并且全氟甲氧基是指1,1,1-三氟甲氧基。

本文所用的术语“环烃基”是指含有3个至12个环原子或所示原子数的饱和或部分不饱和的单环、稠合双环或桥接多环的环组合，单环的环烃基包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环辛基。双环和多环包括例如降冰片烷、十氢化萘和金刚烷。例如，c3-8环烃基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环辛基和降冰片烷基。

本文所用的术语“烷氧基羰基”是指通过本文所定义的羰基附接到母体分子部分的本文所定义的烷氧基。烷氧基羰基的代表性实例包括但不限于甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基等。

本文所用的术语“胺”是指具有一个或多个氨基的本文所定义的烷基。氨基可以是伯、仲或叔氨基。烷基胺还可以被羟基取代。用于本发明的胺包括但不限于乙胺、丙胺、异丙胺、乙二胺和乙醇胺。氨基可以使烷基胺与化合物的其余部分在为烷基的ω位的连接点连接或使烷基的至少两个碳原子连接在一起。本领域技术人员应理解，其它烷基胺也用于本发明中。

本文所用的术语“烯基”是指具有至少一个双键的直链或支链烃基。烯基的实例包括但不限于乙烯基、丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、异戊烯基、1,3-戊二烯基、1,4-戊二烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1,3-己二烯基、1,4-己二烯基、1,5-己二烯基、2,4-己二烯基或1,3,5-己三烯基。烯基还可以具有2个至3个、2个至4个、2个至5个、3个至4个、3个至5个、3个至6个、4个至5个、4个至6以及5个至6个碳。烯基通常是单价的，但可以是二价的，例如当烯基使两个部分连接在一起时。

本文所用的术语“炔基”是指具有至少一个叁键的直链或支链烃基。炔基的实例包括但不限于乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、异丁炔基、仲丁炔基、丁二炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、异戊炔基、1,3-戊二炔基、1,4-戊二炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、1,3-己二炔基、1,4-己二炔基、1,5-己二炔基、2,4-己二炔基或1,3,5-己三炔基。炔基还可以具有2个至3个、2个至4个、2个至5个、3个至4个、3个至5个、3个至6个、4个至5个、4个至6以及5个至6个碳。炔基通常是单价的，但可以是二价的，例如当炔基使两个部分连接在一起时。

本文所用的术语“芳基”是指含有6个至16个环碳原子的单环或稠合的双环、三环或更多环的芳环组合。例如，芳基可以是苯基、苄基或萘基，优选为苯基。“亚芳基”意指来自芳基的二价基团。芳基可以被一个、两个或三个选自以下的基团单取代、二取代或三取代：烷基、烷氧基、芳基、羟基、卤素、氰基、氨基、氨基-烷基、三氟甲基、亚烷基二氧基和氧基-c2-c3-亚烷基；所有基团任选地被进一步取代，例如如前文所定义的；或者1-萘基或2-萘基；或者1-菲基或2-菲基。亚烷基二氧基为与苯基的两个相邻碳原子连接的二价取代基，例如亚甲基二氧基或亚乙基二氧基。氧基-c2-c3-亚烷基也是与苯基的两个相邻碳原子连接的二价取代基，例如氧基亚乙基或氧基亚丙基。氧基-c2-c3-亚烷基-苯基的实例为2,3-二氢苯并呋喃-5-基。

本文所用的术语“杂环”是指具有3个环成员至约20个环成员和1个杂原子至约5个杂原子(例如n、o和s)的环系统。其它杂原子也是可用的，其包括但不限于b、al、si和p。还可以将杂原子氧化，例如但不限于-s(o)-和-s(o)2-。例如，杂环基包括但不限于四氢呋喃基、四氢噻吩基、吗琳基、吡咯烷基、吡咯啉基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌嗪基、哌啶基、吲哚啉基、奎宁环基和1,4-二氧杂-8-氮杂-螺[4.5]癸-8-基。

本文所用的“羰基”意指由与氧原子双键键合的碳原子组成的官能团：-c＝o。羰基包括但不限于醛、酮、羧酸、酯和酰胺。

本文单独或组合使用的术语“磺酰基”是指-so2-。

本文所用的“c1-c8烷基酰基”的实例包括但不限于

本文所用的“c2-c9烷基磺酰基”的实例包括但不限于

除非特别提及，本发明的烷基、烷氧基、卤代烷基、环烃基、烷氧基羰基、胺、烯基、炔基、芳基、杂环、羰基和磺酰基可以是取代或未取代的。例如，c1-c6烷基可以被一个、两个或三个选自羟基、卤素、烷氧基、二烷基氨基或诸如吗琳基、哌啶基的杂环的取代基取代。

本文所用的“抗衡阴离子”或“阴离子”是指带负电荷的离子。抗衡阴离子的实例包括但不限于卤化物离子、no2-、ch3co2-、no2^-、ch3co2^-、cf3co2^-、clo4^-、hso4^-、h2po4^-、scn^-、f4b^-、乳酸根、柠檬酸根、酒石酸根、苹果酸根、乙醇酸根、甘油酸根、葡萄糖酸根、谷氨酸根或天冬氨酸根。

本申请所用的“增加”或“降低”是指相对于比较对照，在数量上的可检测的正变化或负变化，所述比较对照例如建立的标准对照(例如在相同类型的未处理的靶细胞中所发现的平均细胞增殖率或细胞死亡率)。增加是通常为至少10％或至少20％、或50％、或100％的正变化，并且可以高达对照值的至少2倍、或至少5倍或甚至10倍。类似地，降低是负变化，其通常为对照值的至少10％或至少20％、30％、或50％或甚至高达至少80％或90％。表示与比较基础的数量变化或差异的其它术语(例如“更多”、“更少”、“更高”和“更低”)以与上述相同的方式用于本申请。相反，术语“基本上相同”或“基本上没有变化”表示相对于标准对照值在数量上很少变化至无变化，其通常在标准对照的±10％内，或者在标准对照的±5％、±2％内或甚至更小的变化

本文所用的术语“抑制(inhibiting/inhibition)”是指对目标生物过程的任何可检测的负作用，该目标生物过程例如细胞信号转导、细胞增殖、致瘤性、转移潜能和疾病/疾病状态的复发。通常，在与未施用抑制剂的对照相比时，抑制反映为在施用抑制剂时目标过程(例如，靶细胞之间的细胞死亡率或增殖率)的至少10％、20％、30％、40％或50％的降低。

当用在提及预定值的上下文中时，术语“约”描述偏离预定值的+/-10％的值的范围。

本申请所用的术语“治疗(treat/treating)”描述了导致相关疾病状态的任何症状的消除、减少、减轻、逆转、预防、延迟发作或复发的行为。换言之，“治疗”疾病状态涵盖对疾病状态的治疗性干预和预防性干预。

本文所用的术语“有效量”是指在数量上足以产生所期望的作用的给定物质的量。例如，光敏剂的有效量是所述化合物实现靶细胞增殖率的水平降低或靶细胞死亡率的增加的量，使得在已经给予用于治疗目的的所述化合物的对象中，涉及此类靶细胞的不适当增殖的疾病或疾病状态的症状、严重性和/或复发变化被减少、逆转、消除、防止或延迟发作。将适于实现此目的的量定义为“治疗有效剂量”。剂量范围随所给药的治疗剂的性质和诸如给药途径和个体的疾病状态的严重性的其它因素而变化。

本文所用的术语“对象”或“需要治疗的对象”包括由于处于涉及不适当或不期望的细胞增殖的疾病或疾病状态(例如感染或任何类型的癌症)的风险或实际上患有以上疾病或疾病状态而需要医疗护理的人或动物。对象还包括当前进行寻求治疗方案的操作的治疗的个体。需要治疗的对象或个体包括表现出此类疾病或疾病状态的症状或处于患有疾病/疾病状态或其症状的风险的那些对象或个体。例如，需要治疗的对象包括对各类癌症有遗传易感性或家族史的个体、已经在过去遭受相关症状的那些个体、已经暴露于触发物质或事件的那些个体、以及遭受疾病状态的慢性或急性症状的那些个体。“需要治疗的对象”可以处于生命中的任何年龄。

发明详述

i.引言

本发明涉及吩噻嗪-吡啶化合物、其药学上可接受的组合物、医学组合物以及这些化合物和组合物在光动力疗法(pdt)以及诊断和检测、光消毒或光灭菌中的用途。

有效的pdt治疗中的关键要素为光敏剂，并且本发明描述了一系列新型的基于吩噻嗪-吡啶的光敏剂的制备和用途。本发明的化合物具有相对简单的结构、长波吸收、高的单线态氧产生以及在肿瘤细胞和正常细胞之间的良好选择性。本发明的化合物还可以在光活化下杀死多种肿瘤细胞。此外，本发明的化合物可以在光活化下快速且有效地根除多种细菌。原料的丰富、制备方法的容易性和有前景的光动力活性使得这些化合物拥有显著的使用价值。

ii.本发明的吩噻嗪-吡啶化合物

本发明提供被光活化的化合物，所述光具有适当的波长，通常为600nm-900nm，优选为630nm-700nm。光源可以是任何适当的光源，包括但不限于激光(包括脉冲激光和连续激光)、二极管、疝灯等。光剂量为1j/cm²-200j/cm²，优选为1j/cm²-100j/cm²。可以在给药后0-24h的任意时间给予光照，优选为在0-6h期间，并且更优选为10min-3h。优选地将曝光定位于病理区域，并且增加的光强度通常减少暴露时间。

本发明提供新型吩噻嗪-吡啶化合物，其可以用作用于光动力疗法(pdt)的优异的光敏剂以治疗增殖性疾病，所述增殖性疾病包括良性增殖性疾病(例如由微生物感染，例如细菌或病毒引起的那些疾病)和恶性增殖性疾病(例如多种肿瘤，尤其是癌症)。

iii.吩噻嗪-吡啶化合物的合成

除了文献中已知的方法或在标准方法的实验程序中例示的方法以外，本发明提及的式i化合物可以按照以下方案来制备。因此，以下方案仅用于例示。其不限于所列的化合物或任何特定的取代基。本方案所示的取代基的数目不要求匹配权利要求中所用的数目，而是为了清楚起见。本发明的式i化合物可以通过使用苯胺和喹啉的类似物由本领域技术人员以两个步骤来制备。制备方案非常简单，并且所有原料都是可商购的。其易于工业化。其中，如以上选择a、b、c、d、x和z，化合物1和3可以直接来自可商购的材料，或者通过可商购获得的材料，例如化合物3a和3b来制备。

vi.增殖细胞的抑制和增殖性疾病的治疗

通过证实本发明的吩噻嗪-吡啶化合物是在暴露于适当波长(例如在约600nm至900nm，优选在600nm至700nm)的光时能够产生细胞毒性自由基/自由基离子或产生单线态氧的有效光敏剂，本发明人已经确定这些新型吩噻嗪-吡啶化合物通过杀死预定的靶细胞来用于抑制细胞增殖，此类增殖细胞包括恶性细胞(肿瘤细胞)和细菌细胞。因此，在存在不适当的增殖的情况下，这些化合物是用于疾病或疾病状态的光动力疗法的有用的治疗剂。这些疾病和疾病状态可以涉及恶性增殖(例如，多种癌症)或良性增殖(例如，由诸如细菌、病毒或寄生虫的微生物引起的感染)。

a.药物组合物

本发明的化合物在制造药物组合物或药物中是有用的。可以将药物组合物或药物向对象给药以治疗增殖性疾病。

本发明的吩噻嗪-吡啶化合物适用于制造包含与适于施用的赋形剂或载体相结合或混合的有效量的该化合物的药物组合物或药物。

本发明的示例性药物组合物包含(i)一种或多种本文所述的吩噻嗪-吡啶化合物，以及(ii)药学上可接受的赋形剂或载体。术语药学上可接受的和生理学上可接受的在本文以相同意义进行使用。可以以治疗有效剂量提供吩噻嗪-吡啶化合物用于本文所述的治疗方法中。

药物组合物的载体包括但不限于：脂质体、纳米颗粒、囊泡、微泡、微球、纳米泡、胶束、乳液、凝胶、液晶、生物医学材料等。所述组合物可以由一般递送介质或辅料组成，其包括但不限于乙醇、聚乙二醇、二甲基亚砜、吐温、甘油、蓖麻油、缓冲剂等。

可以将本发明的吩噻嗪-吡啶化合物经由脂质体给药，其用于将缀合物靶向特定组织以及增加组合物的半衰期。脂质体包括乳液、泡沫、胶束、不溶性单层、液晶、磷脂分散体、片状层等。在这些制剂中，将待递送的化合物单独地并入作为脂质体的一部分，或者将其与和例如靶细胞(例如上皮细胞)之间普遍的受体结合的分子或其它治疗性组合物或免疫原性组合物相结合地并入作为脂质体的一部分。因此，可以将填充有本发明的吩噻嗪-吡啶化合物的脂质体导向治疗部位，然后所述脂质体递送组合物。由标准的形成囊泡的脂质形成用于本发明的脂质体，其通常包括中性和带负电荷的磷脂和固醇，例如胆固醇。脂质的选择通常通过考虑例如脂质体大小、酸不稳定性和脂质体在血流中的稳定性来进行指导。多种方法可用于制备脂质体，如例如szoka等人(1980)ann.rev.biophys.bioeng.9:467,第4,235,871号、第4,501,728号和第4,837,028号美国专利所述。

用于本发明的药物组合物或药物可以通过标准技术使用一种或多种生理学上可接受的载体或赋形剂来配制。本文中和由e.w.martin在“remington'spharmaceuticalsciences”中描述了合适的药物载体。可以将本发明的吩噻嗪-吡啶化合物及其生理学上可接受的盐和溶剂化物进行配制以通过任何适当的途径进行给药，所述适当的途径包括经由吸入、局部、经鼻、口服、肠胃外或直肠给药。

用于局部给药的典型制剂包括霜剂、膏剂、喷雾剂、洗剂和贴剂。然而，可以将药物组合物配制用于使用注射器或其它装置的任何类型的给药，例如，皮内、皮下、静脉内、肌内、鼻内、脑内、气管内、动脉内、腹膜内、膀胱内、胸膜内、冠状动脉内或瘤内注射。也考虑通过吸入(例如气溶胶)进行给药的制剂或用于口服、直肠或阴道给药的制剂。

b.给药途径

用于局部施用于例如皮肤和眼睛的合适制剂优选为本领域众所周知的水溶液、膏剂、霜剂或凝胶。这些制剂可以含有增溶剂、稳定剂、等渗增强剂、缓冲剂和/或防腐剂。

用于透皮施用的合适制剂包含有效量的本发明的吩噻嗪-吡啶化合物与载体。优选的载体包括帮助通过宿主皮肤的可吸收的药理学上可接受的溶剂。例如，透皮装置为绷带的形式，其包括背衬构件、含有化合物与任选的载体的储库、任选的将化合物以受控和预定的速率在延长的时期内递送至宿主皮肤的速率控制屏障和将装置固定至皮肤的装置。还可以使用基质透皮制剂。

对于口服给药，药物组合物或药物可以采取例如通过常规手段用药学上可接受的赋形剂制备的片剂或胶囊的形式。优选片剂和明胶胶囊，其包含活性成分，即吩噻嗪-吡啶化合物连同(a)稀释剂或填充剂，例如，乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纤维素(例如，乙基纤维素、微晶纤维素)、甘氨酸、果胶、聚丙烯酸酯和/或磷酸氢钙、硫酸钙；(b)润滑剂，例如，二氧化硅、滑石、硬脂酸、其镁盐或钙盐、硬脂酸金属盐、胶体二氧化硅、氢化植物油、玉米淀粉、苯甲酸钠、乙酸钠和/或聚乙二醇；对于片剂，还连同(c)粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮和/或羟丙基甲基纤维素；若需要，(d)崩解剂，例如淀粉(例如，马铃薯淀粉或淀粉钠)、乙醇酸盐、琼脂、海藻酸或其钠盐、或泡腾混合物；(e)润湿剂，例如月桂醇硫酸钠和/或(f)吸收剂、着色剂、矫味剂和甜味剂。

可以将片剂根据本领域已知的方法进行膜包衣或肠溶包衣。口服给药的液体制剂可以采用例如溶液、糖浆或者悬浮液的形式，或者它们可以呈现为在使用前用水或其它合适介质组成的干燥产物。此类液体制剂可以通过常规手段用药学上可接受的添加剂来制备，所述药学上可接受的添加剂例如助悬剂，例如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪；乳化剂，例如卵磷脂或阿拉伯树胶；非水性介质，例如杏仁油、油酯、乙醇或分馏的植物油；以及防腐剂，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸。制剂还可以视情况含有缓冲盐、矫味剂、着色剂和/或甜味剂。若需要，可以将用于口服给药的制剂适当地配制为给予本发明的吩噻嗪-吡啶化合物的控制释放。

本发明的吩噻嗪-吡啶化合物可以被配制用于通过注射，例如通过推注或连续输注进行肠胃外给药。注射用制剂可以存在于单位剂型中，例如，在安瓿中或在多剂量容器中，并加入防腐剂。可注射的组合物优选为等渗水溶液或悬浮液，并且栓剂优选地由脂肪乳剂或悬浮液来制备。组合物可以是灭菌的和/或含有佐剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶液促进剂、调节渗透压的盐和/或缓冲剂。可选地，活性成分可以是粉末形式，在使用前用合适的介质、例如灭菌无热原水组成。此外，它们还可以含有其它有治疗价值的物质。所述组合物分别根据常规的混合、制粒或包衣方法来制备，并且含有约0.1％至75％(质量分数)的活性成分，优选约1％至50％(质量分数)的活性成分。

对于通过吸入给药，活性成分、例如本发明的吩噻嗪-吡啶化合物可以以气溶胶喷雾剂形式使用适当的推进剂由加压包装或喷雾器方便地递送，所述推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。就加压的气溶胶而言，可以通过提供阀来确定剂量单位以递送计量量。可以配制例如用于吸入器或吹入器的明胶的胶囊和药筒，其包含化合物与诸如乳糖或淀粉的合适粉末基质的粉末混合物。

还可以将吩噻嗪-吡啶化合物配制为直肠组合物，例如栓剂或保留灌肠剂，例如含有常规的栓剂基质，例如可可油或其它甘油酯。

此外，可以将吩噻嗪-吡啶化合物配制为储库制剂。此类长效制剂可以通过植入(例如，皮下或肌内)或肌内注射来给药。因此，例如，所述吩噻嗪-吡啶化合物可以用适当的聚合物材料或疏水性材料(例如在可接受的油中作为乳剂)或者离子交换树脂进行配制，或作为微溶的衍生物，例如，作为微溶的盐。

本发明的药物组合物或药物包含(i)有效量的用作有效的光敏剂的本文所述的吩噻嗪-吡啶化合物，以及(ii)另一治疗剂。当与本发明的化合物一起使用时，此类治疗剂可以单独使用，依序使用或者与一种或多种其它此类治疗剂(例如，第一治疗剂、第二治疗剂和本发明的吩噻嗪-吡啶化合物)组合使用。可以通过相同或不同的给药途径进行给药，或者在同一药物制剂中一起给药。

c.剂量

可以将药物组合物或药物以治疗有效剂量给予对象以预防、治疗或控制本文所述的增殖性疾病。将药物组合物或药物以在对象中足以引起有效治疗响应的量给予该对象。

给予的活性剂的剂量依赖于对象的体重、年龄、个体状况、待治疗的区域的表面积或体积和给药形式。剂量的大小还将由在特定对象中特定化合物的给药所伴随的任何副作用的存在、性质和程度来确定。例如，本文所述的吩噻嗪-吡啶化合物中的每一个化合物可以具有独特的剂量。口服给药于约50kg至70kg的哺乳动物的单位剂量可以含有约5mg至500mg的化合物。通常，本发明的吩噻嗪-吡啶化合物的剂量为足以实现所期望的作用的剂量。可以由在对象的体内累积的试剂的测量值计算最佳的给药方案。通常，剂量可以每天、每周或每月一次或多次给予。本领域技术人员可以容易确定最佳剂量、给药方法学和重复频率。

为了实现所期望的疗效，可以将吩噻嗪-吡啶化合物以治疗有效的日剂量进行多天给药。因此，化合物的治疗有效给药需要周期性(例如，每天)给药，持续三天至两周或更长的周期以治疗对象的本文所述的相关疾病状态或疾病。通常，吩噻嗪-吡啶化合物将至少连续三天给药，通常至少连续五天，更通常至少连续十天，并且有时连续20天、30天、40天或更多天给药。尽管连续的日剂量是实现治疗有效剂量的优选途径，但是即使所述化合物不是每天给药，只要频繁地重复给药以足以在对象中维持化合物的治疗有效浓度，则可以实现治疗有益作用。例如，可以每隔一天或每三天给予试剂、或者如果采用较高剂量范围且被对象所耐受则每周一次给予试剂。

化合物的最佳剂量、毒性和治疗效果可以根据单个化合物的相对功效而变化，并且可以通过标准的药物程序在细胞培养物或实验动物中来确定，例如通过确定ld50(使50％的总体致死的剂量)和ed50(在50％的总体中治疗有效的剂量)。毒性作用与治疗作用之间的剂量比率为治疗指数，并且可以表达为比率ld50/ed50。优选表现出大的治疗指数的特定化合物。尽管可以使用表现出毒副作用的化合物，但是应当小心设计将此类化合物靶向受影响的组织部位的递送系统，以使对正常细胞的潜在损害最小化并且由此降低副作用。

例如，从细胞培养测定和动物研究中获得的数据可以用于制定用于人的剂量范围。此类化合物的剂量优选地在包括ed50在内的具有很少毒性或无毒性的循环浓度范围内。剂量可以在该范围内根据所采用的剂型和给药途径而变化。对于在本发明的方法中使用的任何化合物，可以由细胞培养测定来初步地估算治疗有效剂量。可以在动物模型中制定剂量以实现包括在细胞培养中测定的ic50(化合物实现症状的半数-最大抑制时的浓度)在内的循环血浆浓度范围。可以使用此类信息以更加准确地确定人的有用剂量。例如，可以通过高效液相色谱法(hplc)来测量血浆中的水平。通常，对于典型对象，化合物的剂量当量为约1ng/kg至100mg/kg。

提供本文所述的吩噻嗪-吡啶化合物的示例性剂量。在玻璃体内给药(例如，5mg/kg-30mg/kg)的情况下，吩噻嗪-吡啶化合物的示例性剂量可以为0.1-0.5mg/眼。所述化合物可以以5mg-1000mg口服给药，或者以10mg/ml-500mg/ml通过静脉输注进行给药。在替代方案中，所述化合物可以通过静脉注射或输注以50mg/ml-500mg/ml(在120分钟内)；1mg/kg-500mg/kg(在60分钟内)；或1mg/kg-100mg/kg(推注)每周五次进行给药。吩噻嗪-吡啶化合物可以以10mg-500mg皮下给药；0.1mg/kg-500mg/kg静脉给药每天两次，或约50mg每周一次给药，或25mg每周两次给药。

本发明的药物组合物可以单独给药或与至少一种另外的治疗化合物联合给药。示例性的有利的治疗化合物包括全身抗炎剂和局部抗炎药、镇痛药、抗组胺药、麻醉化合物、抗生素等。另外的治疗化合物可以与主要活性成分(例如，本发明的吩噻嗪-吡啶化合物)同时给药，或者甚至在同一组合物中与主要活性成分一起给药。另外的治疗化合物还可以单独地、在单独的组合物中或在与主要活性成分不同的剂型中给药。可以将一些剂量的主要成分、例如本文所述的新型吩噻嗪-吡啶化合物与另外的治疗化合物同时给药，而其它剂量根据个体的特定症状和特性单独给药。

本发明的药物组合物的剂量可以根据症状的严重性、复发频率和对治疗方案的生理响应在治疗的整个过程中进行调整。本领域技术人员通常从事于治疗方案的此类调整。

vii.试剂盒

除了药物组合物以外，本发明提供用于实践本文所述的治疗对象的增殖性疾病的方法的试剂盒。例如，所述试剂盒可以包含一批单独的容器，各个容器含有单剂量的药物组合物，所述药物组合物包含在用于治疗增殖性疾病的光动力疗法方案中适于用作光敏剂的本发明的吩噻嗪-吡啶化合物，所述增殖性疾病可以为恶性肿瘤或由诸如细菌的微生物引起的感染。通常，所述试剂盒还含有为用户提供说明的指导材料，以施用包含本发明的吩噻嗪-吡啶化合物的药物组合物。

实施例

仅通过示例性方式而非限制性方式提供以下实施例。本领域技术人员将易于认识到可以改变或修饰多种非关键性参数来产生基本上相同或相似的结果。

实施例1化合物7：2-氨基-5-(二乙基氨基)过氧硫代苯磺o-酸(benzenesulfonoperoxothioico-acid)

将1.2mlhcl(10mol/l)添加至n,n-二乙基-对苯二胺6(2.01g,12.0mmol)的水和甲醇(24ml,h2o/meoh4:1)溶液中，室温下搅拌混合物。将硫酸铝溶液(4.31g,12.6mmol在10ml水中)、zncl2(1.72g,12.6mmol在2ml水中)在搅拌下添加至上述溶液。将反应混合物冷却至0℃，然后添加新制备的硫代硫酸钠水溶液(3n,8ml)，在搅拌5min后，缓慢添加新制备的重铬酸钾溶液(0.5n,7.2ml)并且在0℃下搅拌3h，然后升温至室温并且搅拌1h，获得浓稠的沉淀物。将反应混合物过滤，并用水和丙酮洗涤灰色固体，在真空下干燥，得到7的灰色固体(2.39g,72％)，将其就此用于下一步。

实施例2化合物8：5-氨基-9-(二乙基氨基)-3-甲基吡啶并[3,2-a]吩噻嗪-7-鎓氯化物

向化合物7(0.14g,0.5mmol)和化合物5(40.4mg,0.25mmol)在甲醇和乙酸乙酯(6ml,meoh/乙酸乙酯4:1)中的搅拌回流溶液中缓慢添加碳酸银(0.14g,0.5mmol)，反应混合物变为蓝色。在回流2h后，将反应混合物冷却至室温，通过硅藻土过滤，并且将固体用meoh和二氯甲烷洗涤。将有机层浓缩，得到蓝色固体，将其再溶解于5ml二氯甲烷中并且用0.25mlhcl(1n在meoh中)酸化。将混合物轻轻地搅拌，浓缩并通过快速色谱法纯化，得到8的深蓝色固体(31.1mg,32％)。¹hnmr(400mhz,meod):δ9.01(d,j＝8.4hz,1h),7.91(d,9.6hz,1h),7.72(d,j＝8.5hz,1h),7.36(dd,j＝9.5,2.8hz,1h),7.22(d,j＝2.8hz,1h),7.21(s,1h),3.70(q,j＝7.1hz,4h),2.77(s,3h),1.34(t,j＝7.1hz,6h)；¹³cnmr(100mhz,cdcl3):δ162.0(c),155.5(c),153.0(c),139.7(c),139.2(c),138.6(ch),134.2(c),134.1(ch),133.5(c),133.3(c),128.7(c),127.7(ch),119.2(ch),106.5(ch),106.4(ch),47.1(ch2),24.9(ch3),13.2(ch3)ppm。lcms(esi,相对强度):m/z349([m-cl^-]⁺,100)。uv-vis(etoh):λmax(nm)658,logε4.93。

实施例3化合物3a：2-甲基-n-丙基喹啉-8-胺

将8-氨基喹哪啶5(0.65g,4mmol)、1-溴丙烷(1.48g,12mmol)、三乙胺(3.5ml)和ki(66.4mg)在dmf(10ml)中的搅拌溶液在80℃下回流72h，然后冷却至室温，并且添加20ml水，将混合物用乙醚(10ml×3)萃取，将合并的有机相用饱和nh4cl和nacl洗涤，经na2so4干燥。将残余物浓缩和通过快速色谱法纯化，得到3a的淡黄色油状物(0.477g,60％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.94(d,j＝8.4hz,1h),7.35-7.31(m,1h),7.24(d,j＝8.4hz,1h),7.01(d,j＝8.1hz,1h),6.67(d,j＝7.6hz,1h),6.21(br,1h),3.30(q,j＝6.6hz,2h),2.72(s,3h),1.88-1.79(m,2h),1.10(t,j＝7.4hz,3h)；¹³cnmr(100mhz,cdcl3):δ155.6(c),144.6(c),137.6(c),136.2(ch),126.9(ch),126.7(c),122.1(ch),113.4(ch),104.6(ch),45.4(ch2),25.3(ch3),22.7(ch2),12.0(ch3)ppm。lcms(esi,相对强度):m/z201([m+h]⁺,100)。

实施例4化合物3b：2-甲基-n,n-二丙基喹啉-8-胺

将8-氨基喹哪啶5(0.24g,1.5mmol)的化合物和1-溴丙烷(0.74g,6mmol)溶于无水thf(10ml)中。分批添加氢化钠(0.24g,6mmol)。将混合物在室温下搅拌0.5h，然后加热回流36h，在冷却至室温后，添加饱和nh4cl(3ml)并且搅拌5min。在减压下去除thf后，将残余物用乙醚(10ml×3)萃取，将合并的有机相用饱和nh4cl和nacl洗涤，经na2so4干燥，浓缩并通过快速色谱法纯化，得到3b的淡黄色油状物(0.14g,39％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.94(d,j＝8.4hz,1h),7.33-7.29(m,1h),7.24(d,j＝1.3hz,1h),7.20(d,j＝8.4hz,1h),7.02(dd,j＝7.5,1.2hz,1h),3.46-3.42(m,4h),2.72(s,3h),1.70-1.65(m,4h),0.89(t,j＝7.4hz,6h)lcms(esi,相对强度):m/z243([m+h]⁺,100)。

实施例5化合物10：3-溴丙基氨基甲酸叔丁酯

将naoh溶液(1n,132ml)缓慢添加至3-溴-丙胺氢溴酸盐9(13.40g,60mmol)和二碳酸二叔丁酯((boc)2o,13.1g,60mmol)在thf(200ml)中的搅拌混合物中，将反应混合物在室温下搅拌3h。在去除thf后，将残余物再溶解于乙醚(60ml)中，用hcl(1n)、饱和nahco3和nacl洗涤，经na2so4干燥。将混合物过滤并浓缩，得到化合物10的淡黄色油状物(13.42g,94％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ3.44(t,j＝6.5hz,2h),3.29-3.25(m,2h),2.08-2.01(m,2h),1.44(s,9h)。

实施例6化合物11：3-溴丙基(甲基)氨基甲酸叔丁酯

向化合物10(0.43g,1.8mmol)在8ml无水thf中的搅拌溶液中分批添加氢化钠(0.144g,3.6mmol)。搅拌反应0.5h后，滴加碘甲烷(0.17ml,2.7mmol)，将反应混合物继续搅拌反应24h，添加饱和nh4cl溶液(2ml)以淬灭反应。在去除thf后，将残余物再溶解于15ml乙醚中，用饱和nh4cl和nacl洗涤，经na2so4干燥，浓缩并通过快速色谱法纯化，得到11的淡黄色油状物(0.385g,85％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ3.38(t,j＝6.6hz,1h),3.33(t,j＝6.7hz,1h),3.28(t,j＝6.7hz,1h),3.13(t,j＝7.0hz,1h),2.06-2.04(m,2h),1.44(s,9h)；¹³cnmr(100mhz,cdcl3):δ155.7,79.5,49.3,47.3,31.9,28.4,2.6ppm。

实施例7化合物12：3-(2-甲基喹啉-8-基氨基)丙基氨基甲酸叔丁酯。

以与实施例3相似的程序合成该化合物。¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.90(d,j＝8.4hz,1h),7.31(dd,7.9hz,1h),7.19(d,j＝8.4hz,1h),7.00(d,j＝8.0,hz,1h),6.63(d,j＝7.5,hz,1h),6.21(s,1h),4.92(s,1h),3.33-3.28(m,4h),2.70(s,3h),1.94-1.91(m,2h),1.48(s,9h)；¹³cnmr(100mhz,meod):δ156.1(c),155.5(c),144.1(c),137.4(c),136.0(ch),126.6(ch),126.5(ch),122.0(ch),113.7(ch),104.6(ch),79.0(c),40.9(ch2),38.6(ch2),29.6(ch2),28.4(ch3),25.0(ch3)ppm。lcms(esi,相对强度):m/z316([m+h]⁺,100)。

实施例8化合物13：甲基(3-(2-甲基喹啉-8-基氨基)丙基)氨基甲酸叔丁酯

以与实施例3相似的程序合成该化合物。¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.93(d,j＝8.4hz,1h),7.30(dd,7.9hz,1h),7.24-7.22(m,1h),7.01-6.99(m,1h),6.63(d,j＝7.5,hz,1h),6.18(s,1h),4.92(s,1h),3.42-3.39(m,2h),3.33-3.32(m,2h),2.90(s,3h),2.69(s,3h),2.05-1.98(m,2h),1.47(s,9h)；lcms(esi,相对强度):m/z330([m+h]⁺,100)。

实施例9化合物14：9-(二乙基氨基)-3-甲基-5-(丙基氨基)吡啶并[3,2-a]吩噻嗪-7-鎓氯化物

以与实施例2相似的程序合成该化合物。¹hnmr(400mhz,meod):δ8.77(d,j＝8.4hz,1h),7.76(d,9.5hz,1h),7.61(d,j＝8.5hz,1h),7.31(dd,j＝9.5,2.7hz,1h),7.22(s,1h),7.14(d,j＝2.7hz,1h),3.67(q,j＝7.1hz,4h),3.56(t,j＝7.3hz,2h),2.71(s,3h),1.86-1.80(m,2h),1.34(t,j＝7.1hz,6h),1.11(t,j＝7.3hz,3h)；¹³cnmr(100mhz,meod):δ162.0(c),152.9(c),152.8(c),140.8(c),139.8(c),138.5(ch),134.3(c),134.2(ch),133.7(c),133.6(c),128.0(c),127.5(ch),119.1(ch),106.4(ch),103.4(ch),47.1(ch2),46.4(ch2),24.9(ch3),23.5(ch2),13.2(ch3),11.7(ch3)ppm。lcms(esi,相对强度):m/z391([m-cl]⁺,100)。uv-vis(etoh):λmax(nm)666,logε5.01。

实施例10化合物15：9-(二乙基氨基)-3-甲基-5-(戊基氨基)吡啶并[3,2-a]吩噻嗪-7-鎓氯化物

以与实施例2相似的程序合成该化合物。¹hnmr(400mhz,meod):δ8.59(d,j＝8.4hz,1h),7.63(d,8.4hz,1h),7.50(d,j＝8.4hz,1h),7.24(dd,j＝9.0,2.3hz,1h),7.05(s,1h),7.03(d,j＝2.2hz,1h),3.63(q,j＝6.9hz,4h),3.50(t,j＝7.3hz,2h),2.64(s,3h),1.77(br,2h),1.47-1.45(m,4h),1.32(t,j＝7.0hz,6h),1.00(t,j＝6.7hz,3h)；¹³cnmr(100mhz,meod):δ161.9(c),152.8(c),152.6(c),140.6(c),139.7(c),138.4(ch),134.1(c),133.9(ch),133.5(c),133.4(c),127.7(c),127.4(ch),119.0(ch),106.3(ch),103.1(ch),47.0(ch2),44.8(ch2),30.3(ch3),29.9(ch2),25.0(ch3),23.6(ch2),14.5(ch3),13.2(ch3)ppm。lcms(esi,相对强度):m/z419([m-cl]⁺,100)。uv-vis(etoh):λmax(nm)651,logε4.91。

实施例11化合物16：9-(二乙基氨基)-5-(庚基氨基)-3-甲基吡啶并[3,2-a]吩噻嗪-7-鎓氯化物

以与实施例2相似的程序合成该化合物。¹hnmr(400mhz,meod):δ8.67(d,j＝8.1hz,1h),7.68(d,9.4hz,1h),7.55(d,j＝8.2hz,1h),7.27(d,j＝9.2hz,1h),7.12(s,1h),7.09(s,1h),3.65(q,j＝6.9hz,4h),3.53(t,j＝6.7hz,2h),2.67(s,3h),1.77(t,j＝6.4hz,2h),1.47-1.31(m,14h),0.93(t,j＝6.5hz,3h)；¹³cnmr(100mhz,meod):δ161.9(c),152.8(c),152.4(c),140.6(c),139.5(c),138.5(ch),134.2(c),134.1(ch),133.6(c),133.4(c),127.8(c),127.5(ch),119.1(ch),106.5(ch),103.3(ch),47.1(ch2),44.9(ch2),33.0(ch2),30.2(2ch2),28.1(ch2),24.9(ch3),23.7(ch2),14.5(ch3),13.2(ch3)ppm。lcms(esi,相对强度):m/z447([m-cl]⁺,100)。uv-vis(etoh):λmax(nm)651,logε4.89。

实施例12化合物17：5-(癸基氨基)-9-(二乙基氨基)-3-甲基吡啶并[3,2-a]吩噻嗪-7-鎓氯化物

以与实施例2相似的程序合成该化合物。¹hnmr(400mhz,meod):δ8.73(d,j＝8.4hz,1h),7.73(d,9.5hz,1h),7.58(d,j＝8.4hz,1h),7.29(dd,j＝9.2,2.8hz,1h),7.17(s,1h),7.11(d,j＝2.8hz,1h),3.66(q,j＝7.1hz,4h),3.56(t,j＝7.4hz,2h),2.69(s,3h),1.82-1.75(m,2h),1.52-1.28(m,20h),0.88(t,j＝6.7hz,3h)；¹³cnmr(100mhz,meod):δ162.0(c),152.9(c),152.7(c),140.8(c),139.8(c),138.5(ch),134.2(c),134.1(ch),133.6(c),133.6(c),127.9(c),127.5(ch),119.1(ch),106.4(ch),103.3(ch),47.0(ch2),44.8(ch2),33.1(ch2),30.8(ch2),30.7(ch2),30.5(ch2),30.5(ch2),30.2(ch2),28.1(ch2),25.0(ch3),23.7(ch2),14.4(ch3),13.2(ch3)ppm。lcms(esi,相对强度):m/z489([m-cl]⁺,100)。uv-vis(etoh):λmax(nm)651,logε4.89。

实施例13化合物18：9-(二乙基氨基)-3-甲基-5-(甲基氨基)吡啶并[3,2-a]吩噻嗪-7-鎓氯化物

以与实施例2相似的程序合成该化合物。¹hnmr(400mhz,meod):δ8.37(d,j＝8.3hz,1h),7.46(d,j＝9.4hz,1h),7.40(d,j＝8.3hz,1h),7.16(dd,j＝9.4,2.2hz,1h),6.93(d,j＝2.2hz,1h),6.78(s,1h),3.61(q,j＝6.9hz,4h),3.05(s,3h),2.58(s,3h),1.31(t,j＝7.0hz,6h)；¹³cnmr(100mhz,meod):δ161.6(c),152.8(c),152.6(c),139.7(c),139.2(c),138.2(ch),133.5(c),133.4(ch),133.0(c),132.7(c),127.1(ch),126.9(c),118.8(ch),106.1(ch),102.7(ch),47.0(ch2),30.6(ch3),24.9(ch3),13.3(ch3)ppm。lcms(esi,相对强度):m/z363([m-cl]⁺,100)。uv-vis(etoh):λmax(nm)649,logε4.70。

实施例14化合物19：9-(二乙基氨基)-5-(二丙基氨基)-3-甲基吡啶并[3,2-a]吩噻嗪-7-鎓氯化物

以与实施例2相似的程序合成该化合物。¹hnmr(400mhz,meod):δ9.09(d,j＝8.5hz,1h),7.91(d,9.5hz,1h),7.64(d,j＝8.5hz,1h),7.37(dd,j＝9.5,2.7hz,1h),7.32(s,1h),7.21(d,j＝2.7hz,1h),4.03(br,4h),3.70(q,j＝7.1hz,4h),2.69(s,3h),2.00-1.90(m,4h),1.34(t,j＝7.1hz,6h),1.11(t,j＝7.3hz,6h)；¹³cnmr(100mhz,meod):δ160.3(c),153.9(c),153.0(c),142.8(c),138.6(ch),134.7(c),134.5(ch),134.3(c),133.7(c),130.4(c),126.3(c),126.3(ch),118.8(ch),108.8(ch),106.4(ch),58.7(ch2),46.9(ch2),30.7(ch3),25.1(ch3),22.6(ch2),13.1(ch3),11.4(ch3)ppm。lcms(esi,相对强度):m/z433([m-cl]⁺,100)。uv-vis(etoh):λmax(nm)675,logε4.67。

实施例15化合物20：9-(二乙基氨基)-5-(二戊基氨基)-3-甲基吡啶并[3,2-a]吩噻嗪-7-鎓氯化物

以与实施例2相似的程序合成该化合物。¹hnmr(400mhz,meod):δ9.05(d,j＝8.4hz,1h),7.90(d,9.5hz,1h),7.62(d,j＝8.5hz,1h),7.37(dd,j＝9.6,2.8hz,1h),7.25(s,1h),7.22(d,j＝2.7hz,1h),4.02(br,4h),3.72-3.70(m,4h),2.67(s,3h),1.91(br,4h),1.49-1.47(m,8h),1.34(t,j＝7.1hz,6h),1.01(t,j＝6.8hz,6h)；¹³cnmr(100mhz,meod):δ160.2(c),153.7(c),153.0(c),142.7(c),138.6(ch),138.4(c),134.7(c),134.4(ch),134.3(c),133.7(c),130.4(c),126.3(ch),118.8(ch),108.8(ch),106.5(ch),57.2(ch2),46.9(ch2),30.1(ch2),29.0(ch2),25.1(ch3),23.7(ch2),14.5(ch3),14.4(ch3),13.1(ch3)ppm。lcms(esi,相对强度):m/z489([m-cl]⁺,100)。uv-vis(etoh):λmax(nm)676,logε4.89。

实施例16化合物21：5-(3-氨基丙基氨基)-9-(二乙基氨基)-3-甲基吡啶并[3,2-a]吩噻嗪-7-鎓氯化物

将化合物7(0.18g,0.5mmol)和化合物12(0.1g,0.32mmol)溶于甲醇和乙酸乙酯(8ml,meoh/乙酸乙酯4:1)中，将混合物搅拌并且加热至80℃。缓慢添加碳酸银(0.18g,0.64mmol)，然后回流2h，获得深蓝色溶液。在冷却至室温后，将反应混合物通过硅藻土过滤，并且用meoh和二氯甲烷洗涤固体。将滤液浓缩以留下残余物，将其通过快速色谱法纯化，得到深蓝色固体。将固体再溶解于8ml二氯甲烷中，向溶液中添加0.2mlhcl(6n在meoh中)。将反应混合物在50℃下搅拌5h。在去除溶剂后，将残余物在真空下干燥，得到蓝色固体21(55.2mg,39％)。¹hnmr(400mhz,meod):δ8.92(d,j＝8.4hz,1h),7.89(d,9.6hz,1h),7.67(d,j＝8.5hz,1h),7.39(d,j＝2.6hz,1h),7.37(s,1h),7.20(d,j＝2.6hz,1h),3.77(t,j＝7.2hz,2h),3.69(q,j＝10.3hz,4h),3.15(t,j＝7.4hz,2h),2.73(s,3h),2.23-2.16(m,2h),1.34(t,j＝7.0hz,6h)；¹³cnmr(100mhz,meod):δ162.1(c),153.2(c),152.9(c),140.8(c),140.0(c),138.8(ch),134.9(c),134.2(ch),134.1(c),133.8(c),128.1(c),127.6(ch),119.6(ch),106.4(ch),103.1(ch),47.1(ch2),41.5(ch2),38.3(ch2),28.0(ch2),24.9(ch3),13.1(ch3)ppm。lcms(esi,相对强度):m/z406([m-cl]⁺,100)。uv-vis(etoh):λmax(nm)668,logε4.82。

实施例17化合物22：9-(二乙基氨基)-3-甲基-5-(3-(甲基氨基)丙基氨基)吡啶并[3,2-a]吩噻嗪-7-鎓氯化物

以与实施例14相似的程序合成该化合物。¹hnmr(400mhz,meod):δ8.57(d,j＝8.3hz,1h),7.65(d,9.4hz,1h),7.52(d,j＝8.3hz,1h),7.31(s,1h),7.29(d,j＝9.4,hz,1h),7.10(d,j＝1.0hz,1h),3.76(t,j＝7.4hz,2h),3.66(q,j＝6.8hz,4h),3.25(t,j＝7.2hz,2h),2.80(s,3h),2.60(s,3h),2.29-2.22(m,2h),1.33(t,j＝7.1hz,6h)；¹³cnmr(100mhz,meod):δ161.7(c),153.0(c),152.2(c),140.2(c),139.3(c),138.7(ch),134.5(c),134.0(ch),133.9(c),133.1(c),127.7(c),127.5(ch),119.7(ch),106.5(ch),103.4(ch),47.9(ch2),47.2(ch2),41.9(ch2),33.8(ch3),26.9(ch2),24.9(ch3),13.3(ch3)ppm。lcms(esi,相对强度):m/z420([m-cl]⁺,100)。uv-vis(etoh):λmax(nm)658,logε4.81。

实施例18化合物23：9-(二乙基氨基)-6-碘-3-甲基-5-(丙基氨基)吡啶并[3,2-a]吩噻嗪-7-鎓氯化物

向化合物14(21mg,0.05mmol)和tfa(4.2μl,0.055mmol)在三氟乙醇(6ml)中的搅拌溶液中分批添加nis(22.5mg,0.1mmol)。将反应混合物在室温下搅拌5h，然后去除溶剂并且通过快速色谱法纯化，得到蓝色固体23(11.3mg,41％)。¹hnmr(400mhz,meod):δ8.71(d,j＝8.4hz,1h),7.76(d,9.2hz,1h),7.61(d,j＝8.4hz,1h),7.41(s,1h),7.13(d,j＝9.3hz,1h),3.69-3.65(m,4h),3.52(t,j＝7.1hz,2h),2.75(s,3h),1.91-1.84(m,2h),1.36(t,j＝7.2hz,6h),1.15(t,j＝7.3hz,3h)；¹³cnmr(100mhz,cdcl3):δ162.1(c),153.8(c),153.4(c),143.7(c),140.1(c),139.2(ch),136.8(c),135.1(c),134.7(c),134.4(ch),128.0(ch),127.0(c),115.6(ch),104.2(ch),82.3(c),46.7(ch2),40.0(ch2),25.1(ch3),23.7(ch2),14.8(ch3),11.8(ch3)ppm。lcms(esi,相对强度):m/z489([m-cl-c2h4]⁺,100)。uv-vis(etoh):λmax(nm)633,logε4.87。

实施例19化合物24：9-(二丁基氨基)-3-甲基-5-(丙基氨基)吡啶并[3,2-a]吩噻嗪-7-鎓氯化物

以与实施例2相似的程序合成该化合物。¹hnmr(400mhz,meod):δ8.81(d,j＝8.4hz,1h),7.81(d,9.4hz,1h),7.62(d,j＝8.4hz,1h),7.30(d,j＝9.7hz,1h),7.25(s,1h),7.12(s,1h),3.61-3.55(m,6h),2.70(s,3h),1.83(q,j＝7.3hz,2h),1.76-1.68(m,4h),1.54-1.45(m,4h),1.10(t,j＝7.3hz,3h),1.05(t,j＝7.2hz,6h)；¹³cnmr(100mhz,meod):δ162.0(c),153.3(c),152.9(c),140.9(c),139.9(c),138.5(ch),134.3(c),134.2(ch),133.8(c),133.6(c),128.0(c),127.6(ch),119.2(ch),106.5(ch),103.4(ch),52.7(ch2),46.4(ch2),30.9(ch2),24.9(ch3),23.5(ch2),21.1(ch2),14.3(ch3),11.7(ch3)ppm。lcms(esi,相对强度):m/z447([m-cl]⁺,100)。uv-vis(etoh):λmax(nm)654,logε4.86。

实施例20吩噻嗪-吡啶化合物的生理化学性质

所有新制备的吩噻嗪-吡啶化合物都是深蓝色固体，通过uv-可见光和荧光光谱法测量基本的生理化学性质。如表1中所示，所有的化合物在600nm-700nm的范围内都具有强吸收，其属于600nm-900nm的治疗窗。在乙醇中最大吸收为约650nm，并且它们根据化合物结构而变化。当在610nm激发时，荧光发射为约680nm。所有这些化合物具有相对高的量子产率，它们是有前景的诊断剂和成像剂。通过分配系数(logp)测定亲油性，该分配系数通过在正辛醇与pbs溶液之间的分配平衡之前和之后，测量化合物在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中的uv-vis吸收来获得，然后按照以下等式来计算：logp＝log[(a之前/a之后)-1]。其中a之前和a之后为分配前和分配后在pbs溶液中的吸收值。所有数据概述于表1中。

实施例21生物活性

细胞系和培养条件：将a549、ht29、mcf-7、mda-mb-231细胞系维持在补充有胎牛血清(10％)和青霉素-链霉素溶液(1％)的rpmi1640中，并且将wi38细胞维持在补充有胎牛血清(10％)和青霉素-链霉素溶液(1％)的dmem中。以每孔约1×10⁴(对于a549、ht29、mcf-7、mda-mb-231)或1.5×10⁴(对于wi38)个细胞接种于96孔板中，并且在37℃下在具有5％co2的湿润气氛中光照孵育过夜。

暗毒性：将细胞用不同浓度的光敏药物在黑暗中孵育24h，并且通过mtt测定来确定细胞活力。

光细胞毒性：将细胞用不同浓度的光敏药物在黑暗中孵育1h，然后通过注射器吸取孔中的培养基，并且用pbs洗涤。然后添加新鲜的培养基溶液，并且用光照射。在照射后，将细胞在黑暗中在37℃下再孵育24h，并且通过mtt测定来确定细胞活力。

通过mtt测定来测量所制备的吩噻嗪-吡啶化合物8、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23和24对正常的成纤维细胞系wi38的ic50值(50％抑制浓度)。结果示于表2中。

表3示出了通过mtt测定的所制备的吩噻嗪-吡啶化合物对多种肿瘤细胞系(a549、ht29和mcf-7细胞系)的光细胞毒性和暗毒性。

如表2中所示，大多数吩噻嗪-吡啶化合物对wi38细胞的ic50值高于10μm，这表明它们对正常组织可具有低毒性。此外，从表3中可见，这些化合物对所测试的肿瘤细胞系表现出良好的光活性，并且对ht29细胞它们比亚甲蓝在相同条件下和一些文献所报道的结果更加具有活性。此外，这类化合物在不同的肿瘤细胞之间表现出良好的选择性。尤其是对于化合物14，其表现出强的光细胞毒性，同时表现出低的暗毒性。优异的选择性和活性的这种治疗优势在临床应用中具有重大意义。图1示出了化合物8、14、24和23在不存在(实心符号)和存在(空心符号)光(635nm激光)的情况下对mda-mb-231细胞的细胞毒性作用。

实施例22吩噻嗪-吡啶化合物的光敏效率。

对于pdt使用光敏剂的机制主要通过产生活性氧(ros)以直接或间接地损坏细胞或组织，并且单线态氧被认可为主要的细胞毒性物质。通过光敏化的单线态氧产生效率是评价光敏剂的重要指标。我们采用了常规的稳态方法使用1,3-二苯基异苯并呋喃(dpbf)作为清除剂，其与单线态氧不可逆地反应以引起dpbf的衰减。通过uv/vis光谱法测量在多个照射时间段时dpbf在etoh中的浓度。将药物溶液(2μm在etoh中)用630nmled灯(106mw/cm²)照射，并且结果示于图2中。所有这些化合物都是有效的单线态氧产生剂，并且对于一些类似物，它们仅在30s的照射下可以实现80％的光敏效率(3.2j/cm²，光敏效率＝处理组的od值的降低/对照组的od值)。光敏效率遵循以下趋势：23>>14>16>17>15≈24>18>21>8>22>19≈20。化合物23对于引入重原子碘表现出最高的效率，其增强系间窜越能力，因此增加单线态氧的产生效率。

为了进一步模拟生物环境，我们通过流式细胞仪测量了这些吩噻嗪-吡啶化合物的细胞内活性氧(ros)产生效率。我们采用ht29细胞系作为细胞模型和2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(dcfh-da)作为细胞内ros指示剂，以确定2,7-二氯二氢荧光素(dcf)的荧光强度，其由dcfh-da被ros氧化而来。使用dcfh-da作为对照，将实验重复三次。为了对比，将亚甲蓝用作阳性对照。通过graphpadprism6分析数据，药物浓度均为0.5μm。如图3中所示，这些化合物的光敏效率遵循：14≈23>8>18>15>24>>16>20>17≈19≈22>21>>mb。所有这些化合物在0.5μm浓度时在光照射下在细胞中可以有效地产生ros，而mb在相同条件下几乎不产生ros。此外，细胞内ros产生效率不同于在有机溶剂中测量的ros产生效率，其可能归因于多种化合物的不同的细胞摄取量，并且在细胞中除了¹o2(ii类机制)以外还产生一些其它ros物质。

实施例23光照时间依赖性光细胞毒性

将细胞用0.5μm药物溶液孵育1h，在去除培养基后，用pbs漂洗，添加新的培养基，然后使用630nmled灯照射0s、10s、30s、60s、120s和180s。再孵育24h后，添加溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑(mtt)，并且将细胞再孵育4h。通过注射器吸取培养基，并且添加二甲基亚砜(dmso)以使晶体完全溶解，用酶标仪测量光密度(od)值，并且通过graphpadprism6分析数据。如图4中所示，大多数化合物对ht29细胞表现出时间依赖性光细胞毒性。图5显示出使用635nm激光时化合物14对mda-mb-231细胞的光剂量依赖性光细胞毒性。

实施例24细菌的光动力灭活

细菌生长和培养：将革兰氏阳性金黄色葡萄球菌或革兰氏阴性大肠杆菌在胰蛋白酶解酪蛋白大豆琼脂(tsa)上生长24h，然后将菌落转移至胰蛋白酶解酪蛋白大豆肉汤(tsb)中，并且使用振荡培养箱以200rpm的振动速度在37℃下过夜生长。将营养培养基以8000rpm离心5min，并且用灭菌的0.85％盐水(ph7.5)稀释至10⁸cfu/ml的浓度，将其在以下实验中用光敏剂进一步孵育。

在细菌中光敏剂的细胞摄取：使用化合物8作为实例在金黄色葡萄球菌上进行细胞摄取。将化合物8添加至细胞悬浮液至0.5μm的终浓度，在0min、5min、10min、15min、20min、30min、45min、60min、75min、90min和105min的时间段各去除1ml样品。将所有样品用0.85％盐水漂洗两次，然后使用先前报道的碱裂解法以快速热解细菌，并且测量上清液的荧光。在各时间段的相对荧光强度表示被细菌摄取的光敏剂的量。

光敏剂对细菌的暗毒性：将细菌悬浮液用多种浓度的光敏剂在37℃下于黑暗中孵育6h。此后，将100μl细胞悬浮液以10倍系列稀释涂布在tsa上。在37℃下孵育24h后，计数菌落形成单位(cfu)。

细菌的光动力灭活：将细菌悬浮液(2×10⁸cfu/ml)用不同浓度的光敏剂在37℃下共孵育10min，然后离心，用生理盐水洗涤一次并且再悬浮于pbs盐水中。将等分的这种悬浮液置于24孔平底板内并且用激光照射。在照射后，将100μl细胞悬浮液以10倍系列稀释涂布在tsa上，并且在37℃下孵育24h后，计数菌落形成单位(cfu)。

图6示出了金黄色葡萄球菌对化合物8的细胞摄取。证实化合物8可以被金黄色葡萄球菌快速摄取，并且在约30min时其达到峰值。这种短的细胞摄取时间在临床应用中具有重大意义。其不仅可以降低正常组织的药物摄取趋势，而且可以降低医院和患者的成本。在随后的实验中，我们选择10min用于药物共孵育，并且比较不同药物的抗菌作用。图7示出了化合物(8、14、23、24)对金黄色葡萄球菌(a)和大肠杆菌(b)的暗毒性。表明这些化合物在不存在光时是基本上无毒的。图8示出了在存在光时化合物8、14、23和24对金黄色葡萄球菌(a，光剂量＝30j/cm²)和大肠杆菌(b，光剂量＝50j/cm²)的光细胞毒性。所有这些化合物都表现出浓度依赖性光细胞毒性。在0.05μm浓度和30j/cm²光剂量下发生对金黄色葡萄球菌的明显的杀死作用，并且在2μm浓度和50j/cm²光剂量下还发生对大肠杆菌的明显的杀死作用。特别地，化合物14可以在0.5μm浓度和30j/cm²光剂量下引起对金黄色葡萄球菌的约99.9999％(6-log10-降低)的消灭，并且在6μm浓度和50j/cm²光剂量下引起对大肠杆菌的约99.999％(5-log10-降低)的消灭。图9示出了在不同光剂量下化合物14对金黄色葡萄球菌(a,0.5μm药物)和大肠杆菌(b,6μm药物)的细胞毒性。表明光细胞毒性是光剂量依赖性的。在临床应用中，可以通过控制光剂量有效地消灭病原菌。

本发明所示的化合物(例如化合物8、14、23、24)可以在低药物浓度和光剂量下快速且有效地消灭革兰氏阳性菌-金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌-大肠杆菌的病原微生物。有效浓度和光剂量比文献报道的化合物和一些临床应用的光敏剂(例如基于卟啉的化合物及其前药5-氨基乙酰丙酸(ala))的有效浓度和光剂量更低(2011,2013,2014)。而且，这些化合物的光活性还超过(临床使用的)亚甲蓝和由stanleyb.brown(2008)开发的ppa904的光活性。关于金黄色葡萄球菌，需要10μmppa904浓度和30min药物孵育时间以在60j/cm²光剂量下实现4-log10-降低，而关于大肠杆菌，对于10μm亚甲蓝在24j/cm²光剂量和30min孵育下仅能够实现0.5-log10-降低，以及在相同条件下对于ppa904仅能够实现3-log10-降低。然而，在10μm浓度下，亚甲蓝和ppa904都发生明显的暗毒性。因此，本发明所示的化合物对于在微生物的光动力灭活中的应用表现出显著价值。

将本申请中所引用的所有专利、专利申请和其它公开(包括genbank登录号)出于所有目的通过引用整体并入。

参考文献列表

1.wainwrightm等人，photobactericidalactivityofphenothiaziniumdyesagainstmethicillin-resistantstrainsofstaphylcoccusaurecus.femsmicrobiologyletters,1998,160,177-181。

2.stanleyb.brown等人，invitrophotodynamicactivityofaseriesofmethyleneblueanalogues.photochemistryandphotobiology.2002,75,392-397。

3.stanleyb.brown等人，biologicallyactivemethylenebluederivatives2008,us7371744b2。

4.gitikab.kharkwal等人，photodynamictherapyforinfections:clinicalapplications.laserssurgmed.2011,43,755-767。

5.wainwrightm等人，phenothiazinephotosensitizers.activityofmethylenebluederivativesagainstpigmentedmelanomacelllines.journalofchemotherapy.2012,12,94-104。

6.felipefsperandio等人，antimicrobialphotodynamictherapytokillgram-negativebacteria.recentpatantiinfectdrugdiscov.2013,8,108-120。

7.febiancieplik等人，antimicrobialphotodynamictherapyforinactivationofbiofilmsformedbyoralkeypathogens.frontiersinmicrobiology.2014,5,405-421。

表1：吩噻嗪-吡啶化合物的生理化学性质

表2.对正常成纤维细胞wi38细胞的暗毒性。

¹将细胞在黑暗下用吩噻嗪-吡啶化合物孵育24h，并且通过mtt测定评价细胞活力。

表3.对不同肿瘤细胞的光细胞毒性和暗毒性。

¹将细胞用吩噻嗪-吡啶化合物孵育1h，然后通过注射器吸取孔中的培养基，并且将细胞用pbs(100μl×1)洗涤。然后添加新的培养基溶液(100μl)，并且用3.2j/cm²密度的630nmled灯处理30s。在照射后，将细胞在黑暗中孵育24h，通过mtt测定评价细胞活力。

²将细胞在黑暗下用吩噻嗪-吡啶化合物孵育24h，并且通过mtt测定评价细胞活力。

³stanleyb.brown报道了在664nm激光和3j/cm²光剂量下的值(2008)。