一组用于脑膜炎败血伊丽莎白菌PCR检测的引物组合的制作方法

本发明公开了一组用于pcr的引物组合，属于微生物和分子生物学
技术领域：
。
背景技术：
：脑膜炎败血伊丽莎白菌1959年由elizabetho.king分离自新生儿脑膜炎患者，命名为flavobacteriummeningosepticum，1994年，被分类至chryseobacterium属，命名为chryseobacteriummeningosepticum，2005年，经16srrna聚类分析，被分出新的属：elizabethkingia属，命名为elizabethkingiameningoseptica。脑膜炎败血伊丽莎白菌在早产儿及婴幼儿中可引起新生儿脑膜炎暴发。脑膜炎败血伊丽莎白菌为革兰阴性杆菌，广泛分布于自然环境(例如淡水、咸水及土壤)。自1959年发现脑膜炎败血伊丽莎白菌可引起新生儿脑膜炎以来，由该菌引起的相关暴发及临床病例时有报道。1997年，karenc.bloch等报道，自1991年12月至1994年9月期间，自免疫功能不全的成人中确认6例脑膜炎败血伊丽莎白菌感染病例，并且分析了之前的相关文献，显示出脑膜炎败血伊丽莎白菌感染与早产儿、低体重儿等因素的相关性。2011年，issack等统计了2002年8月至2003年12月毛里求斯发生的脑膜炎暴发流行，8例6～20天的婴儿从脑脊液分离到脑膜炎败血伊丽莎白菌，其中7例体重低于2.5千克，菌株表现相同的耐药情况，1例确诊后死亡；治疗3周后，2例发展为脑积水，其中1例死亡，1例有较严重脑损伤；同时国内外多家医院的耐药监测均显示了脑膜炎败血黄杆菌(曾用名)/脑膜炎败血伊丽莎白菌在临床及环境分离株中占有较高的比例，同时多重耐药情况也非常普遍。尽管脑膜炎败血伊丽莎白菌具有重要的临床意义，其临床检测方法的研究却存在较多问题：1、基于脑膜炎败血伊丽莎白菌过氧化氢酶阳性、氧化酶阳性、吲哚试验阳性、of葡萄糖ox+/f-，尿素酶阴性(米尔考拉金氏杆菌阳性)、甘露醇阳性、不能还原硝酸盐(部分非典型菌株可还原硝酸盐)、明胶酶、七叶苷、onpg及dna酶阳性，金黄杆菌一般吲哚试验阳性，但是其他生化多为非发酵或反应较弱的生化特征，可以利用现有的例如id32gn、vitek2、sensitire(先德)及bdphoenix等全自动生化鉴定系统进行鉴定，此种鉴定方法的前提是具有分离纯化的菌株，因此对于未能分离培养出疑似病原的临床标本无法进行检测。同时在既往研究中显示，各种生化鉴定系统也存在一定的误判几率，该菌易与杀鲑气单胞菌(id32gn)、鞘氨醇杆菌属(vitek2)混淆。2、基于16srrna测序及序列比对技术：16srrna是脑膜炎败血伊丽莎白菌较为常见的检测手段，通过通用引物扩增测序后，可以通过16srrna全部/部分基因序列分析完成菌株的鉴别及分析。2005年，将脑膜炎败血黄杆菌从黄杆菌属分离出来重新定义为脑膜炎败血伊丽莎白菌，确定伊丽莎白菌属就是基于此种分析。然而此种技术虽然摆脱了必须培养得到纯菌的前提(尽管如此，大多数基于此种技术完成的临床样品检测工作仍然以分离培养得到纯菌为前提)，但是此种鉴定技术基于测序技术为基础，同时需进行相关序列比对工作，不适宜临床即时获取检验结果的需求。3、脂肪酸分析(fattyacidanalysis)：通过对全菌的脂肪酸提取后进行气相色谱分析，根据气相色谱图给出的保留时间、响应值、色谱峰等参数及色谱图，与已有的菌种库数据比对。现用商品化产品为microbialidentificationsystem等。此种菌株鉴定方法一方面需要获得分纯培养的菌株，另一方面需要仪器及相关菌种库数据作为支持，同样难以满足临床即时获取检验结果的需求。4、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术：以biotypermaldi-tofmassspectroscopy(brukerdaltonikgmbh,bremen,germany)为代表的飞行质谱技术基于电场下生物大分子的特征性分析，通过与特定菌种库比较对待检测样品进行鉴定，该技术目前在脑膜炎败血伊丽莎白菌的鉴定中有所应用。但是该方法同样需要仪器和相关菌种库作为数据支持，检测成本较高，而且检测结果也同样存在难以及时反馈的缺陷。5、其他分子分型方法：有研究者采用随机引物扩增指纹图谱分析(randomamplifiedpolymorphicdnafingerprinting，rapd)方法进行菌株鉴定：通过选择短序列单一引物5'-gtcgatgtcg-3'对待检测样品进行随机扩增，扩增后通过比较其随机扩增产生的多种分子量产物的组合方式进行分型分析，此种方法适宜在疑似暴发或聚集性病例中进行病原鉴定及分型，然而对于单一临床样品，限于方法本身特点，需要同已有数据库或同时进行多质控样品电泳分析。综上所述，现有各种脑膜炎败血伊丽莎白菌鉴定方法中常规的生化检测技术可能存在误判，且依赖于已分离培养的菌株，脂肪酸分析及maldi-tof技术均需要较为昂贵的仪器和完善的菌种库数据信息，16srrna基因序列分析需对产物进行测序分析，rapd存在较大随机性，且限于电泳条件的不同，缺乏完善的protocol和标准化的数据库，试验结果难以做到实验室间的比较。pcr方法是一种用于放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术，目前在遗传病的产前诊断、致病病原体的检测、癌基因的检测和诊断、dna指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证、动、植物检疫及高科技生物医学领域中均有所应用，以该方法为基础的real-timepcr方法通过加入荧光基团，利用仪器收集扩增过程中荧光强度变化的方法简化了普通pcr需要电泳读胶的过程，也减少了检测中可能造成环境污染的环节，同时在临床中得到了广泛的应用。无论pcr或real-timepcr方法，同样以特异性的靶基因(或核酸片段)作为临床诊断的基础，对于疑似为脑膜炎败血伊丽莎白菌感染的临床病例，目前尚没有靶基因(或核酸片段)可用于快速的pcr检测。基于现有技术存在着的诸多问题，本发明的目的就是寻找足以代表脑膜炎败血伊丽莎白菌序列特异性的靶核酸片段，并由此建立较好特异性及敏感性的核酸扩增或者非诊断目的的检测方法。技术实现要素：基于上述发明目的，本发明通过分析比对已有脑膜炎败血伊丽莎白菌序列，筛选出具有序列特异性的核酸片段ema，并建立相关pcr检测，对其敏感性及特异性进行了评价，并通过与已有同种属菌株核酸序列进行比较，证明该核酸片段具有较好的特异性及敏感性，建立的pcr/sybrgreenreal-timepcr检测方法可以很好地对临床疑似菌株或未分离到菌株的疑似样品进行检测。本发明首先提供了一种用于pcr扩增的引物序列组合，所述组合分为上游引物和下游引物，(1)所述上游引物含有的核苷酸序列选自以下的序列集合：如seqidno.12所示核苷酸序列的第1-150bp之间范围的长度为15-25bp的核苷酸序列；以及(2)所述下游引物含有的核苷酸序列选自以下的序列集合：如seqidno.12所示核苷酸序列的第300-444bp之间范围的长度为15-25bp的核苷酸序列。在一个优选的技术方案中，所述上游引物含有的核苷酸序列选自seqidno.1、3、5、7、9或者11；所述下游引物含有的核苷酸序列选自seqidno.2、4、6、8或者10。优选地，所述序列组合的上游引物和下游引物分别为(1)seqidno.1与seqidno.2；或者(2)seqidno.3与seqidno.4；或者(3)seqidno.5与seqidno.6；或者(4)seqidno.7与seqidno.8；或者(5)seqidno.9与seqidno.10；或者(6)seqidno.11与seqidno.2；或者(7)seqidno.9与seqidno.4；或者(8)seqidno.7与seqidno.6。更为优选地，所述序列组合的上游引物和下游引物为seqidno.5与seqidno.6。或者，所述序列组合的上游引物和下游引物为seqidno.7与seqidno.8。其次，本发明还提供了一种pcr扩增的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提取待扩增样本的dna；(2)将步骤(1)获得的dna置于pcr扩增系统，并加入扩增引物、dntp、taq酶及扩增缓冲液，所述扩增引物选自上文任一所述的引物；(3)检测扩增结果。优选地，所述pcr扩增的退火温度为58℃～64℃。在一个优选的技术方案中，步骤(2)的扩增为普通pcr扩增。在另一个优选的技术方案中，步骤(2)的扩增为sybrgreenreal-timepcr扩增。优选地，在pcr扩增完成后，将反应温度自退火温度55℃升温至95℃收集荧光，测定产物熔解曲线。本发明提供的序列组合及用于对脑膜炎败血伊丽莎白菌基因组中片段ema的pcr扩增，显示了优异的特异性和敏感性，对在细菌鉴定中容易与脑膜炎败血伊丽莎白菌混淆的脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、李斯特菌、肺炎支原体、百日咳鲍特菌、肺炎克雷伯菌及结核分支杆菌等易引起脑膜炎及上呼吸道症状的常见病原菌均能够一次性区别开来，而且检测下限可达10-4ng/μl。本发明对脑膜炎及上呼吸道症状的常见病原菌的鉴定具有重要的意义和广泛的应用前景。附图说明图1.基于脑膜炎败血伊丽莎白菌的序列比对及引物设计位置示意图；图2.特异性核酸片段ema位置示意图；图3.8组引物pcr扩增产物电泳图谱；图4.a和b组引物pcr扩增特异性电泳图谱；图5.c和d组引物pcr扩增特异性电泳图谱；图6.e和f组引物pcr扩增特异性电泳图谱；图7.g和h组引物pcr扩增特异性电泳图谱；图8.sybrgreenreal-timepcr八组引物特异性扩增曲线；图9.a1-a3特异性扩增熔解曲线差异比较图；图10.f1-f3-f8特异性扩增熔解曲线差异比较图；图11.b1-b7特异性扩增熔解曲线差异标记图；图12.8组引物敏感性验证电泳图谱；图13.sybrgreenreal-timepcr敏感性验证扩增图谱具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。扩增靶片段ema的比对和确定本发明利用已有脑膜炎败血伊丽莎白菌及同属其他种及亚种基因组信息，通过相似性比对，找到相对特异性核酸片段ema(参考序列的genbank信息为：asan01000002.1147333-147776>lcl|query_239012:147333-147776gi|507153071|gb|asan01000002.1|elizabethkingiameningosepticaatcc13253＝nbrc12535strainatcc13253contig00002)。该片段长度为444bp，其序列如seqidno.12所示，其具体序列与其他已有基因组比较结果如图1所示。图1为所选特异性核酸序列ema在部分脑膜炎败血伊丽莎白菌基因组中比对结果及所设计特异性引物seqidno.1～seqidno.11在该核酸序列中位置示意图，图1中参与比对的脑膜炎败血伊丽莎白菌基因组对应相关菌株编号分别为(从上至下：atcc13253、nbrc12535、ccug214、em1、em3、nv2016、kc1913、em2)。比对结果显示，该444bp长度的核酸片段已有的脑膜炎败血伊丽莎白菌中均存在高度相似性片段，部分其他脑膜炎败血伊丽莎白菌基因组中该片段存在部分snp位点或片段缺失。表1列出此研究中为比较ema序列在伊丽莎白菌属中的特异性选用的存在于现有技术的伊丽莎白菌属中相关基因组及相关索引编号。表1.交叉比对寻找脑膜炎败血伊丽莎白菌特异性核酸片段所选用的基因组相关信息insdc：国际核苷序列联合数据库索引编码；genbank：基因组数据库编号genbankassemblyaccession：基因组数据库组装序列号refseqassemblyaccession：参考序列数据库组装序列号通过比对可知，该片段具有脑膜炎败血伊丽莎白菌种特异性，其片段与其他已有基因组比较结果显示，大部分区域可以作为特异引物设计区域，设计引物可以进行脑膜炎败血伊丽莎白菌pcr鉴定。所选择特异性核酸片段被命名为ema，位置如图2所示，ema片段位于duf4872与murnac-laa之间间隔区上。引物设计根据pcr扩增的靶片段ema设计了6条上游引物(-f)，和5条下游引物(-r)，其位点和序列如表2所示。表2.引物序列及退火温度引物名称位点序列(5'-3')退火温度ema9-f9seqidno.147.4ema443-r443seqidno.247.2ema27-f27seqidno.349.8ema439-r439seqidno.450.6ema58-f58seqidno.551.7ema417-r417seqidno.652.4ema85-f85seqidno.755.4ema330-r330seqidno.856ema132-f132seqidno.947ema391-r391seqidno.1048.5ema175-f175seqidno.1147.6引物组合如表3所示表3.pcr扩增引物组合表参考菌株及dna制备：脑膜炎败血伊丽莎白菌(atcc13253)脑膜炎奈瑟菌(cmcc29356)、流感嗜血杆菌(cdccontrolisolatem5216)、金黄色葡萄球菌(atcc25923)、肺炎链球菌(atcc49619)、大肠杆菌(atcc25922)、单增李斯特菌(slcc2372)、肺炎支原体(atcc29342)、百日咳鲍特菌(atcc9797)、肺炎克雷伯菌(cmcc46114)及结核分支杆菌(h37rv)，各参考菌株经适宜培养基培养后，均采用qiaampdnaminikit提取试剂盒制备dna。实施例1：pcr扩增体系的建立普通pcr试剂及反应体系和条件：premixtaqmix(takaralot：rr901a)；引物通过primer3.0软件设计，由奥科鼎盛公司合成；琼脂糖(biowestlot：11176)；goldview核酸染色剂(solarbiolot：g8140)；100bpdnamarker(全式金lot：bm301-02)；凝胶成像系统bio-redgeldocxr；sensquestpcr扩增仪；eppendorf5415d离心机；dyy-8c(北京市六一仪器厂)。反应体系：名称体积(ul)终浓度2×taqmix25上游引物2400nm下游引物2400nm模板dna2h2o19总体积50ul反应条件：sybrgreenreal-timepcr检测试剂及反应体系：ultrasybrmixture(lowrox)(康为世纪lot：cw2601m)；引物通过primer3.0软件设计，由奥科鼎盛公司合成；stratagenemx3000p荧光定量pcr仪。反应体系：名称体积(ul)终浓度2×ultrasybrmix1050×roxdye0.4上游引物1400nm下游引物1400nm模板dna2h2o5.6总体积20ul反应条件：a：a组引物退火温度64℃，b、e、f、g组引物退火温度58℃，c、d、h组引物退火温度61℃；b：此步骤末期收集荧光；c：此步骤从55℃升温至95℃全程收集荧光，测定产物熔解曲线。图3为各引物组合阳性扩增产物电泳图谱，其中，1.100bpdna分子量标记，2.a引物组合阳性扩增产物，3.b引物组合阳性扩增产物，4.c引物组合阳性扩增产物，5.d引物组合阳性扩增产物，6.e引物组合阳性扩增产物，7.f引物组合阳性扩增产物，8.g引物组合阳性扩增产物，9.h引物组合阳性扩增产物。图4-图7为分组显示每组引物的特异性扩增结果，图4泳道1和14、图5、图6和图7的泳道1皆为100bpdna分子量标记。图4泳道2-12为a组引物对各个菌株的扩增结果，泳道15-25为b组引物对各个菌株的扩增结果；图5泳道2-12为c组引物对各个菌株的扩增结果，泳道14-25为d组引物对各个菌株的扩增结果；图6泳道2-12为e组引物对各个菌株的扩增结果，泳道14-25为f组引物对各个菌株的扩增结果；图7泳道2-12为g组引物对各个菌株的扩增结果，泳道14-25为h组引物对各个菌株的扩增结果。图4的泳道13为a组与b组引物阴性质控品扩增结果，图5-图7的泳道13分别为c、e和g组引物阴性质控品扩增结果，图5-图7的泳道25分别为d、f和h组引物阴性质控品扩增结果。图4、图5、图6和图7中自泳道2至泳道12，以及图4中自泳道15至泳道25，图5、图6和图7中自泳道14至泳道24中的扩增菌株依次为：脑膜炎败血伊丽莎白菌(atcc13253)、脑膜炎奈瑟菌(cmcc29356)、流感嗜血杆菌(cdccontrolisolatem5216)、金黄色葡萄球菌(atcc25923)、肺炎链球菌(atcc49619)、大肠杆菌(atcc25922)、单增李斯特菌(slcc2372)、肺炎支原体(atcc29342)、百日咳鲍特菌(atcc9797)、肺炎克雷伯菌(cmcc46114)、结核分支杆菌(h37rv)。从图4-到图7中可以看出，所设置的阴性对照：图4-图7的泳道13，图5-图7的泳道25均为阴性扩增结果，图4-图7的泳道2，图4的泳道15，图5-图7的泳道14，8组引物的扩增均为阳性，这些泳道的扩增菌株均为脑膜炎败血伊丽莎白菌(atcc13253)，8组引物对其余菌株的扩增均为阴性，显示了本发明8组引物对脑膜炎败血伊丽莎白菌扩增的的高度特异性。实施例2：普通pcr及sybrgreenreal-timepcr特异性验证：特异性检测：同时对脑膜炎败血伊丽莎白菌(atcc13253)脑膜炎奈瑟菌(cmcc29356)、流感嗜血杆菌(cdccontrolisolatem5216)、金黄色葡萄球菌(atcc25923)、肺炎链球菌(atcc49619)、大肠杆菌(atcc25922)、单增李斯特菌(slcc2372)、肺炎支原体(atcc29342)、百日咳鲍特菌(atcc9797)、肺炎克雷伯菌(cmcc46114)及结核分支杆菌(h37rv)进行检测。分别使用a、b、c、d、e、f、g及h引物组合针对上述易引起脑膜炎及上呼吸道症状的常见病原菌进行扩增检测，验证引物的特异性。特异性检测结果显示，a组引物针对流感嗜血杆菌可出现非目的片段大小的扩增产物(目的片段为400bp左右，流感嗜血杆菌扩增产物约为200bp左右)，其他引物组合均呈现良好特异性，未出现非特异扩增。sybrgreenreal-timepcr特异性验证，验证结果大部分与普通pcr检测结果一致，其中a3、f3、f8虽然有扩增曲线，但是扩增产物熔解曲线与目的片段熔解曲线明显不同可判定为非特异性扩增。b组引物在扩增单增李斯特菌dna中出现非特异扩增，且通过熔解曲线难以与脑膜炎败血伊丽莎白菌进行区分。图8为各组引物的sybrgreenreal-timepcr特异性扩增结果，其中，a1～h1分别为a、b、c、d、e、f、g和h引物组合对脑膜炎败血伊丽莎白菌(atcc13253)的扩增曲线；f3、a3分别为f及a引物组合对流感嗜血杆菌(cdccontrolisolatem5216)的扩增曲线；b7为b引物组合对单增李斯特菌(slcc2372)的扩增曲线；f8为f组引物对肺炎支原体(atcc29342)扩增曲线；从图8中可以看出，a、b、c、d、e、f、g和h引物组合对脑膜炎败血伊丽莎白菌(atcc13253)的扩增具有非常高的特异性。图9为a组引物扩增阳性产物熔解曲线结果；其中，a和a3分别为对脑膜炎败血伊丽莎白菌(atcc13253)和流感嗜血杆菌(cdccontrolisolatem5216)的扩增；图10为f组引物扩增阳性产物熔解曲线结果；其中f1、f3和f8分别为对脑膜炎败血伊丽莎白菌(atcc13253)、流感嗜血杆菌(cdccontrolisolatem5216)和肺炎支原体(atcc29342)的扩增。图11为b组引物扩增阳性产物熔解曲线结果；其中b1和b7分别为对脑膜炎败血伊丽莎白菌(atcc13253)和单增李斯特菌(slcc2372)的扩增；从图9-11中可以看出，a、f和b组引物物组合对脑膜炎败血伊丽莎白菌(atcc13253)的扩增显示了与其他对照菌株的完全不同的特异性熔解曲线。实施例3：普通pcr及sybrgreenreal-timepcr敏感性验证以脑膜炎败血伊丽莎白菌(atcc13253)1ng/ul浓度核酸为原液，倍比(10倍)稀释，稀释后的样品分别用普通pcr及荧光定量pcr方法进行检测。对新鲜制备脑膜炎败血伊丽莎白菌atcc13253菌株的dna定量检测后分别稀释至10-1ng/μl(1ng/μl≈4.28*105copy/ul)、10-2ng/μl、10-3ng/μl、10-4ng/μl、10-5ng/μl、10-6ng/μl、10-7ng/μl、10-8ng/μl，进行敏感性验证。图12显示了a、b、c、d、e、f、g和h引物组合普通pcr方法检测脑膜炎败血伊丽莎白菌(atcc13253)敏感性结果，在各组的电泳检测中，泳道从左至右的排列顺序均为：100bpdna分子量标记、10-1ng/μl模板、10-2ng/μl模板、10-3ng/μl模板、10-4ng/μl模板、10-5ng/μl模板、10-6ng/μl模板、10-7ng/μl模板、10-8ng/μl模板。图12显示各组引物的检测下限可达10-4ng/μl。图13为分组显示a、b、c、d、e、f、g和h引物组合sybrgreenreal-timepcr方法检测脑膜炎败血伊丽莎白菌(atcc13253)敏感性结果。图13显示各组引物的检测下限可达10-4ng/μl。敏感性检测结果汇总：各引物组无论普通pcr及sybrgreenreal-timepcr大多数敏感性均相似，检测下限可达10-4ng/μl，其中普通pcr检测中f组检测敏感性略低，仅达10-3ng/μl。序列表<110>中国疾病预防控制中心传染病预防控制所<120>一组用于脑膜炎败血伊丽莎白菌pcr检测的引物组合<160>12<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>elizabethkingiameningoseptica<400>1aggaagtattggatcagtct20<210>2<211>19<212>dna<213>elizabethkingiameningoseptica<400>2atatttcggatcattctca19<210>3<211>17<212>dna<213>elizabethkingiameningoseptica<400>3ctcatttcttggagggg17<210>4<211>19<212>dna<213>elizabethkingiameningoseptica<400>4ttcggatcattctcaaaag19<210>5<211>23<212>dna<213>elizabethkingiameningoseptica<400>5agcaaatctgatagataaacatg23<210>6<211>20<212>dna<213>elizabethkingiameningoseptica<400>6ggggttaagcaaaaagttta20<210>7<211>24<212>dna<213>elizabethkingiameningoseptica<400>7ctttcgactaattcttattcctga24<210>8<211>21<212>dna<213>elizabethkingiameningoseptica<400>8ttggcattgaatgactgaaac21<210>9<211>20<212>dna<213>elizabethkingiameningoseptica<400>9atgctgtgattcatttactt20<210>10<211>20<212>dna<213>elizabethkingiameningoseptica<400>10ctgaagaggaaaaattttct20<210>11<211>17<212>dna<213>elizabethkingiameningoseptica<400>11agcctcatgctaaacgt17<210>12<211>444<212>dna<213>elizabethkingiameningoseptica<400>12aattaaataggaagtattggatcagtctcatttcttggaggggaattaataatctatagc60aaatctgatagataaacatgagttctttcgactaattcttattcctgagggagtattcct120ccggaatacgtatgctgtgattcatttacttttacacagatctggctcctccggagcctc180atgctaaacgttctgatttttaatccgaagaagctcctaacggaactttatctctttagg240attataatgatgagtattcacagcgttccgtaggaacattatcttatatggaagattaac300aaatccaatgtttcagtcattcaatgccaaaattaaaaaacttcagattacaattgagag360gagtaacagatagaaaatttttcctcttcagattagctaaactttttgcttaacccccaa420cttttgagaatgatccgaaatatt444当前第1页12