高渗透压甘油蛋白激酶基因RKHog1的新用途的制作方法

本发明属于生物技术领域和遗传工程领域，涉及一种高渗透压甘油蛋白激酶基因rkhog1的新用途。

背景技术：

多不饱和脂肪酸（polyunsaturatedfattyacids，pufas）是指含有两个或更多个不饱和双键结构的脂肪酸，又称多烯脂肪酸。根据第一个不饱和键位置不同，pufas可分为ω-3、ω-6、ω-7、ω-9等系列（即ω编号系统，也叫n编号系统）。ω-3系列和ω-6系列中许多脂肪酸都是人体不可缺少的脂肪酸，比如亚油酸(la)、α-亚麻酸(ala)、二十二碳六烯酸（dha）、γ-亚麻酸（gla）和花生四烯酸（aa）等。la、ala、dha和aa人体内不能合成，需要从食物中摄取，称为人类的必需脂肪酸（efa）。ω-3和ω-6系列pufas具有重要生物学意义并与人类健康密切相关，很多情况下，这两族pufas在功能上相互协调制约，共同调节生物体的生命活动。

多不饱和脂肪酸相对饱和脂肪酸来说具有更多的功效，它可以降低血中胆固醇和甘油三酯，调节心脏功能，降低血液黏稠度，改善血液微循环，提高脑细胞的活性，增强记忆力和思维能力，增强人体防御系统的功能等，此外它还可以排除人体内多余的“垃圾”。因此，其潜在的医用药用价值受到了世界的广泛关注，引起了食品、医药甚至化妆品等行业的高度重视。

长期以来人们都在研究如何从动植物油脂中提取pufas，但因为动植物的生长随着季节、地理位置等的影响而不断发生变化，所以pufas含量和构成也随之而变，况且从动植物中提取pufas的成本高，周期长，不能适应市场的需要。另外动植物油脂资源含油量及不饱和脂肪酸类型、比例均受到一定的限制。因此，近年来人们一直在探索利用pufas的新来源---即利用微生物技术来生产pufas。微生物具有发酵周期短、油脂含量高、培养成本低、不受原料控制、对环境的适应性强、生物转化率高等优点。

高渗透压甘油蛋白激酶基因hog1是hog-mapk途径的核心分子，在信号传导中起重要作用。此前的研究认为hog1主要参与渗透压胁迫的响应，但近年来的研究表明hog1也参了低温胁迫的响应，相关文献报道了在哺乳动物、昆虫、裂殖酵母及酿酒酵母中均发现了hog1或其同源蛋白参与了低温胁迫下的调控。虽然真菌中hog1和低温胁迫的关系已有研究，但具体的作用机制尚未清楚，且在产油真菌中关于hog1与其低温适应性机制和低温下多不饱和脂肪酸的合成机制还未见报道，因此探索hog1与产油真菌低温适应性的关系，可对产油微生物的研究提供一个新的理论依据。为阐明真菌低温适应机制的研究提供参考，而且认识低温条件下pufas合成的调节机制有助于利用相关的合成调节过程为今后大规模生产pufas的研究与应用奠定基础。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种高渗透压甘油蛋白激酶基因rkhog1的新用途，即高渗透压甘油蛋白激酶基因rkhog1在低温下生产多不饱和脂肪酸的应用。

高渗透压甘油蛋白激酶基因rkhog1从红冬孢酵母（rhodosporidiumkratochvilovae）ym25235中分离得到，该基因核苷酸序列如seqidno：1所示或该核苷酸序列的片段，或与seqidno：1互补的核苷酸序列，该基因序列长为1080bp（碱基），该基因编码的氨基酸序列如seqidno：2所示的多肽或其片段。

本发明将高渗透压甘油蛋白激酶基因rkhog1直接与不同表达载体（质粒、病毒或运载体）连接构建重组载体，并在低温下促进红冬孢酵母ym25235生产多不饱和脂肪酸。

具体涉及从红冬孢酵母（rhodosporidiumkratochvilovae）ym25235中克隆的高渗透压甘油蛋白激酶基因rkhog1插入prh2304质粒，构建了重组表达质粒prhrkhog1，将其转入红冬孢酵母ym25235中进行过表达，获得转基因菌株ym25235/prhrkhog1，并对其表达特性进行研究，为阐明rkhog1基因与其低温适应性机制和低温下多不饱和脂肪酸的合成机制奠定基础。

本发明的有益效果：本发明从红冬孢酵母（rhodosporidiumkratochvilovae）ym25235的染色体基因组中分离得到hog途径的核心分子hog1p的基因rkhog1。该基因全长1080bp，此前的研究认为hog1主要参与渗透压胁迫的响应。本研究表明基因rkhog1与不但有抗渗透胁迫的功能，且与红冬孢酵母中pufas的低温合成有关，该基因在低温下能提高红冬孢酵母ym25235中催化油酸转化为亚油酸和亚麻酸的δ^12/15-脂肪酸脱氢酶基因rkd12基因的mrna转录水平的提高，从而引起细胞脂中pufas的合成量显著增加；本研究结果有助于阐明产油酵母-红冬孢酵母ym25235中pufas低温合成的信号传导途径及合成调节机制，为揭示微生物低温适应性的机制提供参考，将有助于通过基因工程手段对其进行改造来提高不饱和脂肪酸la和ala的含量，对pufas的工业化生产提供有良好的应用前景和经济效益，为大规模商业化生产pufas奠定基础。

附图说明

图1为本发明的红冬孢酵母ym25235rkhog1基因pcr扩增图；

图2为重组质粒prhrkhog1的质粒图谱；

图3为重组质粒prhrkhog1限制性酶切分析；其中：1为dna分子量标记dl10000；2为空质粒prh2304的ncoⅰ、ecorⅴ双酶切；3为重组质粒prhrkhog1的ncoⅰ、ecorⅴ双酶切；4为rkhog1基因的pcr产物；

图4为低温条件下rkhog1基因转化的红冬孢酵母ym25235细胞脂肪酸气相色谱分析；a:30℃培养的ym25235/prh230430℃；b:30℃培养的ym25235/prhrkhog1；

图5为低温条件下rkhog1基因转化的红冬孢酵母ym25235细胞脂肪酸气相色谱分析；a:15℃培养的ym25235/prh2304；b:15℃培养的ym25235/prhrkhog1。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。

实施例1：红冬孢酵母（rhodosporidiumkratochvilovae）ym25235rkhog1基因克隆

采用omega试剂盒e.z.n.afungalrnakit提取红冬孢酵母ym25235总rna，反转录试剂盒takarafirststrandcdnasynthesiskit合成cdna。根据红冬孢酵母ym25235的转录组序列设计特异性引物（引物1和引物2）进行pcr扩增；反应所用引物、组份和扩增条件如下：

引物1：rkhog1-f:5’-cgcaagcttatggccgacttcgtgaag-3’（seqidno:3）

引物2：rkhog1-r:5’-taatggatccttactgctgcggcgcg-3’（seqidno:4）

（aagctt为hindⅲ酶切位点，ggatcc为bamhⅰ酶切位点）；

pcr扩增体系如下（50μl）：

pcr扩增条件：95℃预变性5min，再用95℃变性30s，63℃退火15s，72℃延伸1min进行30个循环，最后72℃彻底延伸10min。反应完后取产物2μl，然后在浓度为1%的琼脂糖凝胶中，进行电泳分析，结果如图1所示。经凝胶成像系统成像确认片段大小正确后，用百泰克生物技术有限公司多动能dna纯化回收试剂盒回收目的片段，然后将pcr扩增得到的目的基因连接到pmd-18t上，连接产物转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞中，用含有氨苄青霉素（amp⁺）的lb固体平板进行筛选，挑取平板上的转化子进行菌落pcr筛选阳性克隆，然后送去上海生工测序。测序结果显示，获得一段1080bp长的序列，命名为rkhog1，序列组成如seqidno:1所示的核苷酸序列。

实施例2：rkhog1基因过表达载体prhrkhog1的构建

以反转录的ym25235cdna为模板，用rkhog1-f和rkhog1-r作为引物扩增rkhog1编码序列，获得的rkhog1片段大小约1080bp，将扩增获得的rkhog1片段经ncoⅰ、ecorⅴ两个限制性内切酶进行酶切后，连接到表达载体prh2304上获得重组质粒prhrkhog1（图2）。将获得的重组质粒转入大肠杆菌dh5α中扩增，再经菌落pcr验证后提取重组质粒，并用ncoⅰ、ecorⅴ对prhrkhog1进行双酶切验证。结果表明，重组质粒prhrkhog1经双酶切后产生了1.0kb和10kb左右的两个条带（图3第3泳道），这两个条带分别与rkhog1片段和prh2304载体经双酶切后的片段大小一致，初步表明重组质粒prhrkhog1构建成功；用测序引物进行测序，将酶切验证正确的质粒送出测序进一步进行验证。测序结果表明，测序所获得的序列与目的序列完全一致，没有出现任何碱基突变和缺失等。

实施例3：rkhog1基因与低温合成多不饱和脂肪酸关系的分析

1、重组质粒prhrkhog1转化红冬孢酵母ym25235菌株

采用醋酸锂转化法将重组质粒prhrkhog1转化至红冬孢酵母ym25235菌株，以含潮霉素b（hygromycinb）终浓度为150µg/ml的ypd培养基筛选转化子；提取基因组dnapcr验证转化子。

2、rkhog1基因与红冬孢酵母脂肪酸含量变化的分析

将转基因菌株ym25235/prhrkhog1及对照菌株ym25235/prh2304分别先在30℃培养24h后，一份30℃继续培养24h，另一份立即转移至15℃冷处理培养24h；分别提取冷处理后4株菌的细胞中总脂肪酸，并进行甲酯化。将样品进行气相色谱分析，利用面积归一法计算菌株脂肪酸的含量。4株菌的脂肪酸气相色谱分析图谱如图4、5所示，在图中保留时间约为11min为饱和脂肪酸c18:1oa油酸，保留时间约为12.5min为不饱和脂肪酸c18:2la亚油酸，保留时间约为15min为不饱和脂肪酸c18:3ala亚麻酸。从图4、5，我们可以发现，当转基因菌株ym25235/prhrkhog1和对照菌株ym25235/prh2304在30℃条件下，oa、la及ala的峰面积大小基本一致；而当转基因菌株ym25235/prhrkhog1和对照菌株ym25235/prh2304在15℃培养后，油酸的峰面积大小均呈下降趋势，oa、la及ala的峰面积大小均呈上升趋势，且转基因菌株ym25235/prhrkhog1la及ala的峰面积均大于对照菌株ym25235/prh2304ala的峰面积（图4a:30℃培养的ym25235/prh2304，b:30℃培养的ym25235/prhrkhog1；图5a:15℃培养的ym25235/prh2304，b:15℃培养的ym25235/prhrkhog1）。

根据下表中脂肪酸含量数据，我们可以计算得出，在经15℃培养后，转基因菌株ym25235/prhrkhog1亚油酸的含量为37.76%，相对于同一菌株30℃培养条件下la的含量为17.83%增加了2.06倍、相对于对照菌株同样处理条件下la的含量为28.16%增加了1.30倍。且在15℃培养条件下，转基因菌株ym25235/prhrkhog1ala的含量为21.11%，相对于同一菌株30℃培养条件下ala的含量为5.34%增加了3.95倍、相对于对照菌株同样培养条件下ala的含量为8.87%增加了2.38倍。而15℃培养条件下，oa的含量较30℃培养条件下减少了1.58倍，较同样培养条件下对照菌株减少了1.00倍。这些结果表明，在红冬孢酵母ym25235菌株中过表达rkhog1基因会引起la及ala两种多不饱和脂肪酸含量的增加且饱和脂肪酸oa的含量随之减少；

15℃和30℃条件下rkhog1转基因红冬孢酵母ym25235细胞中脂肪酸含量

。

序列表

<110>昆明理工大学

<120>高渗透压甘油蛋白激酶基因rkhog1的新用途

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