本发明涉及组织工程学生物材料技术领域，具体为一种可体外替代牙龈上皮进行牙科护理产品、医疗器械、牙科材料、化学品、小分子化合物、活性蛋白等产品的安全性与功效性检测及其他与牙龈上皮接触的材料的安全性与功效性评价的牙龈上皮模型及其构建方法。
背景技术：
目前，牙龈上皮在牙科护理产品的安全性及功效性检测，烟草成分致癌能力检测，口腔致病菌致病机理研究等各方面得到越来越多的关注。但目前研究中牙龈上皮来源主要是动物牙龈上皮、患者手术切除牙龈上皮组织。两者都存在一定的应用弊端，动物来源的牙龈上皮组织不能准确的反应人体实验；此外，大量动物用于各项试验的伦理问题受到质疑，国际上已禁止化妆品、化学品等的动物实验。人体来源的牙龈上皮组织主要存在取材困难、来源有限，不能满足牙龈相关产品安全性体外评价数量需求。
因此，体外重建三维人牙龈上皮模型成为安全性及功效性等检测的重要评价工具。目前的牙龈上皮模型开发主要有两种类型：一种是应用材料学和生物工程学原理构建的牙龈上皮替代物，该类模型不利于细胞生长，难以实现细胞功能的检测与评价。另一类是应用细胞复合材料培养的方法，以胶原等材料为支架，构建形成牙龈上皮结构。lauer等人用牙龈上皮，利用3t3细胞为滋养层，在体外培养3~4周可形成完整的包含3~6层细胞的上皮膜片，检测结果发现培养的上皮分化良好，与正常组织类似，但异种滋养层细胞的应用，对检测结果的准确性有一定影响。
从以上的分析中可以看出，虽然现在已有相关的牙龈上皮模型被开发，但这些模型存在一系列的缺陷：一，模型支架常采用外源细胞，在后期应用中存在一定的局限性；二、构建时间长，体外构建一批模型需长达一个月时间，过长的构建时间会增加过程中的不可控因素，影响模型的稳定性；三，培养体系单一不能适应细胞不同阶段的营养需求，导致模型复层化较差，结构不均一完整，屏障功能减弱，严重降低模型的应用。
技术实现要素：
本发明所解决的技术问题在于提供一种牙龈上皮模型及其体外构建方法，是应用细胞生物学和工程学原理，使用人牙龈上皮细胞，经体外扩增后，采用气液面培养法，在不同阶段使用不同培养体系，使其复层化，形成体外牙龈上皮模型，以解决上述背景技术中的缺点。
本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：一种牙龈上皮模型的体外构建方法，包括以下方法步骤：
步骤一、牙龈上皮细胞的原代培养及扩增
将正常人牙龈组织，用含100iu/ml青霉素及100μg/ml链霉素的pbs0.01m在ph=7.4的条件下进行冲洗。修整组织块，去除皮下结缔组织,将组织块剪成约10mm3大小，用含100iu/ml青霉素及100μg/ml链霉素的pbs0.01m在ph=7.4的条件下进行冲洗，使用dispase液在4℃条件下消化16-18h。分离组织上皮层和皮下结缔组织层，将分离得到的上皮层转入预置1.5ml0.25%胰蛋白酶的离心管中，37℃条件下孵育5min，消化获得单细胞悬液。加入角化细胞无血清培养基重新悬浮细胞，转至培养瓶中，12h后换液，以后隔天换液一次。使用p4~p20代细胞，以胰酶消化制成单细胞悬液，调整细胞密度5.0×105个/ml～5.0×106个/ml，接种于培养瓶中，培养液ⅰ培养，轻轻晃动培养瓶，使细胞分散均匀后，置于37℃、5%co2条件下培养；
步骤二、牙龈上皮细胞液下接种培养
使用p4~p20代细胞，以培养液ⅱ制成单细胞悬液，调整细胞密度为5.0×105个/ml～5.0×106个/ml，进行接种，置于37℃、5%co2条件下培养1～5小时；后转入液下培养，培养时间为1～10天，每天换液；
步骤三、牙龈上皮模型气液面的增殖分化培养
将上述小室内的培养液弃掉，更换为培养液ⅲ，进行气液面培养，培养时间为1～10天，每天换液；再更换为培养液ⅳ，继续进行气液面培养，培养时间为1～10天，每天换液；最后更换为培养液ⅴ，继续进行气液面培养，培养时间为1～10天，每天换液，培养结束，牙龈上皮模型的体外构建结束；
本发明中，所述培养液ⅰ，为dmem，其所含葡萄糖含量为1.0～4.5g/l，谷氨酰胺含量为1.0～10.0mm；
本发明中，所述培养液ⅱ，为在培养液ⅰ中，添加人表皮生长因子浓度为0.1～150.0ng/ml，胰岛素浓度为0.1～150.0ng/ml，氢化可的松浓度为0.1～20.0μg/ml，三磷酸腺苷浓度为1.0～150.0μg/ml，转铁蛋白浓度为1.0～150.0ng/ml，孕酮浓度为1.0～100.0nm，对羟基苯甲酸丁酯浓度为0.1～10.0μg/ml，牛脑垂体浸提物浓度为1.0～100.0μg/ml，腺嘌呤10～100μg/ml，硒酸钠1.0～50.0nm；
本发明中，所述培养液ⅲ，为在培养液ⅱ中，添加cacl2浓度为20.0～100.0μg/ml，维生素c浓度为10.0～50.0μg/ml；
本发明中，所述培养液ⅳ，为在培养液ⅱ中，添加cacl2浓度为50.0～150.0μg/ml，维生素c浓度为50.0～100.0μg/ml；
本发明中，所述培养液ⅴ，为在培养液ⅱ中，添加cacl2浓度为150.0～300.0μg/ml，维生素c浓度为1.0～10.0μg/ml。
本发明中，进一步地，该模型应用于牙科护理产品、医疗器械、牙科材料、化学品、小分子化合物、活性蛋白等产品的安全性及功效性检测，烟草成分致癌能力检测，口腔致病菌致病机理研究。
本发明的有益效果：
一，人源牙龈上皮细胞的使用，使模型结构及功能更接近正常人体牙龈上皮组织，能更加真实的反应检测指标；
二、体外构建重复性佳，可实现产业化制备；
三、气液面分段培养法，保证了细胞在不同阶段的不同营养需求，缩短了构建时间、降低生产成本；
四、培养基中因子的添加，保证了模型的正常复层化，从而形成了和人体牙龈上皮高度类似的连接结构，并正常表达了牙龈上皮相关蛋白，这种自身结构和细胞外微环境的影响可进一步提升模型的屏障功能，最终构建的体外牙龈上皮模型与人牙龈上皮组织具有高度相似的结构及功能。
附图说明
图1为为牙龈上皮模型构建结束后进行组织学切片h&e染色照片。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
实施例1：本实施例着重介绍一种牙龈上皮模型的体外构建方法步骤：
步骤一、人牙龈上皮细胞的原代培养及扩增：
将正常人牙龈组织，用含100iu/ml青霉素及100μg/ml链霉素的0.01mpbs在ph=7.4的条件下进行冲洗。修整组织块，去除皮下结缔组织,将组织块剪成约10mm3大小，用含100iu/ml青霉素及100μg/ml链霉素的0.01mpbs在ph=7.4的条件下进行冲洗，使用dispase液在4℃条件下消化16h。分离组织上皮层和皮下结缔组织层，将分离得到的上皮层转入预置1.5ml0.25%胰蛋白酶的离心管中，37℃条件下孵育5min，消化获得单细胞悬液。加入角化细胞无血清培养基重新悬浮细胞，转至培养瓶中，12h后换液，以后隔天换液一次。
使用p8代细胞，以胰酶消化制成单细胞悬液，调整细胞密度5.0×105个/ml，接种于培养瓶中，培养液ⅰ培养，轻轻晃动培养瓶，使细胞分散均匀后，置于37℃、5%co2条件下培养；
所述培养液ⅰ，为dmem，其所含葡萄糖含量为1.0g/l，谷氨酰胺含量为1.0mm；
步骤二、牙龈上皮细胞液下接种培养
取p8代细胞，以培养液ⅱ制成单细胞悬液，调整细胞密度为5.0×105个/ml，进行接种，接种量为0.1ml，置于37℃、5%co2条件下培养1小时；后转入液下培养，培养时间为2天，每天换液；
所述培养液ⅱ，为在培养液ⅰ中添加人表皮生长因子0.1ng/ml，胰岛素0.1ng/ml，氢化可的松0.1μg/ml，三磷酸腺苷10.0μg/ml，转铁蛋白10.0ng/ml，孕酮1.0nm，对羟基苯甲酸丁酯0.2μg/ml，牛脑垂体浸提物10.0μg/ml，腺嘌呤10.0μg/ml，硒酸钠2.0nm；
步骤三、牙龈上皮模型气液面的增殖分化培养
将上述小室内的培养液弃掉，更换为培养液ⅲ，进行气液面培养，培养时间为9天，每天换液；再更换为培养液ⅳ，继续进行气液面培养，培养时间为9天，每天换液；最后更换为培养液ⅴ，继续进行气液面培养，培养时间为9天，每天换液，培养结束，牙龈上皮模型的体外构建结束；
所述培养液ⅲ，为在培养液ⅱ中添加cacl230.0μg/ml，维生素c10.0μg/ml；
所述培养液ⅳ，为在培养液ⅱ中添加cacl2100.0μg/ml，维生素c50.0μg/ml；
所述培养液ⅴ，为在培养液ⅱ中添加cacl25.0μg/ml，维生素c100.0μg/ml。
实施例2：
本实施例着重介绍一种牙龈上皮模型的体外构建方法步骤：
步骤一、人牙龈上皮细胞的原代培养及扩增：
将正常人牙龈组织，用含100iu/ml青霉素及100μg/ml链霉素的pbs0.01m在ph=7.4的环境下冲洗。修整组织块，去除皮下结缔组织,将组织块剪成约10mm3大小，用含100iu/ml青霉素及100μg/ml链霉素的pbs0.01m在ph=7.4的环境下冲洗，使用dispase液在4℃条件下消化16h。分离组织上皮层和皮下结缔组织层，将分离得到的上皮层转入预置1.5ml0.25%胰蛋白酶的离心管中，37℃条件下孵育5min，消化获得单细胞悬液。加入角化细胞无血清培养基重新悬浮细胞，转至培养瓶中，12h后换液，以后隔天换液一次。
使用p8代细胞，以胰酶消化制成单细胞悬液，调整细胞密度5.0×105个/ml，接种于培养瓶中，培养液ⅰ培养，轻轻晃动培养瓶，使细胞分散均匀后，置于37℃、5%co2条件下培养；
所述培养液ⅰ，为dmem，其所含葡萄糖含量为1.0g/l，谷氨酰胺含量为1.0mm；
步骤二、牙龈上皮细胞液下接种培养
取p8代细胞，以培养液ⅱ制成单细胞悬液，调整细胞密度为5.0×105个/ml，进行接种，接种量为0.1ml，置于37℃、5%co2条件下培养1小时；后转入液下培养，培养时间为2天，每天换液；
所述培养液ⅱ，为在培养液ⅰ的基础上，添加人表皮生长因子50.0ng/ml，胰岛素50.0ng/ml，氢化可的松8.0μg/ml，三磷酸腺苷100.0μg/ml，转铁蛋白100.0ng/ml，孕酮75.0nm，对羟基苯甲酸丁酯8.0μg/ml，丁二胺75.0μm，牛脑垂体浸提物75.0μg/ml，腺嘌呤50.0μg/ml，硒酸钠20.0nm;
步骤三、牙龈上皮模型气液面的增殖分化培养
将上述小室内的培养液弃掉，更换为培养液ⅲ，进行气液面培养，培养时间为3天，每天换液；再更换为培养液ⅳ，继续进行气液面培养，培养时间为3天，每天换液；最后更换为培养液ⅴ，继续进行气液面培养，培养时间为3天，每天换液，培养结束，牙龈上皮模型的体外构建结束；
所述培养液ⅲ，为在培养液ⅱ中添加cacl230.0μg/ml，维生素c10.0μg/ml；
所述培养液ⅳ，为在培养液ⅱ中添加cacl2100.0g/ml，维生素c50.0μg/ml；
所述培养液ⅴ，为在培养液ⅱ中添加cacl25.0μg/ml，维生素c100.0μg/ml。
实施例3：
本实施例着重介绍一种牙龈上皮模型的体外构建方法步骤：
步骤一、人牙龈上皮细胞的原代培养及扩增：
将正常人牙龈组织，用含100iu/ml青霉素及100μg/ml链霉素的pbs0.01m在ph=7.4的环境下冲洗。修整组织块，去除皮下结缔组织,将组织块剪成约10mm3大小，用含100iu/ml青霉素及100μg/ml链霉素的pbs0.01m在ph=7.4的环境下冲洗，使用dispase液在4℃条件下消化16h。分离组织上皮层和皮下结缔组织层，将分离得到的上皮层转入预置1.5ml0.25%胰蛋白酶的离心管中，37℃条件下孵育5min，消化获得单细胞悬液。加入角化细胞无血清培养基重新悬浮细胞，转至培养瓶中，12h后换液，以后隔天换液一次。
使用p16代细胞，以胰酶消化制成单细胞悬液，调整细胞密度5.0×105个/ml，接种于培养瓶中，培养液ⅰ培养，轻轻晃动培养瓶，使细胞分散均匀后，置于37℃、5%co2条件下培养；
所述培养液ⅰ，为dmem，其所含葡萄糖含量为1.0g/l，谷氨酰胺含量为1.0mm；
步骤二、牙龈上皮细胞液下接种培养
取p16代细胞，以培养液ⅱ制成单细胞悬液，调整细胞密度为5.0×105个/ml，进行接种，接种量为0.1ml，置于37℃、5%co2条件下培养1小时；后转入液下培养，培养时间为2天，每天换液；
所述培养液ⅱ，为在培养液ⅰ的基础上，添加人表皮生长因子50.0ng/ml，胰岛素50.0ng/ml，氢化可的松8.0μg/ml，三磷酸腺苷100.0μg/ml，转铁蛋白100.0ng/ml，孕酮75.0nm，对羟基苯甲酸丁酯8.0μg/ml，丁二胺75.0μm，牛脑垂体浸提物75.0μg/ml，腺嘌呤100.0μg/ml，硒酸钠50.0nm;
步骤三、牙龈上皮模型气液面的增殖分化培养
将上述小室内的培养液弃掉，更换为培养液ⅲ，进行气液面培养，培养时间为3天，每天换液；再更换为培养液ⅳ，继续进行气液面培养，培养时间为3天，每天换液；最后更换为培养液ⅴ，继续进行气液面培养，培养时间为3天，每天换液，培养结束，牙龈上皮模型的体外构建结束；
所述培养液ⅲ，为在培养液ⅱ中添加cacl230.0μg/ml，维生素c10.0μg/ml；
所述培养液ⅳ，为在培养液ⅱ中添加cacl2100.0μg/ml，维生素c50.0μg/ml；
所述培养液ⅴ，为在培养液ⅱ中添加cacl210.0μg/ml，维生素c100.0μg/ml。
具体的说，上述步骤中采用正常人牙龈上皮细胞，相比传统的种子细胞来源，人源牙龈上皮细胞的使用，使模型结构及功能更接近正常人体牙龈上皮组织，能更加真实的反应检测指标，成为体外测试的核心工具而得到广泛的应用。
上述步骤中采用的培养液ⅱ，在传统培养液的基础上，添加了各种因子，其中人表皮生长因子能够刺激细胞生长迁移，抑制衰老基因的出现，延缓上皮细胞衰老；胰岛素可刺激细胞对尿苷和葡萄糖的吸收以合成rna、蛋白质和脂质，胰岛素还能与细胞膜上的胰岛素受体结合而调控细胞内的多种代谢途径，增加脂肪酸和葡萄糖的合成，对细胞生长起重要作用；氢化可的松可能兼有促细胞贴附和增殖作用，细胞密度高时可诱导细胞发生分化。针对传统培养所使用的单一培养基只能够提供氨基酸、维生素、无机盐、有机化合物、微量元素的缺陷，这些因子的添加，保证了细胞的营养需求，促进了细胞的生长。
上述步骤中采用气液面分段培养的方法，在不同阶段使用不同培养体系，使其复层化，形成体外牙龈上皮模型,如图1所示。该方法中气液面培养分为三个阶段，使用的培养液分别为培养液ⅲ、ⅳ、ⅴ，与培养液ⅱ的区别在于，在培养液ⅱ中添加了cacl2及维生素c，且在各培养阶段cacl2及维生素c的浓度不同。cacl2在不同浓度下可对牙龈上皮细胞的增殖、分化产生不同影响；维生素c可刺激鞘磷脂的生成和板层小体内容成熟，如增加糖基化神经酰胺的合成，促进上皮细胞分化，有利于角质层的形成，进而提高上皮屏障功能。在培养液ⅲ阶段，cacl2及维生素c的浓度较低，此时上皮细胞形成的细胞间连接较少，细胞处于迅速扩增状态，而人表皮生长因子、胰岛素、氢化可的松等因子也促进了细胞的增殖，该条件保证了细胞增殖所需的因子浓度，并使上皮细胞开始复层化。在培养液ⅳ阶段，cacl2及维生素c的浓度升高，在该条件下，cacl2及维生素c诱导上皮细胞发生多种变化，包括诱导细胞复层化、形成角质层、桥粒、半桥粒和黏着连接，并正常表达角蛋白、丝聚合蛋白、兜甲蛋白等牙龈上皮相关蛋白，ca2+是细胞分化过程的重要条件，尤其是复层及桥粒、半桥粒的形成和聚集；此时人表皮生长因子、胰岛素、氢化可的松等因子也保证了细胞的正常增殖，同时在细胞密度增加的情况下，氢化可的松也发挥了诱导细胞分化的作用。不同阶段各因子的添加，保证了模型完整复层化。
综上所述，与传统的单一培养基、单一培养方式的构建方法相比：第一，该方法不同阶段添加的因子种类及含量均不同，保证了细胞在复层化过程中不同阶段的不同营养需求，使模型培养时间极大缩短。第二，气液面分段培养及因子的添加，也保证了模型的正常复层化，从而形成了和人体牙龈上皮高度类似的连接结构：首先可以使基底层形成和正常牙龈上皮生理结构高度相似的半桥粒结构，使模型与滤膜结合紧密；其次，模型的正常复层还可以形成细胞与细胞间较好的桥粒结构，保证细胞间紧密连接；桥粒和半桥粒使组织具有较强抗张、抗压能力，结构更加均一完整，最终使模型屏障功能增强；第三，正常的复层化可保证牙龈上皮相关蛋白的正常表达，例如角蛋白、丝聚合蛋白、兜甲蛋白等，这些蛋白的正常表达对牙龈上皮的结构稳态具有重要作用，这种细胞外的微环境影响可进一步提升模型的屏障功能。最终构建的体外牙龈上皮模型与人牙龈上皮组织具有高度相似的结构及功能，弥补了传统模型构建方法的缺陷，在缩短构建时间、降低成本的同时，保证了模型的安全性与功效性。
使用本发明构建的牙龈上皮模型、人牙龈上皮组织、鼠牙龈上皮组织对《全球化学品统一分类和标签制度》中部分化学品进行检测，结果显示，使用本发明提供的方法制备的牙龈上皮模型能够准确判定该化学品是否具有刺激性，其结果与使用人牙龈上皮组织的判定结果一致，而使用鼠牙龈上皮组织的判定出现假阳性及假阴性结果，因此，牙龈上皮模型能够客观真实的反映检测结果，能够很好的替代动物模型，成为体外测试的核心工具。
使用本发明提供的方法制备的牙龈上皮模型，能够满足目前市场对体外检测的需求，极大的扩充了市场应用方向，其应用主要包括：一，口腔护理产品如牙膏、漱口水、口腔喷雾等配方及牙科材料的刺激性、毒性检测，以及配方中功效成分的功效性检测。二，医疗器械、牙科材料、小分子化合物、活性蛋白、化学品等产品的安全性及功效性检测。三，烟草成分刺激性、致癌性的检测，研究吸烟对人牙龈牙周疾病的影响。五，口腔致病菌致病机理研究等。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。