一种重组短短芽孢杆菌的构建方法与流程

本发明涉及一种重组短短芽孢杆菌的构建方法。

背景技术

短短芽孢杆菌是一种安全、无毒性的益生菌，同时具有蛋白分泌能力强和胞外蛋白酶活性低的特点，因此特别适合做为胞外分泌蛋白表达系统。

集落刺激因子（csf）是一组在体内外均能刺激骨髓造血干细胞分化成细胞集落的低分子细胞因子。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子可刺激前粒细胞单核细胞分化生成粒细胞和单核细胞。集落刺激因子是机体最重要的细胞因子之一，在免疫细胞分化过程中发挥重要作用，可做为免疫增强佐剂以增强疫苗的免疫原性，本发明合成了猪粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因，并与质粒pny326构建了重组质粒，成功电转化短短芽孢杆菌sp3，获得了表达猪粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的重组短短芽孢杆菌，重组猪粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的高效表达为其做为猪用疫苗免疫增强剂的广泛使用奠定了基础。

技术实现要素：

本发明其目的就在于提供一种重组短短芽孢杆菌的构建方法，具有快速、简便的获得猪粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的特点。

为实现上述目的而采取的技术方案是，一种重组短短芽孢杆菌的构建方法，包括以下步骤：

（1）合成猪粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（porcinegm-csf）基因与短短芽孢杆菌（pny326）质粒；

（2）用bamhi和ecori分别对porcinegm-csf基因和pny326质粒进行双酶切，于37℃温箱反应3h；

（3）使用1.2%琼脂糖凝胶电泳回收porcinegm-csf基因和pny326质粒的酶切产物，并将回收的双酶切产物进行4℃过夜连接反应；

（4）将连接反应产物直接电转化短短芽孢杆菌sp3，电转完成后进行30℃摇床80rpm缓慢复苏1h；

（5）将复苏好的转化产物用新霉素抗性筛选转化子，获得重组短短芽孢杆菌。

有益效果

与现有技术相比本发明具有以下优点。

本发明可快速、简便的获得猪粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。

附图说明

以下结合附图对本发明作进一步详述。

图1为本发明中porcinegm-csf-pny326重组质粒的pcr鉴定图；

图2为本发明中短短芽孢杆菌为sp3表达porcinegm-csf纯化蛋白的westernblot图；

图3为本发明中pny326质粒图谱；

图4为本发明中pny326质粒的多克隆位点图谱。

具体实施方式

一种重组短短芽孢杆菌的构建方法，如图1-4所示，包括以下步骤：

（1）合成猪粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（porcinegm-csf）基因与短短芽孢杆菌（pny326）质粒；

（2）用bamhi和ecori分别对porcinegm-csf基因和pny326质粒进行双酶切，于37℃温箱反应3h；

（3）使用1.2%琼脂糖凝胶电泳回收porcinegm-csf基因和pny326质粒的酶切产物，并将回收的双酶切产物进行4℃过夜连接反应；

（4）将连接反应产物直接电转化短短芽孢杆菌sp3，电转完成后进行30℃摇床80rpm缓慢复苏1h；

（5）将复苏好的转化产物用新霉素抗性筛选转化子，获得重组短短芽孢杆菌。

实施例

1、猪粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因（np_999283）中，除去上游信号肽序列后的成熟肽见序列表中序列1，共127个氨基酸，根据短短芽孢杆菌密码子偏好性进行优化，上游添加6个组氨酸的核苷酸序列，下游添加终止密码子，并在两端分别添加bamhi和ecori两酶切位点及保护性碱基，人工合成该序列，见序列表中序列2：

序列1

aptrppspvtrpwqhvdaikealsllnnsndtaavmnetvdvvcemfdpqeptcvqtrlnlykqglrgsltrlkspltllakhyeqhcplteetscetqsitfksfkdslnkflftipfdcwgpvkk

序列2

cgggatcccatcatcatcatcatcatgcaccaacgcgcccaccaagcccggtgacgcgtccatggcagcacgtcgatgcgattaaagaagcgctgagcctgctgaacaacagcaacgatacggcggcggtcatgaacgaaacggtggatgtggtgtgcgagatgttcgacccgcaagaaccgacgtgcgtgcaaacgcgcctgaacctgtataaacagggcctgcgcggcagcctgacgcgcctgaaaagcccgctgacgctgctggcgaaacattatgaacagcactgcccgctgacggaggagacgagctgcgagacgcagagcatcacgtttaaaagctttaaagatagcctgaacaagtttctgttcacgattccgttcgactgctggggcccggtgaaaaaataagaattcgc

2、用bamhi和ecori分别对porcinegm-csf基因和pny326质粒双酶切，双酶切反应体系为：bamhi2ul，ecori2ul，porcinegm-csf基因/pny326质粒20ul，ddh2o12ul，10×mbuffer4ul，共40ul，于37℃温箱反应3h后；

3、使用1.2%琼脂糖凝胶电泳回收porcinegm-csf基因和pny326质粒的酶切产物，将回收的酶切产物进行连接反应，连接体系为：基因8ul，质粒8ul，t4dna连接酶2ul，10×buffer2ul，总体积为20ul，4℃过夜连接；

4、将连接porcinegm-csf基因和pny326质粒连接产物直接电转短短芽孢杆菌sp3，其步骤为：90ul短短芽孢杆菌sp3感受态细胞中加入10ul连接产物，轻轻混匀；将连接产物和感受态混合物缓慢加入2mm电转杯底部，冰浴10min；设置参数电压2000v、电容50uf、电阻200ω，电转完成后后转移至1.5mlep管中，30℃摇床80rpm缓慢复苏1h；

5、复苏好的转化产物通过涂布新霉素（30ug/ml）平板筛选，37℃培养15-18h。单菌落在新霉素（30ug/ml）抗性液体培养基中扩大培养，菌涂提质粒前加适量溶菌酶以破坏短短芽孢杆菌细胞壁，提取质粒做为pcr扩增模板，通过扩增porcinegm-csf序列并测序来鉴定重组短短芽孢杆菌。pcr扩增引物为：

porcinegm-csf-f：ggatcccatcatcatcatcat

porcinegm-csf-r：gaattcttattttttcaccggg

pcr体系为：porcinegm-csf-f5ul，porcinegm-csf-r5ul，dntp5ul，10×buffer5ul，transt-taq酶1ul，转化子菌液1ul，ddh2o28ul，总体积50ul

pcr扩增程序为：预变性，95℃，5min；变性，95℃，30sec；退火，55℃，30sec；延伸，72℃，1min；总延伸，72℃，5min。

其中，变性，退火，延伸，30cycle。

pcr扩增完成后，pcr原液进行琼脂糖凝胶电泳，于414bp处有清晰条带，pcr原液同时测序，测序结果与合成基因一致。

重组短短芽孢杆菌sp3的表达

平板上挑取重组短短芽孢杆菌单菌落接种于含新霉素30ug/ml的3mlt2液体培养基（葡萄糖1.0%，蛋白胨1.0%，牛肉膏0.5%，酵母提取物0.2%），30℃120rpm摇床培养48-64h，表达的porcinegm-csf被分泌至培养基上清。

重组porcinegm-csf蛋白的纯化及验证

1、饱和硫酸铵沉淀培养基上清中的蛋白

培养完成的菌液最大转速离心30min，弃菌体沉淀，将等体积的饱和硫酸铵溶液（4.1mol/l，25℃）边搅拌边慢慢加入，加完放磁力搅拌器上4℃搅拌过夜，使蛋白充分沉淀。10000rpm4℃离心30min，弃上清保留沉淀，将沉淀溶于少量（10-20ml）pbs-0.2g/l叠氮钠中，使沉淀溶解，再使用透析袋4℃透析48h，每隔6小时更换透析缓冲液，以彻底去除硫酸铵。

2、porcinegm-csf蛋白镍柱纯化

相关试剂如下：母液1：29.22g氯化钠，2.42gtris-base，ddh2o定溶至1l，调节ph=8.0母液2：6.06gtris-base，ddh2o定溶至1l，调节ph=8.0

bindingbuffer：0.1702g咪唑，溶于500ml母液1。

elutionbuffer：17.02g咪唑，溶于500ml母液1。

washingbuffer:2.3828g咪唑，溶于500ml母液2。

先用bindingbuffer平衡镍离子亲和层析柱，然后将待纯化的样品上样于镍柱，结合30min左右，收集留出液flowthrough，用washingbuffer洗3个柱体积，收集washthrongh，最后用elutionbuffer洗脱蛋白，收集eluent.将bindingbuffer，washthrongh，eluent。将镍柱收集的蛋白用milipore压力超滤浓缩装置通过30kda超滤膜截留浓缩至10ml左右，将样品通过gelfiltrationbuffer平衡过的superdex200分子筛进行分离。

3、porcinegm-csf蛋白的westernblot验证

将纯化的蛋白中添加sds-pageloadingbuffer，沸水浴15min，进行westernblot，步骤如下：

3.1清洗bio-rad玻璃板，干燥后安装，按上配方配制分离胶，1mm胶板中加入2ml分离胶液体，至梳齿下1.5cm，覆盖少量ddh2o，待凝固后倒掉覆盖的ddh2o，用滤纸吸净残留的ddh2o；

3.2同样的方法按上配方配制浓缩胶，灌制于分离胶之上，立即插入1mm胶梳，室温下凝固；

3.3待浓缩胶制备完成，拔下胶梳，立即将胶板固定于电泳装置上，电泳槽内加入电泳缓冲液，排尽凝胶底部玻璃板间的气泡；

3.4每孔加样20μl,接通电源，设定电压80v/cm，待染料进入浓缩胶后，调节电压至120v/cm，至溴酚兰染料距胶底部2cm处停止电泳；

3.5拆下凝胶放于转膜缓冲液中待用，同时将滤纸，nc膜，纤维垫放入转膜缓冲液中。

3.6按正极-纤维垫-滤纸-nc膜-凝胶-滤纸-纤维垫的顺序安装膜转移装置，赶走气泡，注意两层滤纸的面积要小于凝胶和nc膜，100v电泳4h；

3.7转膜完成后卸下转膜装置，用tbst洗涤液清洗膜3次，每次5min；

3.8将膜放在封闭液中，4℃封闭过夜，弃去封闭液，用洗涤液清洗3次，每次5min；

3.9使用tbst1:5000稀释his-tag单抗，室温摇床孵育2h，洗涤液洗涤3次，每次5min；孵育羊抗鼠lgg-hrp二抗30min，tbst洗涤5次，每次5min；使用hrp-dab底物显色试剂盒进行显色，结果见图2。

重组porcinegm-csf蛋白活性测定

用mtt（氮兰四唑盐）比色法测定重组蛋白的活性，具体步骤为：在96也细胞培养析中接50ul细胞浓度为3×104的nfs-60细胞，将gm-csf标准品（购自boechringer公司）和重组重组porcinegm-csf分别稀释，各50ul加入96孔板中，阴性对照为不含gm-csf，空白对照为只含培养液，37℃，5%co2培养48h，加mtt溶解液100ul/孔，次日测定各孔a570/630值。mtt结晶溶解液为10%sds-0.01mhcl。

mtt比色法测定纯化的重组porcinegm-csf蛋白活性为1.5×107u/mg。