一种耐铝毒基因、突变体及其制备方法与应用与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种耐铝毒基因、突变体及其制备方法与应用。

背景技术：

铝是地壳土壤中含量第三大的元素，约占地壳总量的百分之七。大多数的铝是以不可溶的硅酸盐或氧化物形态存在的，这种形态的铝对植物并没有毒害，但当土壤溶液酸化后ph值下降到一定程度时，三价铝离子(al³⁺)就会从硅酸盐或氧化物中释放出来，溶解到土壤溶液中。可溶性的铝可分为自由铝或是al(h2o)6³⁺、聚合铝al13及低分子量铝化合物。随着土壤ph值的上升，al(h2o)6³⁺转变为al(oh)²⁺、al(oh)²⁺；在中性土壤中，主要以难溶的al(oh)3形式存在；在碱性条件下主要是以铝酸盐阴离子al(oh)^4－形式存在。不同形态的铝对植物的毒性有明显的差异，目前一般认为在ph值低于4.5的酸性土壤中，铝主要是以al(h2o)6³⁺形态存在的，即通常所说的三价铝离子(al³⁺)，这一形态的铝被认为是对植物毒性最强的形态。微摩尔水平的铝离子即可对植物产生毒害，而酸性土壤溶液中al³⁺的浓度约为10～100μmol/l，可严重毒害植物根系的生长，进而影响作物的生长发育，最终导致作物减产，因此，铝毒被认为是仅次于干旱胁迫的第二大非生物逆境。酸性土壤占世界可耕种土壤的30％，主要分布在南非、中亚和东南亚等对粮食需求量最大的发展中国家。我国的酸性土壤主要分布在长江以南的热带、亚热带及云贵川等地区，大部分土壤的ph值小于5.5，其中很大一部分小于5.0。近年来，随着工业的发展和农业化肥的大量使用，以及酸雨的日趋增加，土壤的酸化程度随之加重，土壤中铝离子的溶量也大幅增加，特别是在我国大面积的酸性土壤中，铝离子的溶出量更大，结果导致了植物铝毒害的加剧。铝对根的毒害作用部位是根尖，包括根冠与根分生区，因此植物发生铝毒害的最主要症状是其根生长受阻，这可能是铝通过一种未知的信号传导途径间接抑制根的生长。此外，铝离子交换量占土壤中阳离子交换总量的20％～80％，容易导致土壤阳离子流失，如造成磷、钾、钙、镁、硼、钼等营养元素的缺乏。铝也可以和磷酸基、羟基等极性基团结合，因此它可以与细胞质及膜蛋白结合，影响膜的结构和功能。同时铝可以和atp形成al-atp复合物，使植物细胞能量代谢过程受到限制。

为了应对酸性土壤的铝毒害，植物进化了包括分泌有机酸、修饰细胞壁、隔离铝到液泡中等一系列耐铝毒机制。而在实际生产生活中，通常靠施加生石灰以缓解酸性土壤中的铝毒问题，然而这种方法只能改良表层土壤，并不能改变深层土壤的ph值，难以彻底解决土壤酸度问题，并且耗费大量的经济和人力，同时还存在着潜在的环境问题。因此，挖掘植物自身的抗铝毒潜力，利用基因工程手段在植物中发掘新的耐铝毒突变体或是过量表达抗铝毒基因、筛选和培育耐铝作物品种，是解决酸性土壤中铝毒害和使农业生产可持续发展的有效策略。

技术实现要素：

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了以下技术方案，以提高植物在酸性土壤中耐铝毒的能力。

本发明一方面提供了一种耐铝毒的基因，其核苷酸序列如seqidno：1所示。

本发明还提供了由上述基因编码的蛋白，该蛋白的氨基酸序列如seqidno：2所示。

本发明还提供了一种重组表达载体，该重组表达载体含有如seqidno：1所示的核苷酸序列。

本发明在另一方面提供了一种耐铝毒的突变体，该突变体具有核苷酸序列如seqidno：1所示的基因。

本发明还提供了上述突变体的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、制备突变体库；

步骤2、将突变体库中的每个单株取数颗发芽；

步骤3、在铝溶液中处理，观察根生长抑制情况，挑选出候选的植株繁种；

步骤4、候选突变体种子收获后，通过测量比较铝溶液处理前后的相对根伸长情况，挑选出耐铝毒突变体。

优选地，上述步骤1中，制备突变体库的具体方法为：取kasalath野生型种子，清水浸泡8h后用1％甲基磺酸乙酯溶液浸泡8h，期间搅拌，洗净后将种子播种，单株收获m1代种子。

优选地，上述步骤3中，在20μm铝溶液中处理3天。

本发明在又一方面提供了一种培育耐铝毒植物的方法，该方法包括将如seqidno：1所示的核苷酸序列导入目的植物。

优选地，导入上述核苷酸序列的方法包括杂交法。

更为优选地，上述杂交法的具体步骤包括：将ral1突变体与华梗籼74野生型杂交，获得f1，将f1播种获得f2群体，在f2群体中，分别单株检测每一株的基因型和耐铝毒能力。

本发明还提供了另一种培育耐铝毒植物的方法，该方法包括在目的植物中敲除ral1基因。

优选地，敲除ral1基因的方法包括crispr-cas9基因编辑方法。

优选地，crispr-cas9基因编辑方法包括以下步骤：

步骤1、在ral1基因的第一个外显子上设计靶点；

步骤2、采用goldengate连接方法，导入grna表达盒；

步骤3、将测序正确的质粒转化农杆菌；

步骤4、将培养后的农杆菌用感菌液制成菌浮液；

步骤5、用菌浮液侵染目的植物的愈伤组织，并置于共培养培养基上进行暗培养；

步骤6、在选择培养基上对上述愈伤组织进行筛选，并在分化培养基上培养至分化成苗。

更为优选地，步骤1中，靶点的上游引物为seqidno：3，下游引物为seqidno：4。

更为优选地，步骤4中，用含200μm乙酰丁香酮(as)的aam感菌液制备菌浮液。

更为优选地，步骤5中,侵染时间为5-10min。

更为优选地，步骤5中,暗培养在25℃下进行2.5天。

更为优选地，步骤6中,选择培养基含头孢拉定和潮霉素，并进行3轮筛选。

优选地，在上述方法中，目的植物为单子叶植物。

更为优选地，上述目的植物为水稻。

更为优选地，上述目的植物为粳稻和/或籼稻。

本发明还提供了上述耐铝毒的基因在提高植物耐铝毒能力中的应用。

优选地，上述植物为水稻。

本发明还提供了上述耐铝毒的突变体在提高植物耐铝毒能力中的应用。

优选地，上述植物为水稻。

本发明利用基因工程手段挖掘植物自身的抗铝毒潜力，为解决酸性土壤中铝毒害和使农业生产可持续发展提供了有效策略。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。所以凡是不脱离本发明所公开的原理下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。

附图说明

图1示出了本发明较优实施例中不同铝浓度下野生型(kasalath)，突变体(ral1)，以及两个耐铝毒水稻品种npb(nipponbare)和koshi(koshihikari)对铝毒的反应；

图2示出了本发明较优实施例中野生型(wt)和突变体(ral1)在中性土壤和酸性土壤中的根生长情况，图2a以根的照片示出了定性结果，图2b示出了根生长的定量结果；

图3示出了本发明较优实施例中野生型(wt)和突变体(ral1)在20μm铝处理24h后铬花青r(er)的染色情况；

图4示出了本发明较优实施例中野生型(wt)和突变体(ral1)在20μm铝处理6h后根尖和基部总铝含量；

图5示出了本发明较优实施例中野生型(wt)(图5a)和突变体(ral1)(图5b)在20μm铝处理6h后细胞壁和细胞液中的铝含量；

图6示出了本发明较优实施例中野生型(wt)和突变体(ral1)根尖0-1cm和1-2cm中果胶(pectin)，半纤维素1(hc1)和半纤维素2(hc2)的含量；

图7示出了本发明较优实施例中回交群体中耐铝毒和野生型的群体分布；

图8示出了本发明较优实施例中ral1突变基因的初步定位；

图9示出了本发明较优实施例中野生型(wt)，突变体(ral1)和两个独立回补株系(c1,c2)的相对根伸长；

图10示出了本发明较优实施例中goldengate连接方法的路线图；

图11示出了本发明较优实施例中构建crispr-cas9敲除载体的测序结果；

图12示出了本发明较优实施例中获得的敲除突变体crispr-cas9植株测序结果；

图13示出了本发明较优实施例中不同铝浓度下野生型，突变体(ral1)，以及敲除突变体crispr-cas9植株对铝毒的反应；

图14示出了本发明较优实施例中含有纯合突变ral1基因的f2单株和含有野生型ral1基因的单株对铝毒的反应。

具体实施方式

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

实施例1

耐铝毒突变体的制备

在本实施例中，以模式作物水稻为研究对象，根据以下方法制备耐铝毒突变体。

取约1万粒kasalath野生型种子，清水浸泡8h，然后用1％甲基磺酸乙酯溶液浸泡8h，期间多次搅拌，洗净后将种子播种，单株收获m1代种子，即获得突变体库。

突变体库中每个单株取16颗发芽，在20μm铝溶液中处理3天，观察根生长抑制情况，挑选出候选的植株繁种；候选突变体种子收获后，通过测量比较铝溶液处理前后的相对根伸长情况，挑选出耐铝毒突变体ral1。并再次繁种一代，测量比较铝溶液处理前后的相对根伸长确认其耐铝毒能力。

耐铝毒突变体的鉴定

为了定位ral1突变体的突变基因，分别构建了与hjx74的杂交群体和与野生型(kasalath)的回交群体。在总共148个回交群体中，有43个单株表现出生长短根和耐铝毒表型(rre>65％)，105个单株表现为野生型表型(rre≤65％)，分离比符合1：3(χ2＝0.62,p>0.05)，如图7所示，表明ral1突变体的耐铝毒和短根表型是由一个单隐性基因控制。

利用与hjx74的杂交群体，初步把突变基因定位在第六条染色体长臂，与标记os06g003紧密连锁，如图8所示。结合ral1回交f2的高通量测序结果，精确定位到了突变基因ral1(即)，并利用转基因回补确认了基因定位的结果。图9示出了野生型(wt)、突变体(ral1)和两个独立回补株系(c1，c2)的相对根伸长，结果表明两个独立回补株系(c1，c2)的相对根伸长都恢复到了野生型水平，没有表现出更强的耐铝毒能力，确认了基因定位的结果。

耐铝毒能力评价

以相对根伸长为指标评价水稻的耐铝毒能力，比较了根据上述方法获得的ral1突变体(籼稻背景)和两个耐铝毒粳稻品种npb和koshi的耐铝毒能力。图1示出了不同铝浓度下野生型(kasalath)、突变体(ral1)以及npb(nipponbare)和koshi(koshihikari)对铝毒的反应。结果表明，ral1突变体在10、20、50、100μm铝浓度条件下均表现出比其他水稻品种更强的耐铝毒能力。

如前文所述，酸性土壤中游离的al³⁺是抑制作物根系生长的重要因素，为了检测ral1突变体在酸性条件下对铝毒害的耐受能力，将ral1突变体和野生型分别种在酸性土壤(ph4.1)和中性土壤中(ph6.6)中，观察其根生长情况。结果如图2所示，在中性土壤中，ral1突变体的根生长速率相对野生型慢，但是在酸性土壤中，野生型的根长被抑制了54％，而突变体的根长相比中性土壤中被刺激生长的更长，证实ral1突变体对铝毒害有更强的耐受能力。

由于铝对根的毒害作用部位是根尖，发明人结合铝的染料铬花青r(er)研究了突变体根尖的铝积累与野生型是否有差异。图3示出了野生型(wt)和突变体(ral1)在20μm铝处理24h后铬花青r(er)的染色情况。结果表明，ral1突变体在处理24h后，在根冒、分生区、过渡区积累的铝均比野生型显著减少。为了研究短期暴露在铝溶液中对野生型和ral1突变体的铝积累的影响，将铝处理6h后野生型和突变体的0-1cm根尖以及1-2cm基部分别切下，用icp-ms测定根尖和基部总铝含量，结果示于图4，从图中可以看出，ral1突变体在根尖0-1cm积累的铝含量显著少于野生型。

进一步地，分别测定了结合在水稻根部细胞壁和进入细胞液中的铝含量。图5示出了野生型(wt)和突变体(ral1)在20μm铝处理6h后细胞壁和细胞液中的铝含量，结果表明，ral1在根尖0-1cm积累更少的铝主要是由于根尖细胞壁结合了更少的铝。在铝毒害情况下，植物根系细胞壁是与铝接触的最初部位，铝在根尖细胞壁上的积累是铝对植物根尖产生毒害的先决条件，而细胞壁中的果胶和半纤维素是铝在细胞壁中结合的主要位点。为了弄清果胶和半纤维素的量在野生型和突变体中是否有差异，发明人分别测定了根尖中果胶和半纤维素含量，结果示于图6。从图中可以看出，ral1突变体的根尖0-1cm果胶含量显著低于wt野生型，而半纤维素1和半纤维素2的含量与野生型差异不明显，由此可以判断，ral1之所以表现出更耐铝毒，是由于ral1突变体根尖细胞壁的果胶含量低于野生型，所以结合更少的铝离子。

实施例2

通过杂交法将耐铝毒基因导入水稻

将ral1突变体与华梗籼74野生型杂交，获得f1，将f1播种获得f2群体，在f2群体中，分别单株检测每一株的基因型和耐铝毒能力。结果如图14所示，可见含有纯合突变ral1基因的f2单株均表现得比含有野生型ral1基因的单株更耐铝毒。

实施例3

crispr-cas9基因编辑方法敲除水稻的ral1基因

crispr-cas9敲除载体的构建

在ral1基因的第一个外显子上设计靶点，靶点引物为：

上游引物:gttggcaccaccggcttgcccaa(seqidno：3)

下游引物:aaacttgggcaagccggtggtgc(seqidno：4)

采用如图10所示的goldengate连接方法，导入grna表达盒。测序结果如图11所示，获得的敲除突变体crispr-cas9植株测序结果如图12所示。

将crispr-cas9敲除载体导入水稻植株

测序正确的质粒转化农杆菌eha105，挑取单克隆于4ml含卡纳霉素和利福平抗性lb培养液中，28℃200rpm震荡培养24-36h；4000rpm离心5min；用含200μm乙酰丁香酮(as)的aam感菌液制成菌浮液。将长大一定大小的水稻愈伤组织放入aam菌浮液侵染5-10min,然后将愈伤组织取出，无菌滤纸上沥干30-40min,后，置于共培养培养基上，25℃暗培养2.5天。将愈伤组织取出，分别放到含头孢拉定和潮霉素的选择培养基上进行3轮筛选。挑取在选择培养基上存活较好颜色鲜黄的抗性愈伤移入分化培养基中，培养至分化成苗。

耐铝毒能力评价

以相对根伸长为指标评价根据上述方法获得的敲除突变体crispr-cas9植株的耐铝毒能力。图13示出了不同铝浓度下野生型、突变体(ral1)以及敲除突变体crispr-cas9植株对铝毒的反应。结果表明，敲除突变体crispr-cas9植株在10、20、50、100μm铝浓度条件下均表现出比其他水稻品种更强的耐铝毒能力。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

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<110>南京农业大学

<120>一种耐铝毒基因、突变体及其制备方法与应用

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<210>2

<211>559

<212>prt

<213>水稻

<400>2

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151015

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