一个簇毛麦4VL染色体特异的共显性分子标记及其引物和用途的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及一个簇毛麦4vl染色体特异的共显性分子标记及其引物和用途。

背景技术：

栽培品种遗传基础日趋狭窄已成为小麦育种取得突破性进展的主要瓶颈(李振声，2010)。小麦近缘种属蕴藏丰富的抗生物和非生物胁迫以及高产、优质因子等基因资源，通过远缘杂交将近缘物种中的优良基因导入普通小麦，是拓宽小麦遗传基础、推进小麦育种取得突破性进展的有效途径(吉万全等，2001；张增艳等，2004；王述民等，2011)。

簇毛麦(haynaldiavillosa,基因组vv)原产于地中海沿岸，是栽培小麦的二倍体近缘物种，对白粉病几乎所有生理小种表现高抗或免疫，高抗叶锈、条锈和秆锈病，对全蚀病、眼斑病、黄花叶病也都有较好的抗性，并且还具有抗寒性好、耐旱、分蘖力强、小穗数多和籽粒蛋白质含量高等多种优良性状，是小麦遗传性状改良的重要基因资源(depacec，2011)。已有研究发现簇毛麦4vl染色体上具有抗小麦眼斑病、控制小麦编码醇溶蛋白以及小麦耐盐性的基因。为了利用簇毛麦4vl染色体的优异基因，本实验室目前正在利用部分同源配对控制体系创造出更多的携有目的基因的片段大小不同的涉及4vl染色体的结构变异体。准确高效无误的鉴定外源染色体身份，对加速小麦种质资源创新和利用，提高外源染色体的选择效率，降低劳动成本具有重要的现实意义。高密度的分子标记对于精确鉴定外源染色体的易位身份具有重要意义。但是目前簇毛麦各染色体的特异分子标记数量较少，并且主要分布在簇毛麦含有抗黄花叶病(wymv)wss1基因和抗白粉病pm21基因的4vs和6vs染色体臂上，而其他染色体上分布较少，因而限制了其他染色体上优异基因的挖掘、定位和利用。

表达序列标签(est)是将mrna反转录成cdna并克隆到载体构建成cdna文库后，大规模随机挑选cdna克隆，对其3'或5'端进行一步法测序所获得的短的cdna部分序列，一般长度为300～500bp，代表一个完整基因的一部分。est标记除具有一般分子标记的特点外，还具有信息量大、通用性好、开发简单、快捷、费用低、易于操作、稳定性好和重复性高等优点，受到广泛关注。est来自于转录区，其保守性较高，在种族和种属间的通用性比来源于非表达序列标签的标记更好。根据定位于小麦染色体上各个区段的est序列开发分子标记，可以快速追踪相应近缘物种的同源染色体或染色体片段，甚至对相应区域附近的目标基因进行定位。近年来，随着小麦等植物est计划的实施，在ncbi数据库中每年所登陆的麦类作物(包括小麦、大麦、黑麦、燕麦和粗山羊草等)est数目快速增长，为基于est的分子标记的开发和利用提供了丰富的序列信息资源。因此，利用已有的est序列信息开发簇毛麦4vl染色体的特异分子标记对于簇毛麦4vl染色体结构变异体的准确鉴定和目的基因的挖掘具有主要意义。

本研究中所用的植物材料来源如下：簇毛麦(haynaldiavillosa)从英国剑桥植物园引进；硬粒小麦(triticumduruml.，编号“中引1286”，基因组aabb)由中国农业科学院引种组从墨西哥国际玉米改良中心引进；普通小麦品种中国春(t.aestivumcv.chinesespring，cs)、硬粒小麦-簇毛麦双倍体(t.durum-h.villosaamphiploid，又称为硬簇麦，基因组aabbvv)、一套普通小麦中国春-簇毛麦二体异附加系da1v-da7v、t4dl·4vs纯合易位系、t5dl·4vl纯合易位系和t4ds·4vl纯合易位系均由南京农业大学细胞遗传所提供。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的上述缺陷，提供一种特异性的分子标记引物。

本发明的另一目的是提供该分子标记引物的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

簇毛麦4vl染色体的特异性分子标记，选自标记cinau321；标记cinau321的引物序列为：cinau321f：seqidno.1，cinau321r：seqidno.2，用标记cinau321的引物从含有簇毛麦4vl染色体的植株中能扩增出约1150bp的特异条带。

本发明所述的簇毛麦4vl染色体的特异性分子标记引物，选自cinau321f/cinau321r，引物cinau321f序列为：seqidno.1，引物cinau321r序列为：seqidno.2。本发明中能特异追踪簇毛麦4vl染色体的标记的引物是以小麦est(be637255)序列为模板设计而得到的。

本发明所述的分子标记在鉴定携带有簇毛麦4vl染色体中的应用。

本发明所述的分子标记在分子标记辅助选择育种中的应用。

利用本发明所述的分子标记追踪簇毛麦4vl染色体的方法，包括：以待鉴定材料的dna作为模板，用权利要求2所述的特异性分子标记cinau321的引物进行pcr扩增；pcr产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，能扩增出1150bp特异条带的植株为含有簇毛麦4vl染色体的植株。

所述的方法优选的pcr扩增体系为：含20-100ngdna的1μldna模板，1.0μl10×pcrbuffer，0.8μlmgcl2，0.8μldntp，引物cinau321f/cinau321r各0.2μl，0.15μltaqdnapolymerase，5.85μlddh2o；pcr程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火50秒，72℃延伸1分10秒，35个循环；72℃延伸10分钟；10℃保存。

所述的方法优选pcr产物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺质量比39:1的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，再用银染法检测，能扩增出1150bp特异条带的植株为含有簇毛麦4vl染色体的植株。

有益效果：

1、本发明中公开的能特异追踪簇毛麦4vl染色体的分子标记的引物

(cinau321f/cinau321r)是基于小麦est序列设计而成，用来鉴定植株中是否含有簇毛麦4vl染色体，简单易行、方便快捷、扩增稳定。

2、标记引物cinau321f/cinau321r扩增的产物与簇毛麦4vl染色体紧密相连，所以用这对标记引物进行pcr扩增，利用分子标记辅助选择簇毛麦4vl染色体的准确性高。

3、标记引物cinau321f/cinau321r是共显性标记，既可以追踪外源染色体，同时也可以追踪小麦染色体。因此，该类型标记不仅可以检测导入小麦背景中的外源染色体，也可以分析小麦染色体的变化。

附图说明

图1：小麦-簇毛麦t4vl·4ds纯合补偿性易位系。

(a):小麦-簇毛麦t4vl·4ds纯合补偿性易位系染色体制片dapi染色；(b):小麦-簇毛麦t4vl·4ds纯合易位系根尖有丝分裂染色体中期gish图，簇毛麦总基因组dna用fluorescein-12-dutp标记，呈现绿色信号；(c):小麦-簇毛麦t4vl·4ds纯合易位系根尖有丝分裂染色体中期fish图,寡核苷酸探针(pas1-1、4、6)和psc119.2-1分别在5′-末端用tamra(6-carboxytetramethylrhodamine)修饰，呈现红色信号。

图2：标记引物cinau321f/cinau321r所对应的小麦est(be637255)序列及引物序列位置

图3：用簇毛麦、小麦-簇毛麦双二倍体、小麦-簇毛麦1v-7v二体异附加系、4v(4d)异代换系、t4dl·4vs纯合补偿性易位系、t5dl·4vl纯合易位系和普通小麦中国春的dna作为模板，分别用本发明中的标记引物cinau321f/cinau321r进行pcr扩增，结果表明标记引物cinau321f/cinau321r在簇毛麦、小麦-簇毛麦双二倍体、小麦-簇毛麦4v二体异附加系、t5dl·4vl纯合易位系中均扩增出约1150bp的特异条带。箭头所示为特异条带。

注：

m：分子量标记dl2000；1：簇毛麦；2：硬簇麦；3：硬粒小麦；4：中国春；5：t4dl·4vs纯合易位系；6：t5dl·4vl纯合易位系；7-13：小麦-簇毛麦二体异附加系da1v-da7v；14：缺体4a-四体4b；15：缺体4d-四体4b。

具体实施方式

实施例1

1、特异追踪簇毛麦4vl染色体的分子标记引物的设计

在开发和筛选簇毛麦4vl染色体的特异分子标记研究中，分子标记cinau321能特异追踪簇毛麦4vl染色体(图3)。这对标记的引物是根据小麦第四部分同源群上的est序列(be637255)(见参考文献qill,echalierb,chaos,lazogr,butlerge,andersonodetal(2004)achromosomebinmapof16,000expressedsequencetaglocianddistributionofgenesamongthethreegenomesofpolyploidwheat.genetics168:701-712)，采用在线引物设计软件primer3v0.4.0设计并筛选而成(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)。

标记cinau321的引物为cinau321f：5'-tgttgatgacattctgcact-3'(seqidno.1)和cinau321r：5'-gctgacgtatttgtctttcc-3'(seqidno.2)；(图2)

标记引物cinau321f/cinau321r在涉及簇毛麦4vl染色体材料中的分子检测

利用标记引物cinau321f/cinau321r在涉及簇毛麦4vl染色体结构变异体中进行pcr扩增检测。结果表明：在亲本簇毛麦、小麦-簇毛麦双二倍体、小麦-簇毛麦4v二体异附加系、

t5dl·4vl纯合易位系中均扩增出约1150bp的特异条带，而在不含有簇毛麦4vl染色体的材料中均未扩增出该特异条带(图3)。

pcr试剂组成为：含20-100ngdna的1.0μldna模板，1.0μl10×pcrbuffer，0.8μlmgcl2，0.8μldntp，引物cinau321f和cinau321r各0.2μl，0.15μltaqdnapolymerase，5.85μlddh2o。

pcr程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火50秒，72℃延伸1分10秒，35个循环；72℃延伸10分钟；10℃保存，pcr产物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺质量比为39:1的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，再用银染法进行染色。

<110>南京农业大学

<120>一个簇毛麦4vl染色体特异的共显性分子标记及其引物和用途

<160>2

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物cinau321f

<400>1

tgttgatgacattctgcact20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物cinau321r

<400>2

gctgacgtatttgtctttcc20

序列表

1