本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种芦荟中芦荟大黄素的提取和测定方法。
背景技术：
芦荟中含有芦荟大黄素等有效活性物质，芦荟大黄素，对于我们人体而言有致泻的作用，有益于把肠道内的对人体没有用的物质排解掉，因而达到激发性轻泻的一种效果，而这种效果于便秘和痔疮的治疗有特效,尤其是关于老年性便秘一病症，有明显的医治效果。
传统提取芦荟大黄素的方法是热水浸提法、该法得率低、操作费时、能耗大。超声辅助法是新型的辅助提取技术，具有操作步骤简单、节省溶剂、处理时间短等优点。但是，提取的芦荟大黄素纯度不高，且提取率提高不大。
技术实现要素：
本发明的发明目的是，针对上述问题，提供一种芦荟中芦荟大黄素的提取和测定方法，该提取方法采用微波辅助法和超声辅助法协同作用，具有操作步骤简单、节省溶剂、产物收率高、处理时间短等优点；且采用分光光度法测定芦荟大黄素含量，简单快捷，结果误差小。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种芦荟中芦荟大黄素的提取和测定方法，包括以下步骤，
s1、准备样品：采摘鲜嫩的芦荟叶，用清水把芦荟叶上的灰尘清洗干净，然后轻轻的用手术刀去掉叶上的刺，再用手术刀横切成3～5毫米的薄片平铺在托盘上，然后放入烘箱中，在50～55℃条件下烘10～12小时，最后把烘干的芦荟叶粉碎成粉末状制成芦荟粉，放在棕色试剂瓶里避光并贴上标签，备用。
s2、样品预处理：称取步骤s1准备的芦荟粉，先加入乙酸酸解，然后加入乙醇，静置20～40min得到提取液。
s3、微波处理：将所述提取液微波处理,所述微波处理设定功率为300～500w，控制微波时间以提取液温度达到75～80℃时为止。
s4、超声波提取：将微波处理后的提取液超声波提取30～40min,提取温度为40～45℃，超声波功率为100w，然后离心过滤得上清液和残渣。
s5、超声波二次提取：将步骤s4中的残渣加入乙醇进行超声波二次提取，在40～45℃条件下提取10～20分钟，超声波功率为100w，然后离心得上清液。
s6、芦荟大黄素测定：将步骤s3和s4得到的上清液混合得到待测液，用分光光度法测定待测液中芦荟大黄素的含量。
作为一种优选的方案，步骤s1中，所述芦荟粉为40～60目。
作为一种优选的方案，步骤s2中，酸解过程中，芦荟粉与乙酸的料液比为1:8～10；乙醇加入量为乙酸的2～2.5倍。
作为一种优选的方案，步骤s4和s5中，超声结束后用移液枪吸取提取液放进离心管中，再以每分钟3000转的转速，进行离心10分钟，离心结束后用移液枪慢慢吸取上清液到容量瓶中。
作为一种优选的方案，步骤s5中，加入的乙醇的量为步骤s2中乙醇的一半。
作为一种优选的方案，所述分光光度法测定芦荟大黄素的具体步骤为：
①对照品溶液配制：称量芦荟大黄素对照品放进烧杯中，再用少量无水c2h5oh进行溶解，最后用无水c2h5oh定容到50毫升的容量瓶中，制得浓度为每毫升50微克的芦荟大黄素对照品溶液；
②波长扫描：用比色皿盛装一定量的芦荟大黄素对照品溶液，以无水c2h5oh为空白溶液，放进分光光度计的槽中，在200～600纳米波长间扫描。
③绘制标准曲线：分别量取芦荟大黄素对照品溶液8、6、4、2、1毫升到10毫升容量瓶中，定容制得浓度分别为每毫升40微克，每毫升30微克，每毫升20微克，每毫升10微克，每毫升5微克的系列溶液，测量在420纳米波长下的吸光值，从而绘制标准曲线，以吸光值为纵坐标，芦荟大黄素标准液浓度为横坐标，绘制标准曲线，得芦荟大黄素的回归方程为y＝0.0463x-0.0138，r2＝0.9994。
④样品的测定：吸取最终待测液，80％c2h5oh作为空白管，在波长为420纳米波长下测定，测定3～5次。按照制得的标准曲线的回归方程，计算曲线中芦荟大黄素浓度，最后计算出芦荟大黄素的含量。
具体计算方法为，将上述计算的芦荟大黄素浓度，再代入公式(1)：
芦荟大黄素含量(mg)＝曲线中计算出的芦荟大黄素浓度(μg/ml)×50ml×样品稀释倍数×10-3公式(1)
将测定的三次结果依次代进上述公式计算，然后求平均值，得出平均含量，再代入下列公式(2)，其中样品重为步骤s2中，称取的芦荟粉的重量：
芦荟叶粉末中的芦荟大黄素含量(mg/g)＝曲线中算出的芦荟大黄素含量(mg)(平均含量)/样品重(g)公式(2)
由于采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
1.本发明采用微波辅助法和超声辅助法协同作用，具有操作步骤简单、节省溶剂、产物收率高、处理时间短等优点。
2.本发明采超声波提取采用两级提取方式，提高产物收率。
3.本发明采用分光光度法测定芦荟大黄素含量，简单快捷，结果误差小。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种芦荟中芦荟大黄素的提取和测定方法，选取的芦荟为木立芦荟，包括以下步骤，
s1、准备样品：采摘鲜嫩的芦荟叶，用清水把芦荟叶上的灰尘清洗干净，然后轻轻的用手术刀去掉叶上的刺，再用手术刀横切成5毫米的薄片平铺在托盘上，然后放入烘箱中，在55℃条件下烘12小时，最后把烘干的芦荟叶粉碎成粉末状制成芦荟粉，所述芦荟粉为40目。放在棕色试剂瓶里避光并贴上标签，备用。
s2、样品预处理：称取步骤s1准备的芦荟粉，精确称1克的芦荟叶粉末，用10ml浓度为1mol/l的ch3cooh酸解30min，然后加进20毫升的80％c2h5oh，静置30分钟。
s3、微波处理：将所述提取液微波处理,所述微波处理设定功率为300w，控制微波时间以提取液温度达到75～78℃时为止。
s4、超声波提取：将微波处理后的提取液超声波提取30min,提取温度为45℃，超声波功率为100w，超声结束后用移液枪吸取提取液放进离心管中，再以每分钟3000转的转速，进行离心10分钟，离心结束后用移液枪慢慢吸取上清液到容量瓶中。
s5、超声波二次提取：将步骤s4中的残渣加入12.5ml80％c2h5oh进行超声波二次提取，在45℃条件下提取20分钟，超声波功率为100w，然后离心得上清液，超声结束后用移液枪吸取提取液放进离心管中，再以每分钟3000转的转速，进行离心10分钟，离心结束后用移液枪慢慢吸取上清液到容量瓶中。
s6、芦荟大黄素测定：用分光光度法测定待测液中芦荟大黄素的含量。所述分光光度法测定芦荟大黄素的具体步骤为：
①对照品溶液配制：用无水c2h5oh配置一定浓度的芦荟大黄素对照品溶液：用电子分析天平精细的称量芦荟大黄素对照品0.0025克，放进烧杯中，再用少量无水c2h5oh进行溶解，最后用无水c2h5oh定容到50毫升的容量瓶中，结果制得浓度为每毫升50微克的芦荟大黄素对照品溶液。
②波长扫描：用比色皿盛装一定量的芦荟大黄素对照品溶液，以无水c2h5oh为空白溶液，放进分光光度计的槽中，在200～600纳米波长间扫描。
③绘制标准曲线：分别量取芦荟大黄素对照品溶液8、6、4、2、1毫升到10毫升容量瓶中，定容制得浓度分别为每毫升40微克，每毫升30微克，每毫升20微克，每毫升10微克，每毫升5微克的系列溶液，测量在420纳米波长下的吸光值，从而绘制标准曲线，以吸光值为纵坐标，芦荟大黄素标准液浓度为横坐标，绘制标准曲线，得芦荟大黄素的回归方程为y＝0.0463x-0.0138，r2＝0.9994。
④样品的测定：将s4和s5取得的上清液吸入50ml容量瓶中，再用80％c2h5oh定容到50毫升，摇匀得备用液。用10毫升量筒准确量取上述备用液10毫升至烧杯中，再加入20毫升80％c2h5oh，摇匀，成为最终待测液。吸取最终待测液，80％c2h5oh作为空白管，在波长为420纳米波长下测定，测定三次。按照制得的标准曲线的回归方程，计算曲线中芦荟大黄素浓度，最后计算出芦荟大黄素的含量。具体计算方法为，将上述计算的芦荟大黄素浓度，再代入公式(1)：
芦荟大黄素含量(mg)＝曲线中计算出的芦荟大黄素浓度(μg/ml)×50ml×样品稀释倍数×10-3公式(1)
将测定的三次结果依次代进上述公式计算，然后求平均值，得出平均含量，再代入下列公式(2)：
芦荟叶粉末中的芦荟大黄素含量(mg/g)＝曲线中算出的芦荟大黄素含量(mg)(平均含量)/样品重(g)公式(2)。
根据测得各个不同品种的吸光度，代入线性方程式，及式(1)、式(2)，得如下表1：
表1芦荟大黄素含量
从上表可以看出，芦荟大黄素含量相对较高，为每克芦荟叶粉末中的芦荟大黄素含量达到2.1505mg。在重复性实验中，测定的结果稳定，数值间相差不是很大，说明该提取方法重复性较好。
实施例2
一种芦荟中芦荟大黄素的提取和测定方法，选取的芦荟为木立芦荟，包括以下步骤，
s1、准备样品：采摘鲜嫩的芦荟叶，用清水把芦荟叶上的灰尘清洗干净，然后轻轻的用手术刀去掉叶上的刺，再用手术刀横切成4毫米的薄片平铺在托盘上，然后放入烘箱中，在50℃条件下烘10小时，最后把烘干的芦荟叶粉碎成粉末状制成芦荟粉，所述芦荟粉为60目。放在棕色试剂瓶里避光并贴上标签，备用。
s2、样品预处理：称取步骤s1准备的芦荟粉，精确称2克的芦荟叶粉末，用10ml浓度为1mol/l的ch3cooh酸解30min，然后加进25毫升的80％c2h5oh，静置30分钟。
s3、微波处理：将所述提取液微波处理,所述微波处理设定功率为300～500w，控制微波时间以提取液温度达到75～80℃时为止。
s4、超声波提取：将微波处理后的提取液超声波提取30min,提取温度为40℃，超声波功率为100w，超声结束后用移液枪吸取提取液放进离心管中，再以每分钟3000转的转速，进行离心10分钟，离心结束后用移液枪慢慢吸取上清液到容量瓶中。
s5、超声波二次提取：将步骤s4中的残渣加入10ml80％c2h5oh进行超声波二次提取，在40℃条件下提取10分钟，超声波功率为100w，然后离心得上清液，超声结束后用移液枪吸取提取液放进离心管中，再以每分钟3000转的转速，进行离心10分钟，离心结束后用移液枪慢慢吸取上清液到容量瓶中。
s6、芦荟大黄素测定：用分光光度法测定待测液中芦荟大黄素的含量。所述分光光度法测定芦荟大黄素的具体步骤为：
①对照品溶液配制：用无水c2h5oh配置一定浓度的芦荟大黄素对照品溶液：用电子分析天平精细的称量芦荟大黄素对照品0.0025克，放进烧杯中，再用少量无水c2h5oh进行溶解，最后用无水c2h5oh定容到50毫升的容量瓶中，结果制得浓度为每毫升50微克的芦荟大黄素对照品溶液。
②波长扫描：用比色皿盛装一定量的芦荟大黄素对照品溶液，以无水c2h5oh为空白溶液，放进分光光度计的槽中，在200～600纳米波长间扫描；
③绘制标准曲线：分别量取芦荟大黄素对照品溶液8、6、4、2、1毫升到10毫升容量瓶中，定容制得浓度分别为每毫升40微克，每毫升30微克，每毫升20微克，每毫升10微克，每毫升5微克的系列溶液，测量在420纳米波长下的吸光值，从而绘制标准曲线，以吸光值为纵坐标，芦荟大黄素标准液浓度为横坐标，绘制标准曲线，得芦荟大黄素的回归方程为y＝0.0463x-0.0138，r2＝0.9994；
④样品的测定：将s4和s5取得的上清液吸入50ml容量瓶中，再用80％c2h5oh定容到50毫升，摇匀得备用液。用10毫升量筒准确量取上述备用液10毫升至烧杯中，再加入20毫升80％c2h5oh，摇匀，成为最终待测液。吸取最终待测液，80％c2h5oh作为空白管，在波长为420纳米波长下测定，测定三次。按照制得的标准曲线的回归方程，计算曲线中芦荟大黄素浓度，最后计算出芦荟大黄素的含量。具体计算方法为，将上述计算的芦荟大黄素浓度，再代入公式(1)：
芦荟大黄素含量(mg)＝曲线中计算出的芦荟大黄素浓度(μg/ml)×50ml×样品稀释倍数×10-3公式(1)
将测定的三次结果依次代进上述公式计算，然后求平均值，得出平均含量，再代入下列公式(2)：
芦荟叶粉末中的芦荟大黄素含量(mg/g)＝曲线中算出的芦荟大黄素含量(mg)(平均含量)/样品重(g)公式(2)
根据测得各个不同品种的吸光度，代入线性方程式，及式(1)、式(2)，得如下表2。
表2芦荟大黄素含量
从上表可以看出，芦荟大黄素含量相对较高，为每克芦荟叶粉末中的芦荟大黄素含量达到2.1850mg。在重复性实验中，测定的结果稳定，数值间相差不是很大，说明该提取方法重复性较好。本实验采用的方法可以为芦荟的开发利用研究提供一定的理论依据。
上述说明凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，盖专利范围。