来源于积雪草的蛋白及在制备山楂酸和科罗索酸中的应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种来源于积雪草的蛋白及在制备山楂酸和科罗索酸中的应用。
背景技术：
：山楂酸(maslinicacid)(式1)、科罗索酸(corosolicacid)(式2)和积雪草酸(asiaticacid)(式3)等为代表的2位α-羟化药用三萜类活性成分均是山楂(crataeguspinnatifidabunge)，枇杷(eriobotryajaponica)，大花紫薇(lagerstroemiaspeciosa(l.)pers.)和积雪草(centellaasiatica(l.)urb.)等药用植物自身合成的微量次生代谢物，山楂酸与科罗索酸均为五环三萜酸，分属于β-香树脂型或α-香树脂型五环三萜类化合物，山楂酸与科罗索酸为同分异构体，在植物体内，二者常常共同存在。山楂酸、科罗索酸和积雪草酸在抗癌，抗艾滋病毒，美容及肝脏保护等领域有广泛应用，已作为营养补充剂或化妆品在市场上流通。目前这类化合物主要是从山楂，大花紫薇、枇杷等植物中分离提取得到，但这种方法有较多的缺点，包括含量低和差异大，产品纯化难，植物生长周期长，对生物资源尤其野生资源造成严重破坏等。利用合成生物学的原理，设计和改造微生物菌株来生产天然产物已被国际认为是一种最有潜力的方法，如在大肠杆菌中生产紫杉醇的前体紫杉二烯已达到1000mg/l(parayilkumaranajikumaretal.,2010,science,330:70-74)；银杏内酯类(ginkgolides)前体左旋海松二烯(levopimaradiene)，在改造后的大肠杆菌工程菌中达到700mg/l的产量(effendileonardetal.,2010,pnas,107(31):13654-13659)；在酵母工程菌中生产青蒿素(artemisinin)的前体青蒿酸(artemisinicacid)最高达到25g/l(paddoncjetal.,2013,nature,2013,496:528-532)；目前国内在青蒿素，紫杉醇，人参皂苷和丹参酮等药物分子的生物合成方面有相关研究。技术实现要素：本发明的目的是提供一种来源于积雪草的蛋白及在制备山楂酸和科罗索酸中的应用。本发明所提供的来源于积雪草的蛋白质具有羟化酶功能，其名称为山楂酸/科罗索酸相关蛋白(camaa45)，具体可为如下任一：(a1)氨基酸序列为序列表中的序列1的蛋白质；(a2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；(a3)与(a1)或(a2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；(a4)在(a1)-(a3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。为了便于所述蛋白质的纯化，可在所述蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。表：标签的序列标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna、hnrna或trna等。在本发明中，所述核酸分子具体可为如下任一：(b1)编码序列为序列表中序列2的第444-1871位所示的dna分子；(b2)在严格条件下与(b1)限定的dna分子杂交且编码所述蛋白质的dna分子；(b3)与(b1)或(b2)限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且编码所述蛋白质的dna分子。上述严格条件可为用6×ssc，0.5％sds的溶液，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。含上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物也属于本发明的保护范围。所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为prs313或prs314，或对prs313或prs314进行改造得到的载体。在本发明中，所述重组载体具体为prs313-trp-tef1-syncamaa45-cyc1t。所述prs313-trp-tef1-syncamaa45-cyc1t为将prs313-trp-tef1-maa45-cyc1t载体酶切位点sexa1和asc1之间的小片段替换为序列表中序列2第438-1871位所示dna片段后得到的重组质粒。所述表达盒由能够启动所述核酸分子表达的启动子，所述核酸分子，以及转录终止序列组成。在本发明中，所述表达盒的序列为序列表中序列2。其中，序列2的第1-430位为tef1启动子序列，第444-1871位为syncamaa45基因的编码序列，第1880-2186位为cyc1终止子。所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，酵母可为酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)，如酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)by-oa或酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)by-ua7。在本发明中，所述酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)by-ua7为向酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)by-t3中导入dna片段1、dna片段2、dna片段3、dna片段4和dna片段5后得到的重组酿酒酵母。所述dna片段1为以prdna-leu2质粒为模板，采用引物5’-cttgcaaatgcctattgtgcagatgttataatatctgtgcgtttaattaaggctcgtatgttgtgtggaattgt-3’和5’-ctcactattttttactgcggaagcgg-3’进行pcr扩增所得dna片段。所述dna片段2为vvcpr基因表达盒，所述vvcpr基因的序列为序列表中序列3。所述dna片段3为sejaas基因表达盒，所述sejaas基因的序列为序列表中序列4。所述dna片段4为cyp15基因表达盒，所述cyp15基因的序列为序列表中序列5。所述dna片段5为以prdna-leu2质粒为模板，采用引物5’-gaactgggttacccggggcacctgtc-3’和5’-cgaaggctttaatttgcaagctgcggccctgcattaatgaatcggccaacgcgccagggttttcccagtcacgacgttg-3’进行pcr扩增所得dna片段。所述转基因细胞系不包括繁殖材料。本发明还提供了羟化酶制剂或三萜2位α-羟化酶制剂，包含所述蛋白质或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物。如下(c)或(d)或(e)所示的应用均属于本发明的保护范围：(c)所述蛋白质在如下任一中的应用：c1)作为羟化酶或三萜2位α-羟化酶，或制备具有羟化酶或三萜2位α-羟化酶活性的产品；c2)生产山楂酸和/或科罗索酸，或制备用于生产山楂酸和/或科罗索酸的产品；c3)降解齐墩果酸和/或乌索酸，或制备用于降解齐墩果酸和/或乌索酸的产品。(d)所述核酸分子或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物在如下任一中的应用：d1)制备所述蛋白质；d2)制备具有羟化酶或三萜2位α-羟化酶活性的产品；d3)生产山楂酸和/或科罗索酸，或制备用于生产山楂酸和/或科罗索酸的产品；d4)降解齐墩果酸和/或乌索酸，或制备用于降解齐墩果酸和/或乌索酸的产品。(e)所述羟化酶制剂或三萜2位α-羟化酶制剂在如下任一中的应用：e1)生产山楂酸和/或科罗索酸，或制备用于生产山楂酸和/或科罗索酸的产品；e2)降解齐墩果酸和/或乌索酸，或制备用于降解齐墩果酸和/或乌索酸的产品。本发明还提供了所述蛋白质的制备方法。本发明所提供的所述蛋白质的制备方法，具体可包括如下步骤：培养前文所述的重组微生物，使所述核酸分子得以表达，得到含有所述蛋白质的重组微生物培养物；从所述重组微生物培养物中分离得到所述蛋白质。本发明还提供了山楂酸和/或科罗索酸的制备方法。本发明所提供的山楂酸和/或科罗索酸的制备方法，是以齐墩果酸和/或乌索酸为底物用所述蛋白质进行催化反应得到山楂酸和/或科罗索酸。具体而言，本发明所提供的山楂酸和/或科罗索酸的制备方法，可包括如下步骤：将含有所述蛋白质的编码基因(即前文所述核酸分子)的表达盒(具体如序列表中序列2)导入能产生齐墩果酸和/或乌索酸的受体生物细胞中，得到重组生物细胞；培养所述重组生物细胞，使所述蛋白质的编码基因表达，得到表达所述蛋白质的细胞培养物；从所述表达所述蛋白质的细胞培养物中得到山楂酸和/或科罗索酸；所述受体生物细胞为微生物细胞、植物细胞或非人动物细胞。进一步，所述受体生物细胞可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，酵母可为酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)，如酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)by-oa或酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)by-ua7。本发明将从积雪草中克隆得到的camaa45蛋白的编码基因，将其导入可产生齐墩果酸(oa)的酿酒酵母菌后，重组菌可以产生山楂酸；将其导入可产生齐墩果酸(oa)与乌索酸(ua)的酿酒酵母菌中后，重组菌可以产生山楂酸和科罗索酸，而未导入该基因的菌株均不可以产生山楂酸和科罗索酸。表明，camaa45可以以齐墩果酸为底物制备山楂酸，还可以以乌索酸为底物制备科罗索酸。实验证明，可以利用camaa45及其编码基因制备山楂酸和科罗索酸，还可以利用camaa45催化三萜2位α-羟化。附图说明图1为山楂酸和by-oa-syncamaa45的hplc检测图谱。ma为山楂酸标准品，对应的保留时间为36.31min。图2为山楂酸和科罗索酸标准品，以及by-ua7-syncamaa45的hplc检测图谱。ma和ca分别为山楂酸和科罗索酸的标准品，对应保留时间分别为36.31和37.10min。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所涉及的定量试验均设置了至少三次以上的重复，结果取均值。质粒prs313-trp-tef1-maa45-cyc1t(记载在中国专利201611037629.9中)，具体构建方法如下：以pm3-erg9(记载在中国专利申请201210453416.x中，可从中国科学院天津工业生物技术研究所获得)为模板，用引物表1中引物扩增tef1(450bp)。扩增体系为：5×phusionhfbuffer10μl、dntp(10mm每种dntp)1μl、dna模板20ng、引物(10μm)各1μl、phusionhigh-fidelitydnapolymerase(2.5u/μl)0.5μl、补加蒸馏水至总体积50μl。扩增条件为98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、退火10秒(退火温度58℃)、72℃延伸1分钟(32个循环)；72℃延伸8分钟(1个循环)。用pac1和sexa1对扩增片段tef1和质粒prs313-trp-pgk1-maa45-cyc1t(记载在中国专利201610236283.9中，公众可以从中国科学院天津工业生物技术研究所中获得)进行双酶切，胶回收片段tef1和prs313-trp-maa45-cyc1t将所得片段各50ng加入连接体系：2μl10×t4dnaligasereactionbuffer(neb公司)、1μlt4ligase(neb公司，400,000cohesiveendunits/ml)，补充蒸馏水至20μl，室温反应2小时得到连接产物，转入trans10感受态细胞中，测序验证正确得到prs313-trp-tef1-maa45-cyc1t质粒。prs313-trp-tef1-gfp-cyc1t(记载在中国专利201611037629.9中)，具体构建方法如下：以pym–n9(carstenjanke,mariam.magieraandnicolerathfelder,etal.,yeast2004；21:947–962.可从中国科学院天津工业生物技术研究所获得)为模板，用引物表1中引物扩增gfp(828bp)。扩增体系为：5×phusionhfbuffer10μl、dntp(10mm每种dntp)1μl、dna模板20ng、引物(10μm)各1μl、phusionhigh-fidelitydnapolymerase(2.5u/μl)0.5μl、补加蒸馏水至总体积50μl。扩增条件为98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、退火10秒(退火温度58℃)、72℃延伸1分钟(32个循环)；72℃延伸8分钟(1个循环)。用sexa1和asc1对扩增片段gfp和质粒prs313-trp-tef1-maa45-cyc1t进行双酶切，胶回收片段gfp和prs313-trp-tef1-…-cyc1t，将所得片段各50ng加入连接体系：2μl10×t4dnaligasereactionbuffer(neb公司)、1μlt4ligase(neb公司，400,000cohesiveendunits/ml)，补充蒸馏水至20μl，室温反应2小时得到连接产物，转入trans10感受态细胞中，测序验证正确得到prs313-trp-tef1-gfp-cyc1t质粒。引物表1实施例1、syncamaa45可以用来制备山楂酸和科罗索酸本发明提供了一种来自于积雪草(centellaasiatica)蛋白质，其名称为山楂酸/科罗索酸相关蛋白(camaa45)，camaa45可以催化三萜2位α-羟化，属于三萜2位α-羟化酶，camaa45的氨基酸序列如序列表中序列1所示，可由序列2的第444-1871位所示的syncamaa45基因编码。1、prs313-trp-tef1-syncamaa45-cyc1t重组载体的制备用sexa1和asc1分别对p-syncamaa45(公司合成，如序列表中序列2的第431-1879位所示)和质粒prs313-trp-tef1-maa45-cyc1t(记载在中国专利201611037629.9中)进行双酶切；分别割胶纯化目的基因syncamaa45和载体骨架大片段prs313-trp-tef1-/-cyc1t，并同时加入连接体系(各50ng)：2μl10×t4ligationbuffer(neb公司)、1μlt4ligase(neb公司，400,000cohesiveendunits/ml)，补充蒸馏水至20μl，室温反应2小时得到连接产物，转化，测序验证，将得到的序列正确的载体命名为prs313-trp-tef1-syncamaa45-cyc1t。其中，序列2的第1-430位为tef1启动子序列，第431-437位为sexa1的识别序列，第444-1871位为syncamaa45基因的编码序列，第1872-1879位为asc1的识别序列，第1880-2186位为cyc1终止子。2、重组菌的制备将步骤1的prs313-trp-tef1-syncamaa45-cyc1t导入出发菌酿酒酵母saccharomycescerevisiaeby-oa(记载在中国专利zl201310399947.x中，以下简称by-oa，by-oa可以产生齐墩果酸(oa))中，得到重组菌，将该重组菌命名为by-oa-syncamaa45；将对照质粒prs313-trp-tef1-gfp-cyc1t(记载在中国专利201611037629.9中)导入by-oa中，得到重组菌，将该重组菌命名为by-oa-ck。将步骤1的prs313-trp-tef1-syncamaa45-cyc1t导入出发菌酿酒酵母saccharomycescerevisiaeby-ua7(以下简称by-ua7，by-ua7可以产生乌索酸(ua)和齐墩果酸(oa))中，得到重组菌，将该重组菌命名为by-ua7-syncamaa45；将对照质粒prs313-trp-tef1-gfp-cyc1t(记载在中国专利201611037629.9中)导入by-ua7中，得到重组菌，将该重组菌命名为by-ua7-ck。其中，by-ua7按照如下2.1-2.3制备：2.1基因元件的质粒构建(1)pm2-vvcpr质粒的构建用sexa1和asc1分别对p-vvcpr(公司合成，其序列为序列表中序列3)和质粒pm2-thmg1(记载在中国专利zl201310399947.x中)进行双酶切；分别割胶纯化目的基因vvcpr和载体骨架大片段pm2，并同时加入连接体系(各50ng)：2μl10xt4ligationbuffer(neb公司)、1μlt4ligase(neb公司，400,000cohesiveendunits/ml)，补充蒸馏水至20μl，室温反应2小时得到连接产物，转化，测序验证，将得到的序列正确的载体命名为pm2-vvcpr。(2)pm4-sejaas用sexa1和asc1分别对p-sejaas(公司合成，其序列为序列表中序列4)和质粒pm11-atcpr1(记载在中国专利zl201310399947.x中)进行双酶切；分别割胶纯化目的基因sejaas和载体骨架大片段pm4，并同时加入连接体系(各50ng)：2μl10xt4ligationbuffer(neb公司)、1μlt4ligase(neb公司，400,000cohesiveendunits/ml)，补充蒸馏水至20μl，室温反应2小时得到连接产物，转化，测序验证，将得到的序列正确的载体命名为pm4-sejaas。(3)pm3-cyp15用sexa1和asc1分别对p-cyp15(公司合成，其序列为序列表中序列5)和质粒pm3-erg9(记载在中国专利申请201210453416.x中)进行双酶切；分别割胶纯化目的基因cyp15和载体骨架大片段pm3，并同时加入连接体系(各50ng)：2μl10xt4ligationbuffer(neb公司)、1μlt4ligase(neb公司，400,000cohesiveendunits/ml)，补充蒸馏水至20μl，室温反应2小时得到连接产物，转化，测序验证，将得到的序列正确的载体命名为pm3-cyp15。2.2by-ua7的构建分别用引物表2描述的pcr模板(prdna-leu2记载在中国专利申请201210453416.x中)和引物进行pcr获得功能模块：m1′(prdna-leu2-up)，m2′(ppgk1-vvcpr-tadh1)，m3′(ptdh3-sejaas-ttpi1)，m4′(ptef1-cyp15-tcyc1)，m5′(prdna-leu2-down)。扩增体系为：newenglandbiolabsphusion5xbuffer10μl、dntp(10mmeachdntp)1μl、dna模板20ng、引物(10μm)各1μl、phusionhigh-fidelitydnapolymerase(2.5u/μl)0.5μl、补加蒸馏水至总体积50μl。扩增条件为98℃预变性1.5分钟(1个循环)；98℃变性10秒、退火10秒(退火温度58℃)、72℃延伸均用2分钟(32个循环)；72℃延伸8分钟(1个循环)，产物经割胶回收保存。引物表2按照中国专利申请201210453416.x中实施例2中感受态细胞的制备方法，制备得到by-t3感受态细胞(by-t3的构建方法记载在中国专利申请201610236283.9中)，然后向by-t3感受态细胞中加入转化用片段：m1′，m2′，m3′，m4′和m5′基因模块共5μg(摩尔比＝1:1:1:1:1)。筛选培养的培养基为：0.8％(质量百分比浓度)酵母选择培养基sd-ura-trp-leu-his，2％(质量百分比浓度)葡萄糖，0.01％(质量百分比浓度)trp，0.01％(质量百分比浓度)ura；筛选培养的条件为：30℃，培养36h以上。pcr鉴定出序列正确的阳性克隆，命名为菌株by-ua7。3、山楂酸和科罗索酸的制备3.1摇瓶发酵分别在固体选择培养基1(固体选择培养基1由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其质量百分比浓度分别为：0.8％酵母选择培养基sd-ura-trp-leu-his，2％葡萄糖，0.01％trp.和琼脂粉)中活化by-oa，然后分别接种于液体选择培养基1(液体选择培养基1由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其质量百分比浓度分别为：0.8％酵母选择培养基sd-ura-trp-leu-his，2％葡萄糖，0.01％trp.)中于30℃，250rpm培养16h制备种子液，将种子液以1％的接种量接种于含15ml液体选择培养基1的100ml三角瓶中，30℃，250rpm振荡培养6天，得到by-oa发酵液。分别在固体选择培养基2(固体选择培养基2由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其质量百分比浓度分别为：0.8％酵母选择培养基sd-ura-trp-leu-his，2％葡萄糖，0.01％trp.，0.01％ura.和琼脂粉)中活化by-ua7，然后分别接种于液体选择培养基2(液体选择培养基2由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其质量百分比浓度分别为：0.8％酵母选择培养基sd-ura-trp-leu-his，2％葡萄糖，0.01％trp.和0.01％ura.)中于30℃，250rpm培养16h制备种子液，将种子液以1％的接种量接种于含15ml液体选择培养基2的100ml三角瓶中，30℃，250rpm振荡培养6天，得到by-ua7发酵液。分别在固体选择培养基3(固体选择培养基3由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其质量百分比浓度分别为：0.8％酵母选择培养基sd-ura-trp-leu-his，2％葡萄糖和琼脂粉)中活化步骤2的by-oa-syncamaa45和by-oa-ck，然后分别接种于液体选择培养基3(液体选择培养基3由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其质量百分比浓度分别为：0.8％酵母选择培养基sd-ura-trp-leu-his，2％葡萄糖)中于30℃，250rpm培养16h制备种子液，将种子液以1％的接种量接种于含15ml液体选择培养基3的100ml三角瓶中，30℃，250rpm振荡培养6天，分别得到by-oa-syncamaa45发酵液和by-oa-ck发酵液。分别在固体选择培养基4(固体选择培养基4由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其质量百分比浓度分别为：0.8％酵母选择培养基sd-trp-leu-his，2％葡萄糖和琼脂粉)中活化步骤2的by-ua7-syncamaa45和by-ua7-ck，然后分别接种于液体选择培养基4(液体选择培养基4由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其质量百分比浓度分别为：0.8％酵母选择培养基sd-trp-leu-his，2％葡萄糖)中于30℃，250rpm培养16h制备种子液，将种子液以1％的接种量接种于含15ml液体选择培养基4的100ml三角瓶中，30℃，250rpm振荡培养6天，分别得到by-ua7-syncamaa45发酵液和by-ua7-ck发酵液。3.2生物反应器发酵3.2.1培养基配置氯化钙母液：19.2g/l二水氯化钙。微量金属盐母液：19.1g/l乙二胺四乙酸二钠；10.2g/l七水硫酸锌；0.5g/l四水氯化锰；0.86g/l六水氯化钴；0.78g/l五水硫酸铜；0.56g/l二水钼酸钠；5.12g/l七水亚硫酸铁。维他命母液：0.05g/l生物素；0.2g/l对氨基苯甲酸纳；1g/l烟酸；1g/l泛酸钙；1g/l盐酸吡哆醇；1g/l盐酸硫胺素；25g/l肌醇。种子培养基和批次发酵培养基：25g/l葡萄糖，15g/l硫酸铵，6.15g/l七水硫酸镁，0.72g/l七水硫酸锌，8g/l磷酸二氢钾，2ml氯化钙母液，10ml微量金属盐母液；12ml维他命母液(根据需要，添加1g/lura.)。补料培养基：600g/l一水葡萄糖，5.125g/l七水硫酸镁，3.5g/l硫酸钾，0.28g/l硫酸钠，9g/l磷酸二氢钾(根据需要，添加1g/lura.)。3.2.2工程菌by-oa-syncamaa45发酵按3.1方法活化工程菌by-oa-syncamaa45。挑取平板上的单克隆至装有相应液体培养基3的试管，30℃，250rpm振荡培养过夜；吸取500μl菌液至装有50ml含相应液体培养基3的250ml三角瓶中，30℃，250rpm振荡培养24h；分别吸取2ml菌液至3个装有100ml种子培养基的1l三角瓶中(30℃，250rpm振荡培养48h；最后经火焰接种环，将种子液加入含3l发酵培养基的7l发酵罐中。发酵过程中参数设定值分别为：温度30℃，ph5.0，溶氧30％，空气流量3-20l/min，搅拌转速300-1000rpm，溶氧与搅拌转速、通气级联。补料策略为：溶氧值大于60时，向发酵罐中加入补料培养基至发酵液中葡萄糖浓度为5g/l。3.2.3工程菌by-ua7-syncamaa45发酵按3.1方法活化工程菌by-ua7-syncamaa45。挑取平板上的单克隆至装有相应液体培养基4的试管，30℃，250rpm振荡培养过夜；吸取500μl菌液至装有50ml含相应液体培养基4的250ml三角瓶中，30℃，250rpm振荡培养24h；分别吸取2ml菌液至3个装有100ml种子培养基的1l三角瓶中另外加1g/lura)，30℃，250rpm振荡培养48h；最后经火焰接种环，将种子液加入含3l发酵培养基的7l发酵罐中(另外加1g/lura)。发酵过程中参数设定值分别为：温度30℃，ph5.0，溶氧30％，空气流量3-20l/min，搅拌转速300-1000rpm，溶氧与搅拌转速、通气级联。补料策略为：溶氧值大于60时，向发酵罐中加入补料培养基(另外加1g/lura)至发酵液中葡萄糖浓度为5g/l。3.3化合物提取按照如下方法分别提取步骤3.1中的六种发酵液中的化合物：取6ml步骤3.1的by-oa-syncamaa45发酵液于破碎管中，13000rpm离心1min，弃上清液；沉淀用无菌水清洗后，13000rpm离心1min，弃上清液；向沉淀中加入玻璃珠(直径0.5mm)和1ml萃取液(萃取液由甲醇和丙酮组成，甲醇与丙酮的体积比为1:1)，震荡破碎5min，超声破碎30min，13000rpm离心2min，弃沉淀，将上清液过0.22μm有机滤膜至液相瓶中得到溶液，将该溶液其命名为by-oa-syncamaa45溶液。按照上述方法，将by-oa-syncamaa45发酵液替换为by-ua7-syncamaa45发酵液，其他步骤均不变，得到溶液，将其命名为by-ua7-syncamaa45溶液。按照上述方法，将by-oa-syncamaa45发酵液分别替换为by-oa发酵液、by-oa-ck发酵液、by-ua7发酵液和by-ua7-ck发酵液，其他步骤均不变，分别得到by-oa溶液、by-oa-ck溶液、by-ua7溶液和by-ua7-ck溶液。同样的方法从3.2中的by-oa-syncamaa45发酵液中提取相应的by-oa-syncamaa45溶液，并从by-ua7-syncamaa45发酵液中提取相应的by-ua7-syncamaa45溶液。3.4hplc定量分析按照如下方法分别对步骤3.3中的各溶液进行定量定性分析，标准品为山楂酸(上海源叶生物科技有限公司)和科罗索酸(上海源叶生物科技有限公司)。仪器：安捷伦1260高效液相色谱仪；chemstationforlc3dsystemversionb.04.03数据采集和处理系统。hplc条件：dad检测器，检测波长203nm，watersc18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)，流动相a为10％甲醇+0.1％乙酸，流动相b为乙腈，梯度洗脱，流速1ml/min，柱温30℃。洗脱方式如下：0～50min(包括50min)流动相a的体积百分比浓度为从80％线性变化为0％，流动相b的体积百分比浓度从为20％线性变化为100％；其中50～60min(包括60min)流动相b的体积百分比浓度为100％；60～62min(包括62min)流动相a的体积百分比浓度为80％，流动相b的体积百分比浓度为20％；62～65min(包括65min)流动相a的体积百分比浓度为80％，流动相b的体积百分比浓度为20％。hplc检测图谱如图1和图2所示，计算结果显示：用3.1摇瓶发酵方法时by-oa-syncamaa45溶液中含有1.60mg/l山楂酸，by-oa溶液和by-oa-ck溶液中均不含有山楂酸。其中by-ua7-syncamaa45溶液中含有1.4mg/l山楂酸和2.6mg/l科罗索酸，by-ua7溶液和by-ua7-ck溶液中均不含有山楂酸和科罗索酸。用3.2生物反应器发酵方法时工程菌by-oa-syncamaa45能产384.3mg/l山楂酸，工程菌by-ua7-syncamaa45产35.8mg/l山楂酸和141.0mg/l科罗索酸。该结果表明：将syncamaa45基因导入可产生齐墩果酸(oa)的酿酒酵母菌后，重组菌可以产生山楂酸；将其导入可产生齐墩果酸(oa)与乌索酸(ua)的酿酒酵母菌中后，重组菌可以产生山楂酸和科罗索酸，而未导入该基因的菌株均不可以产生山楂酸和科罗索酸。表明，camaa45可以以齐墩果酸为底物制备山楂酸，还可以以乌索酸为底物制备科罗索酸。由于齐墩果酸与乌索酸均为三萜化合物，齐墩果酸为β-香树脂(β-amyrin)型，乌索酸为α-香树脂(α-amyrin)型，与齐墩果酸相比，山楂酸为仅在齐墩果酸2位发生α-羟化得到的产物，与乌索酸相比，科罗索酸为仅在乌索酸2位发生α-羟化得到的产物，表明，camaa45为三萜2位α-羟化酶。<110>中国科学院天津工业生物技术研究所<120>来源于积雪草的蛋白及在制备山楂酸和科罗索酸中的应用<130>gncln171205<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>475<212>prt<213>积雪草（centellaasiatica(l.)urb.）<400>1metaspleupheleuproleuvalpheleuservalileleuileval151015leuilephelysproargseraspglyasplyslysleuproprogly202530serpheglytrpproilemetglygluthrileglupheleuphegly354045hisprolysgluphevalasplysargmetlyslystyrserproasp505560ilephelysserasnileleuglyglulysthralaileilecysgly65707580progluglyhislyspheleupheserasngluglulysphephethr859095valpheargprohisproileglnargleupheargsertyrasnasn100105110lysseralaproaspproproproserglyalaglyserlysaspasp115120125vallysserilelysglnproglyphephelysproglualaleuser130135140argpheileglyvalileglualathrileglnglnhisleuargala145150155160histrpgluglylysaspthrvalglualatyrproleuserlysser165170175leuthrleuthrleusercysargphepheleuglyileaspasnpro180185190gluargilealaargleuvalhismetpheaspaspilethrleugly195200205methisserileileserasnvalproglythrvalphetyrargala210215220lysasnalaalaalaalavalarglysgluleuleucysvalilelys225230235240glulyslysglnglumetalaalaglylyslysalaglnaspvalleu245250255serhismetileserpheseraspproserthrglylysphemetpro260265270gluleugluvalalaasplysmetmetglyleuilethralaglytyr275280285serthrvalalathrsermetalapheleumetlysphevalglyglu290295300serproalailetyrasnlysileargalagluglnilegluleuala305310315320gluserlysasnproglygluproleuthrtrpvalaspileglnlys325330335leulystyrsertrpglnalametcysgluthrmetargleuvalpro340345350proleuglnglythrphearggluvalileasngluphethrtyrala355360365glytyrthrvalprolysglytrplysvaltyrtrpthrvalserthr370375380valhismetasnprolystyrpheproasnproglulyspheasppro385390395400serargtyrglugluglylysileserthrprotyrthrtyrvalpro405410415pheglyglyglyproargmetcysproglylysglutyralaargile420425430alavalleuthrpheleuhishisvalvalarglystyrlystrpglu435440445valleupheproaspglulysvalileglyaspmetmetproalapro450455460glulysglyleuproileargleuhisprohis465470475<210>2<211>2186<212>dna<213>人工序列<220><223><400>2agtgatcccccacacaccatagcttcaaaatgtttctactccttttttactcttccagat60tttctcggactccgcgcatcgccgtaccacttcaaaacacccaagcacagcatactaaat120ttcccctctttcttcctctagggtgtcgttaattacccgtactaaaggtttggaaaagaa180aaaagagaccgcctcgtttctttttcttcgtcgaaaaaggcaataaaaatttttatcacg240tttctttttcttgaaaatttttttttttgatttttttctctttcgatgacctcccattga300tatttaagttaataaacggtcttcaatttctcaagtttcagtttcatttttcttgttcta360ttacaactttttttacttcttgctcattagaaagaaagcatagcaatctaatctaagttt420taattacaaaacctggtaaaacaatggatttgtttttaccattggttttcttgtctgtta480ttttgatcgttttgatttttaagccaagatctgatggtgacaagaaattgcctccaggtt540cttttggttggccaatcatgggtgaaactatcgaattcttgttcggtcatccaaaggaat600tcgttgataagagaatgaagaaatactctccagatatttttaagtcaaacatcttgggtg66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