一种抗家禽IgYFc片段的单克隆抗体及应用的制作方法

本发明属于动物分子生物学、免疫学技术应用领域，具体涉及一种抗家禽igyfc片段的单克隆抗体及应用。

背景技术：

igy(immunoglobulinofyolk)是存在于鸟类、爬行类和两栖类动物中的、功能与igg相当的一种免疫球蛋白，其中以禽类igy研究最多。1893年klemperer等首次阐明了鸡的被动免疫，指出母源特异性抗体通过蛋黄转移的途径实现对新生鸡的保护作用。1969年leslie和clem将存在于禽类及卵黄中的抗体正式命名为igy。然而这一发现并没有获得重视，一直到二十世纪八十年代，关于igy的特异性和研究成果才随着商品试剂的广泛使用而受到关注从而被广泛应用。

igy有2条重链和2条轻链，此结构与哺乳动物的免疫球蛋白igg类似。完整型的igy分子轻链包括1个可变区(v区)和1个恒定区(c区)，v区是用以识别抗原和决定抗体特异性的部位，而c区氨基酸的数目和顺序则相对恒定。重链包括1个可变区和4个恒定区(ch1、ch2、ch3、ch4)。完整型igy分子的ch3和ch4区域与igg的ch2和ch3具有一定的同源性，完整型igy分子量约为180kda，其沉降系数为7.8s，重链62～67kda，轻链22～25kda。

已有研究报道纯化了鸡、鹅、鸵鸟等19种鸟类的igy，并制备了相应的兔抗禽类igy的igg抗体(杨帆，19种抗禽类igy多克隆抗体的制备和标记)。另外，本实验室曾制备了小鼠抗鸡igyfc单克隆抗体，具有良好的特异性和敏感性，并应用于鸡的主要传染病的免疫抗体水平检测或疾病的快速诊断，已申报获批了4项国家发明专利(一种单克隆抗体，包含该单克隆抗体的检测试剂盒及应用，专利授权号zl200510011521.8；鸡新城疫抗体免疫胶体金快速检测试剂盒及应用，专利授权号zl200710169103.0；一种鸡禽流感疫苗免疫与病毒野毒感染的胶体金免疫层析快速鉴别诊断试剂盒及应用，专利授权号zl200710051442.9；鸡毒霉形体抗体免疫胶体金快速检测试剂盒及应用，专利授权号zl200710169106.4)，但上述多克隆抗体或本实验室曾研制的小鼠抗鸡igyfc单克隆抗体均只是针对单一禽类igy的抗体，无法实现对多种禽类igy的检测，因此使其应用具有较大的局限性。

本发明目的在于通过扩增特异性鸭igyfcch3ch4基因片段，获得纯化的原核表达重组蛋白，应用杂交瘤单克隆抗体技术，制备一种既可检测鸭igy也可检测其他禽类如鸡、鹅、鸽、鸵鸟等igy的单克隆抗体。通过elisa和westernblot方法进行检测，结果表明所制备的小鼠抗家禽igyfc片段的单克隆抗体不仅可与鸭血清反应，还可与鸡、鹅、鸽和鸵鸟等禽类血清发生阳性反应，而与猪、兔和牛等哺乳动物血清不反应。说明所制备的抗家禽igyfc片段单克隆抗体可作为一种抗禽类igy的通用抗体试剂，既可以用于相关领域的科学研究中，又可用于elisa和胶体金免疫层析技术等，研制检测禽类传染病抗体的elisa或者胶体金试纸条等试剂盒。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一株能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株lzlphz，保藏编号为：cctccno：c2015188。

本发明的第二个目的是获得一种特异性强的抗家禽igyfc的单克隆抗体。

本发明最后一个目的在于提供了杂交瘤细胞株lzlphz或其分泌的单克隆抗体在制备家禽传染病抗体检测试剂盒中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

本发明以纯化后的重组蛋白gst-ch3ch4作为免疫原免疫5～8周龄的balb/c小鼠，通过杂交瘤筛选出阳性杂交瘤细胞，连续克隆化3次以上，直至所有被检孔均呈阳性反应，才完成该杂交瘤细胞的建株工作，即获得了能稳定传代并分泌预期抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤子细胞系lzlphz已于2015年11月13日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：杂交瘤细胞株lzlphz，cctccno：c2015188，地址：中国武汉武汉大学。

该细胞系的染色体计数结果显示，sp2/0的染色体数为70条，小鼠脾细胞为40条，而杂交瘤细胞的染色体数目在80～94之间，高于两亲本细胞的染色体数目，说明融合细胞的确是sp2/0细胞与脾细胞的杂交产物。该细胞在含20％新生牛血清的rpmi-1640培养基中生长良好。

一种抗家禽igyfc的单克隆抗体，该单克隆抗体通过杂交瘤细胞株lzlphz(cctccno：c2015188)分泌获得。

杂交瘤细胞株lzlphz或其分泌的单克隆抗体在制备家禽传染病抗体检测试剂盒中的应用，包括利用该细胞株或其分泌的单抗制备成家禽血清检测试剂盒。

所述的家禽包括但不限于：鸡、鸭、鹅、鸽和/或鸵鸟。

elisa和westernblot方法检测结果表明所制备的抗家禽igyfc片段的单克隆抗体不仅可与鸭血清反应，也可与鸡、鹅、鸽和鸵鸟等多种禽类血清发生反应，而不与猪、兔和牛等哺乳动物血清反应。说明所制备的抗家禽igyfc片段单克隆抗体可作为一种抗多种禽类igy的通用型抗体试剂，可以进行酶标记、荧光素标记或生物素标记后应用于相关的科学研究，也可建立如elisa、胶体金试纸条等方法广泛用于家禽免疫抗体水平的检测和兽医临床禽类传染病的快速诊断。

与现有技术相比本发明具有如下优点：

本发明作为一种抗家禽igy的通用型单克隆抗体试剂，可与多种家禽(鸡、鸭、鹅、鸽和鸵鸟)igy进行反应，而不与哺乳动物(猪、兔和牛)igg发生反应，具有特异性强，灵敏度高的特点。

附图说明

图1是本发明的总体技术路线图。

图2是本发明鸭igyfcch3ch4基因扩增、双酶切鉴定图和blast比对图。

图3-1为gst-ch3ch4的sds-page检测和westernblot鉴定图

图3-2为his-ch3ch4的sds-page检测和westernblot鉴定图

图4为本发明制备出的杂交瘤细胞染色体计数图。

图5为本发明制备的小鼠抗igyfc片段单克隆抗体纯化后的sds-page电泳检测图。

图6为本发明制备出抗igyfc片段单克隆抗体与禽类血清和哺乳动物血清交叉反应性的westernblot鉴定图。

m：蛋白marker，1：鸡血清2：鸭血清3：鸽血清4：鹅血清5：鸵鸟血清6：猪血清7：兔血清8：牛血清9：his-ch3ch4重组蛋白。

图7为小鼠免疫后的血清抗体效价检测示意图。

图8为单克隆抗体亲和力的分析示意图。

具体实施方式

实施例1：

用于制备抗家禽igyfc片段单克隆抗体的重组蛋白获得

1、igyfcch3-ch4基因片段的获得

本发明依据包含有鸭igyfcch3-ch4基因片段的pmd-18t-ch1-ch2-ch3-ch4质粒(pmd-18t-ch1-ch2-ch3-ch4质粒为鸭igyfcch1-ch2-ch3-ch4基因片段经pcr扩增后直接连接到pmd-18t载体中)，设计特异性引物(上游引物p1：tatggatcctaatccggcgcccagagctgcag，下游引物p2：cccaagctttgcgtgcttggcgatgctcttgc)，p1位于启动子上游，引入了bamhi位点，p2包含有终止密码子，引入了hindiii位点，酶切位点用下划线标出，两个引物之间包含有ch3ch4基因的完整阅读框。采用pcr方法扩增了鸭igyfcch3ch4基因片段，分子量大小为666bp，将回收的目的基因产物连接到克隆载体pmd18-t后，测序结果通过与genbank中鸭igycdna(登录号为x65218.1)进行blast比对，结果显示igyfcch3-ch4基因核苷酸序列同源性为99％，存在3个碱基的突变，且均为无义突变，其氨基酸同源性为100％(图2)。

2、表达载体pet-28a-ch3ch4和pkg-ch3ch4的构建

用hindiii和bamhi分别双酶切回收pcr产物igyfcch3-ch4、原核表达载体pet-28a(+)和pgex-kg，分别连接后转化到e.colidh5α感受态细胞中，并将转化菌涂布含氨苄青霉素的lb琼脂平板37℃培养过夜。挑数个单菌落培养过夜后用碱裂解法小量制备质粒，进行酶切分析和pcr扩增鉴定。筛选得到阳性重组质粒pet-28a-ch3ch4和pegx-kg-ch3ch4，测序结果显示读码框正确，序列未发生突变。本发明中用到的质粒和感受态细胞均购于大连宝生物工程有限公司，使用到的试剂盒均购自takara。所使用的分子生物学方法参见文献：萨姆布鲁克j，弗里奇ef，曼尼阿蒂斯t主编(金冬雁，黎孟枫等译)，分子克隆实验指南，第二版，北京科学出版社，1992年版中提供的方法进行。

3、重组蛋白pet-28a-ch3ch4和pkg-ch3ch4的表达和纯化

将构建好的表达质粒pet-28a-ch3ch4和pgex-kg-ch3ch4转入e.coli感受态细胞bl21codonplus中，涂布到含有相应抗生素(氯霉素25μg/ml，四环素10μg/ml，氨苄青霉素60μg/ml)的lb平皿上，37℃培养16-18h，长出单菌落。挑取数个单菌落于加有相应抗生素的3mllb中培养过夜，进行细菌活化。将过夜培养物按比例1:50稀释入新鲜的lb培养基中，37℃中振荡培养至od600＝0.5-0.8时，加入终浓度为1mmol/l异丙基硫代-β-d-半乳糖苷(iptg)，继续培养诱导表达5h。离心收集经诱导表达200ml重组菌菌体，用预冷的buffera(含终浓度为1mmol/lpmsf)重悬，4℃搅拌下作用30min；4℃下用压力细胞破碎仪破碎菌体，直至透亮；4℃12000r/min离心30min，收集沉淀。

通过sds-page电泳检测，gst-ch3ch4蛋白主要存在于破碎后菌液的包涵体中(图3)，按包涵体纯化方法进行gst-ch3ch4蛋白的纯化，具体步骤如下：1、洗涤：沉淀依次用10mmol/lpbs(ph7.4)，2.0mol/l尿素，含0.1％tritonx-100的10mmol/lpbs(ph7.4)以及buffera洗涤，4℃12000r/min离心10min。2、变性：沉淀用19.7mlbuffera重悬，用磁力搅拌器剧烈搅拌，边搅拌边分别加入0.3ml20％skl和10μl的dtt，剧烈搅拌30min使之溶解至清亮，室温静置1～2h。4℃12000r/min离心10min，取上清，弃沉淀。3、复性：上清用磁力搅拌器轻微搅拌，边搅拌边分别加入210μl20％peg-4000(终浓度为0.2％)，420μl50mmol/l氧化型谷胱甘肽(终浓度为1.0mmol/l)，420μl100mmol/l还原型谷胱甘肽(终浓度为2.0mmol/l)，使之充分混匀，4℃避光作用2h或过夜。4、透析：复性液转至透析袋中，用透析液透析2～3d，每4～6h换透析液一次。透析彻底后4℃用peg-20000包埋浓缩。将复性后的gst-ch3ch4融合蛋白进行sds-page检测和westernblot鉴定。纯化后获得gst-ch3ch4蛋白。

通过sds-page电泳检测，his-ch3ch4蛋白主要存在于破碎后菌液的上清液中(图3)，按上清液纯化方法，采用his蛋白纯化柱(hitrapaffinitycolumns,amershambiosciences公司产品)进行亲和层析纯化。

将获得的蛋白用核酸蛋白测定仪分别检测蛋白浓度，用ep管分装1ml/支，-80℃保存。his-ch3ch4用于建立elisa方法检测免疫血清中和阳性孔上清中的特异性抗体，gst-ch3ch4作为免疫原免疫小鼠。

实施例2：

骨髓瘤细胞的获得及饲养细胞的准备

本发明所使用的缺陷型sp2/0骨髓瘤细胞(sp2/0骨髓瘤细胞购自卫生部武汉生物制品所)由本实验室传代后保存，复苏后注射5～8周龄balb/c小鼠，待长出瘤后用人源淋巴细胞分离液分离获得原代瘤细胞，用1640完全培养基(含20％新生牛血清)培养待用。

取1只空白balb/c小鼠，摘除眼球放血，用1.5ml离心管收集血液(作为阴性对照)，直至小鼠失血而死，将处死后的小鼠用75％的酒精浸泡消毒5min后，淋干酒精，腹部朝上用针头固定在垫有灭菌报纸的瓷盘里，用灭菌的镊子提起小鼠腹部皮肤，用灭菌的剪刀在提起部位剪开一小口，小心剥去皮肤，使小鼠胸腹部完全暴露；在小鼠腹膜中央剪开一小口，将2.5ml1640基础培养基从剪开的小口注入小鼠的腹腔，吹吸数次后，转移至50ml离心管，重复一次以尽可能多的获得腹腔巨噬细胞；剥去小鼠的腹膜，交叉固定两后肢，充分暴露脾脏；分离脾脏，用剪刀剪碎脾脏置于灭菌的玻璃匀浆器中；取5ml1640基础培养基，匀浆，直至无红色组织块，补加5ml1640基础培养基，混匀后垂直静置1min，待白色的结缔组织沉到管底后，小心取出上层细胞悬液，转移至50ml离心管中，重复一次后，1200r/min水平离心5min，弃上清；用10ml1640基础培养基重悬离心一次，弃上清；用75ml含hat的1640完全培养基重悬细胞，放入37℃co2培养箱备用。

实施例3：

抗家禽igyfc片段杂交瘤细胞株的获得

将获得的重组蛋白gst-ch3ch4表达后纯化，作为免疫原免疫5～8周龄的balb/c小鼠，首次免疫使用50～100μg蛋白与弗氏完全佐剂(fca)乳化后免疫，后期采用50～100μg蛋白与不完全弗氏完全佐剂(fia)乳化后免疫，每只小鼠颈背部皮下多点注射共0.2ml，加强免疫时使用不含佐剂的100～200μg蛋白腹腔注射0.2ml。免疫后七天断尾采血建立elisa方法检测血清抗体效价(图7)，对于血清效价达到1:10000以上的小鼠，在融合前三天进行加强免疫准备用于融合。

融合时，取2×10⁷个骨髓瘤细胞与制备的免疫脾细胞混合，用10ml1640基础培养基重悬，1500r/min，10min；将装有混合细胞的离心管弃去上清后，倒扣在吸水纸上淋干水分；用吸管吸取1ml预热至37℃的，分子量为1450的50％peg，37℃水浴下，在1min内将peg缓缓加入混合细胞内，边加边轻轻搅拌，加入后将离心管垂直静置30s；用5ml吸管吸取预热至37℃的1640基础培养基，缓缓加入融合细胞内边加边轻轻搅拌使细胞团块分散，先用1min加1ml，再用1min加2ml，再用1min加2ml，之后用1min加入5ml，加完10ml后，接着沿管壁慢慢加入35ml基础培养基，然后轻轻上下反复颠倒数次；1200r/min，水平离心5min，弃上清，用75ml含有饲养细胞的完全培养基将融合细胞轻轻悬起；滴加到96孔细胞培养板内，2滴/孔，15ml/块，置37℃co2培养箱培养。第7d补加含1％ht的1640完全培养基；10d左右，集落长至孔底1/4大小，即可进行培养上清中的抗体检测。

待融合细胞集落长至培养孔1/4，培养基略变黄时，进行抗体检测。用重组蛋白his-ch3ch4建立elisa方法筛选出分泌抗igyfc片段单克隆抗体的阳性孔。对筛选出来的阳性孔立即用有限稀释法进行克隆、筛选。经过3～4次克隆，直至所有被检孔均呈阳性反应，才完成该杂交瘤细胞的建株工作，即获得了能稳定传代并分泌预期抗体的杂交瘤细胞株。筛选出的小鼠抗igyfc片段单克隆杂交瘤细胞系，申请人将其命名为lzlphz，该杂交瘤细胞株已于2015年11月13日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：杂交瘤细胞株lzlphz，cctccno：c2015188，地址：中国武汉武汉大学。对该细胞系进行了染色体计数，结果显示，sp2/0的染色体数为70条，小鼠脾细胞为40条，而杂交瘤细胞的染色体数目在80～94之间，高于两亲本细胞的染色体数目，说明融合细胞的确是sp2/0细胞与脾细胞的杂交产物(图4)。

实施例4：

抗家禽igyfc片段单克隆抗体的获得

1、制备抗家禽igyfc片段单克隆抗体的腹水

将该细胞系注射5～8周龄balb/c小鼠腹腔，生产单克隆抗体。

2、抗家禽igyfc片段单克隆抗体腹水的纯化

采用二氧化硅吸附法对腹水进行预处理：取20ml腹水与适量的二氧化硅粉末混合(150mg/ml)加入等体积的巴比妥缓冲液，室温下磁力搅拌1h，静置30min于4℃冰箱中，4℃离心3000r/min，10min，取上清。上清中加入2倍体积上清的0.06mol/l，ph5.0的乙酸钠缓冲液后，用0.1mol/l的hcl调ph至4.5。

于室温下搅拌，按33μl/ml稀释前腹水，在30s内滴加辛酸，完全加入后室温搅拌30min，然后转入4℃冰箱充分沉淀2h，4℃离心12000r/min，30min，弃沉淀。取上清，经0.45μm滤膜过滤，加入1/10体积的0.1m的pbs(即10×pbs)ph7.4后，用1mnaoh调ph至7.4，在冰浴搅拌下(30min)缓慢加入(按0.277g/ml的量)硫酸铵固体(最终饱和度为45％)，4℃静置2h使之充分沉淀，4℃离心12000r/min，30min，弃上清。沉淀用原腹水体积的0.01m的pbs重悬，装入透析袋，用50倍体积的0.01mph7.4pbs于4℃透析过夜。4℃离心12000r/min，30min，除去不溶性沉渣。将获得的单抗用核酸蛋白测定仪检测其蛋白浓度为1.5mg/ml(10ml)，用ep管分装1ml/支，-80℃保存，用于以下实施例。

本发明所获得的腹水纯化后经sds-page检测可见一条带在50kda(重链)，一条在26kda(轻链)(图5)。

实施例:5：

抗家禽igyfc片段单克隆抗体的鉴定

1、抗家禽igyfc片段单克隆抗体效价的测定

采用间接elisa法对实施例4纯化后的单克隆抗体的效价进行测定，以纯化的重组蛋白his-ch3ch4作为包被抗原，包被浓度为2μg/ml。待检单克隆抗体经封闭液倍比稀释后作为一抗(起始稀释度为2000倍，用pbs稀释)，稀释至适当浓度的hrp羊抗鼠igg为二抗。以与阴性od450值比大于2.1判为阳性，单克隆抗体呈阳性时的最大稀释倍数作为该抗体的效价。本发明制备出的单克隆抗体效价可达1:5.12×10⁵。

2、抗家禽igyfc片段单克隆抗体亚型的确定

采用thermoscientificpierce公司elisa小鼠单克隆抗体分型试剂盒检测。经检测该单克隆抗体亚型为igg2a。

3、抗家禽igyfc片段单克隆抗体亲和性测定

纯化的重组蛋白his-ch3ch4包被浓度分别为10μg/ml，5μg/ml，在单抗稀释倍数达到1:160000时od450值为1.0左右(图8)，说明本发明制备的单克隆抗体亲和性高。

实施例6：

杂交瘤细胞株lzlphz或其分泌的单克隆抗体在制备家禽血清检测试剂盒中的应用：

分别对鸡、鸭、鹅、鸽、鸵鸟、猪、兔和牛血清作1:20稀释后进行elisa和westernblot检测，同时设置阴阳性对照。在elisa检测中，当该单克隆抗体作1:500倍稀释时，检测鸡、鸭、鹅、鸽和鸵鸟血清的od450值分别为0.735、0.826、0.902、0.744和0.782，表现为强阳性反应，而检测猪、兔和牛血清的od450值分别为0.055、0.057、0.041，均为阴性反应。在westernblot检测中，该单克隆抗体除了与鸭血清反应外，与鸡、鹅、鸽和鸵鸟的血清均存在明显的交叉反应，而与猪、兔和牛血清不反应(图6)。可见所制备的单克隆抗体能与多种禽类血清发生反应，说明该单抗可用于多种禽类抗体的检测。

应用双抗夹心elisa法检测该单抗对鸡、鸭血清的检测灵敏度。以该单抗(5μg/ml)作为包被抗体，4℃包被过夜，以1％脱脂奶37℃封闭1h，再将待检鸡血清、鸭血请倍比稀释加入到elisa板中，最后再加入商品化的hrp标记羊抗鸡igy或鸭igy的酶标抗体，37℃孵育45min，显色20min终止后测其od450，结果表明检测鸡血清、鸭血清的灵敏度分别为1:2¹⁰和1:2¹¹。

上述结果表明本发明所制备单克隆抗体可与鸭、鸡、鹅、鸽和鸵鸟等多种禽类血清反应，不与猪、兔和牛等哺乳动物的血清发生反应。说明所制备的鼠抗igyfc片段单克隆抗体是一种抗多种禽类igy的通用型单克隆抗体，可以广泛应用于相关领域的科学研究，并可用于多种禽类免疫抗体水平的检测或者禽类传染病的快速诊断。

尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明的保护范围内。