高保真猪繁殖与呼吸综合症病毒弱毒株及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高保真猪繁殖与呼吸综合症病毒弱毒株及其应用。

背景技术：

猪繁殖与呼吸综合症(porcinereproductiveandrespriratorysyndrome，prrs)又称蓝耳病，是一种由猪繁殖与呼吸综合症病毒(prrsv)引起的重要的猪烈性传染病，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。prrs灭活疫苗基本无效，prrs弱毒疫苗具有免疫保护快、效力高等优势，是当前我国防控prrs的唯一手段。但是，prrs弱毒疫苗株易于变异、遗传稳定性差，从而导致免疫原性易丢失、毒力易于返强。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株高保真猪繁殖与呼吸综合症病毒弱毒株，该毒株突变率低、遗传稳定性较高，传100代次后，仍然保持原有免疫原性和毒力，该毒株对于高致病性蓝耳病具有良好保护力。

本发明的另一目的是提供猪繁殖与呼吸综合症病毒弱毒疫苗，该弱毒疫苗对于高致病性蓝耳病具有良好保护力，安全性更高。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一种高保真猪繁殖与呼吸综合症病毒弱毒株，是猪繁殖与呼吸综合症病毒prrsv-njrb株，其微生物保藏号是：cgmccno.13800。

在本发明中，所述弱毒株的orf5基因的核苷酸序列如seqidno:1所示。

在本发明中，所述弱毒株的nsp2基因的核苷酸序列如seqidno:2所示。

本发明还提供所述高保真猪繁殖与呼吸综合症病毒弱毒株病毒液的制备方法，包括如下步骤：采用marc-145细胞增殖权利要求1所述高保真猪繁殖与呼吸综合症病毒弱毒株，裂解细胞，离心取上清液，得到病毒液。

本发明还提供猪繁殖与呼吸综合症弱毒疫苗，活性成分为所述猪繁殖与呼吸综合症病毒弱毒株。

本发明还提供所述猪繁殖与呼吸综合症弱毒在制备猪繁殖与呼吸综合症弱毒疫苗方面的应用。

本发明相对于现有弱毒株及其疫苗的有益效果：

1.本发明通过诱变剂的加压，筛选到了高保真猪繁殖与呼吸综合症病毒弱毒株，该毒株与prrsvnj株相比，改变了prrsvnj株组织嗜性，显著降低了对肺脏组织的嗜性；体外保真性能提高5倍以上，遗传稳定性好；安全性更高，免疫猪体内连续传代5次，主要保护性抗原基因orf5和关键毒力基因nsp2突变频率下降3倍，解决了现有prrsv活疫苗由于遗传稳定性差导致的免疫原性易丢失、毒力易于返强的世界性难题。本发明高保真猪繁殖与呼吸综合症病毒弱毒株种毒连续传代100代后，仍然保持原有免疫原性和毒力，仍然可以用于制备弱毒疫苗，显著降低了生产成本、提高了生产效率。

2.采用本发明弱毒疫苗免疫后，能够为接种动物提供100％的保护。

附图说明

图1是orf5和nsp2基因pcr扩增产物电泳图，其中m为dnamarker，1，2，3为orf5扩增片段；4，5，6为nsp2扩增片段。

图2是高保真毒株prrsv-njrb株接种pam细胞cpe观察图，a：prrsv-njrb株；b：prrsv-nj株；c：空白对照。

图3是prrsv-njrb株仔猪体内组织嗜性鉴定图，**表示p＜0.01。

具体实施方式

实施例1prrsvnj株在marc-145细胞上传代致弱

1.细胞培养

marc-145细胞生长在细胞培养液中，在37℃、5％co2培养箱中培养。marc-145细胞长成单层后用于接种病毒。细胞培养液：含10％(体积百分浓度)灭活(56℃处理30min)的犊牛血清和双抗(青霉素、链霉素，浓度均为100u/ml)的dmem细胞培养液。

2.prrsvnj株的培养

prrsvnj-a株是从南京某急性发病猪群中分离的美洲型prrsv强毒(公开于郑其升,李鹏,曹瑞兵,候继波,陈溥言等，共表达prrsv修饰的gp5与m蛋白的重组改良型痘苗病毒安卡拉株的构建及其生物学特性，生物工程学报，2008,24(5):766-773)。在本发明中将公开于“共表达prrsv修饰的gp5与m蛋白的重组改良型痘苗病毒安卡拉株的构建及其生物学特性”中的prrsvnj-a株作为种毒。另外，在本发明中，将prrsvnj-a株缩写为prrsvnj株。将prrsvnj株种毒在长成单层的marc-145细胞上连续传代，当细胞病变达到70％～80％时收获病毒，反复冻融3次，再进行继续传代，直至第100代。在第60代以后每隔10代，挑选1～2个噬斑病毒，分别标记为nj代次-1、nj代次-2。用仔猪对各代次病毒进行毒力测定，具体方法如下：将各代次病毒接种5头仔猪，每头接种1ml(病毒含量见表1)，观察体温及发病、死亡的仔猪数量(结果见表1)。结果显示：prrsvnj株f80以后毒力显著下降，均为弱毒株。

表1prrsvnj株不同代次对仔猪的致病性测定结果

实施例2高保真prrsv弱毒株培育及体外鉴定

1.prrsv种毒化学诱变连续传代

诱变连续传代：采用细胞培养液(成分同实施例1中)培养marc-145细胞至70％融合，然后加入终浓度为200μm的诱变剂ribavirin(病毒唑，购自sigma公司)预处理2h，去掉培养液，按照moi为1加入prrsvnj株f80代(prrsvnj株种毒采用marc-145细胞传代80代后获得的病毒，该病毒为弱毒株)，感染1h，pbs缓冲液洗两遍；然后，加含有200μm诱变剂的细胞培养液(成分同实施例1中)继续培养，最后收获病毒。病毒按照上述方法连续传代20代。

同时设立对照组，对照组处理中不加入诱变剂，其他同诱变连续传代方法。

2.高保真prrsv种毒噬斑纯化

将本实施例标题1中经诱变连续传20代后的病毒进行克隆纯化，具体方法如下：将marc-145细胞在六孔板中培养至单层；用细胞培养液(成分同实施例1中)对待纯化病毒作适当稀释，接种前弃去细胞培养液，用5ml的pbs缓冲液或细胞培养液冲洗单层细胞，每孔加0.2ml病毒稀释液，对照组中用细胞培养液代替，置37℃二氧化碳培养箱中吸附1h，每15min摇动一次，以便使病毒均匀分布；pbs缓冲液洗涤未吸附的病毒；取2倍浓缩的细胞培养液加入等体积的2％琼脂溶液(预热)中，每孔加入1ml，置平台待冷却凝固后于37℃二氧化碳培养箱中倒置培养2～3d；以弯头吸管在琼脂层下吸取若干蚀斑收获病毒，然后分别接种到预先制备好的单层细胞的培养瓶中培养，再进行2轮噬斑纯化，挑选能够在marc-145细胞生长、但是不能在pam(猪肺泡巨噬细胞)上生长的克隆病毒，最终获得猪繁殖与呼吸综合症病毒prrsv-njrb株。将此处通过噬斑纯化获得的病毒作为种毒。prrsv-njrb株种毒的orf5基因的核苷酸序列如seqidno:1所示，nsp2基因的核苷酸序列如seqidno:2所示。

3.高保真prrsv毒株鉴定

将prrsv-njrb株种毒采用marc-145细胞传代至第50代，获得prrsv-njrb株f50代，从中挑取50个克隆病毒；另外将prrsvnj株f100代(prrsvnj株种毒传代100代获得的病毒，缩写为未诱变病毒)采用marc-145细胞同样传代至第50代，并从未诱变病毒f50代中挑取50个克隆病毒。

(1)trizol法提取病毒rna

分别提取上述100个克隆病毒的rna。具体方法如下：将收获的噬斑病毒400μl加入600μl的trizol试剂(takara)，充分裂解；加氯仿0.2ml，轻摇15s；室温静置5min，4℃、12000g离心15min，取上清无色水相(约500μl)至1.5mlrnase-freeep管中，加500μl异丙醇，上下颠倒ep管混匀，室温静置10min；4℃、12000g离心10min，弃去上清，采用1ml75％乙醇水溶液(depc水配制)洗涤，4℃、12000g离心10min；去上清，室温干燥10min，加rnase-freedh2o(takara)20μl溶解，ep管内溶液即为rna样品。

(2)cdna的合成

应用primescript^tmcdna合成试剂盒(takara)将上述各病毒的rna进行反转录得到cdna，-70℃保存备用。

(3)高变基因片段pcr扩增

主要保护性抗原基因orf5和关键毒力基因nsp2是公认的prrsv全基因组中的高变区，我们分别设计扩增orf5和nsp2片段的引物，pcr扩增目的基因后送公司测序。

orf5片段上游引物：5’-atgaggtgggcaaccgttttag-3’；

orf5片段下游引物：5’-gtaatggaaaacgccaaaagcacct-3’。

nsp2片段上游引物：5’-ggtttggcagacataagtggt-3’；

nsp2片段下游引物：5’-ccttgagaaagcacataagctcc-3’。

pcr反应体系为：上、下游引物(10pmol/l)各1μl，dntps(2.5mmol/l)2.0μl，5×primestargxlbuffer5μl，cdna模板2.0μl，primestargxl长链高保真酶(1.25u/μl)0.5μl，灭菌双蒸水补足体积至25μl。pcr反应程序：95℃预变性5min；94℃变性反应30s，53℃退火反应45s，72℃延伸反应45s，进行35次循环，下一次循环退火温度比前一次循环退火温度增加0.2℃(退火温度的起始值是53℃)；最后72℃延伸10min。对照中用纯水替代cdna。反转录及pcr反应中所用试剂均来源takara公司。

采用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定pcr扩增产物。从图1，可以看出扩增产物orf5片段的大小约为725bp，nsp2片段的大小约为2962bp。将pcr产物送公司进行测序分析。结果见表2，prrsv-njrb株f50代(缩写为rb50)orf5基因的突变频率显著低于未诱变病毒，突变频率(即突变数/10³nt)由1.86下降至0.37，即下降5倍；氨基酸突变频率(即突变数/10³aa)从4.88降低至0.99。从表3可见，prrsv-njrb株f50代(缩写为rb50)nsp2基因的突变频率亦显著低于未诱变病毒，突变频率从2.06下降至0.2，下降了10.3倍；氨基酸突变频率从3.22降低至0.4，即即下降了8.05倍。以上结果表明，与未诱变病毒相比，prrsv-njrb株基因突变率显著下降、遗传稳定性显著提高，体外保真性能极显著提高。由于orf5是prrsv主要保护性抗原基因，nsp2是prrsv的关键毒力基因，因此prrsv-njrb株的免疫原性不易丢失、毒力不易反强。因此，prrsv-njrb株是高保真猪繁殖与呼吸综合症病毒弱毒株。

表2orf5基因及氨基酸序列在诱变病毒及未诱变病毒中突变频率比较结果

nt:核苷酸,aa:氨基酸.*p<0.05,**p<0.01.

表3nsp2基因及氨基酸序列在诱变病毒及未诱变病毒中突变频率比较结果

nt:核苷酸,aa:氨基酸.“*”表示p<0.05,“**”表示p<0.01。

将猪繁殖与呼吸综合症病毒prrsv-njrb株种毒，进行保藏，保藏信息如下：

参椐的生物材料(株)：prrsv-njrb；

分类命名：猪繁殖与呼吸综合症病毒porcinereproductiveandrespriratorysyndromevirus；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2017年5月24日；

保藏编号：cgmccno.13800。

实施例3高保真prrsv弱毒株组织嗜性鉴定

将prrsv-njrb株种毒分别接种pam(猪肺泡巨噬细胞)和marc-145细胞(moi＝1)，连续传代5次，观察每代次病毒cpe(细胞病变效应)变化，另收获不同代次病毒进行滴度测定。同时将prrsvnj株f80代采用相同方法传代5次，作为对照组。结果显示：prrsv-njrb株第一代毒njrbp1(是指种毒传1代后，得到的病毒)接种pam细胞未见cpe，而对照组出现典型cpe(图2)，prrsv-njrb株以后各代次也均未见cpe出现(结果未显示)。病毒滴度测定结果见表4。结果表明：prrsv-njrb株与prrsvnj株相比，改变了prrsvnj株组织嗜性，显著降低了对肺脏组织的嗜性。

表4prrsv-njrb株接种pam与marc-145细胞后病毒滴度比较结果

注：表4中njrbp1表示prrsv-njrb株种毒传1代后，得到的病毒，其他的依次类推；njp1表示prrsvnj株种毒传1代后，得到的病毒，其他依次类推。(表中log10表示病毒滴度取以10为底的对数)。

实施例4prrsv-njrb株仔猪体内连续传代遗传稳定性评价

1.试验用猪

筛选prrsv血清抗原、抗体双阴性仔猪。

血清抗原检测方法如下：采集30日龄仔猪血液样品，分离血清。血清提取总rna后采用primescript^tmcdna合成试剂盒(takara)反转录成cdna，应用prrsvorf5特异性引物(orf5上、下游引物)扩增，检测prrsv抗原。

orf5上游引物：5’-atgaggtgggcaaccgttttag-3’；

orf5下游引物：5’-gtaatggaaaacgccaaaagcacct-3’。

prrsv血清抗体应用idexx试剂盒(美国爱德士公司)检测，操作步骤按照说明书。

2.prrsv-njrb株在仔猪体内连续传代以评价遗传稳定性

将prrsv-njrb株种毒在仔猪体内连续传代5次，通过基因测序检测评价其遗传稳定性。将prrsv-njrb株种毒接种30日龄、prrsv血清抗原、抗体双阴性仔猪，每头仔猪接种2ml(10^6.0tcid50/ml)病毒液，接种后20天，从仔猪体内分离病毒，然后再传至30日龄、prrsv血清抗原、抗体双阴性仔猪，按照此方法在仔猪体内连续传代5次。最后一次传代时，每日观察临床变化，于接种后0d、7d、14d、21d、28d采集血液分离血清采用rt-pcr法(参照实施例2)检测病毒血症。接种后28天剖杀，取肺、支气管淋巴结、扁桃体进行组织病毒分离培养。将肺、支气管淋巴结、扁桃体组织病料碾磨捣碎后用无菌pbs缓冲液制成1：10的组织悬液，加青、链霉素，置4℃冰箱作用4h后，8000rpm离心20min；取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤除菌；取滤液接种于marc-145细胞单层，37℃吸附1h后换含2％fbs的dmem培养基，继续培养，每天观察cpe情况，当cpe达到75％以上时收获细胞毒液。该病毒液冻融三次后，接种marc-145细胞，挑取50个蚀斑克隆(对应于表5、6中的p5)，采用rt-pcr扩增orf5和nsp2基因，将扩增片段送公司测序，方法参照实施例2中标题3。采用上述相同方法将prrsvnj株种毒在仔猪体内连续传代5次后，挑取50个蚀斑克隆(对应于表5、6中的对照病毒)，采用rt-pcr扩增orf5和nsp2基因，将扩增片段送公司测序，作为对照组。

结果见表5、表6，prrsv-njrb株种毒在仔猪体内连传5代后发现，orf5基因(表5)突变频率显著低于对照病毒，突变频率由2.19下降至0.73，下降3倍，氨基酸突变频率从5.17降低至2.79。nsp2基因(表6)突变频率亦显著低于对照病毒，突变频率从2.48下降至0.39(即下降了6.4倍)，氨基酸突变从3.54下降至0.53(下降了6.7倍)。以上结果表明：prrsv-njrb株在仔猪体内连续传代时，遗传稳定性高，是高保真弱毒株。

表5prrsv-njrb株在仔猪体内连续传代5次后orf5突变频率比较结果

nt:核苷酸,aa:氨基酸.*表示p<0.05,**表示p<0.01.

表6prrsv-njrb株在仔猪体内连续传代5次后nsp2突变频率比较结果

nt:核苷酸,aa:氨基酸.*表示p<0.05,**表示p<0.01.

实施例5prrsv-njrb株免疫原性鉴定

将prrsv-njrb株种毒接种marc-145单层细胞，当细胞病变达到70％～80％时收获细胞培养物，反复冻融3次，离心取上清液作为prrsv-njrb株f1代病毒液；将f1代病毒接种marc-145细胞培养，同样待细胞病变达到70％～80％时收获细胞培养物，反复冻融3次，离心取上清液作为prrsv-njrb株f2代病毒液；以此类推，收获prrsv-njrb株f100代病毒液。测定prrsv-njrb株f100代病毒液滴度。按照相同方法，将prrsvnj株种毒采用marc-145单层细胞传代至第80代，得到prrsvnj株f80代病毒液。

将prrsv-njrb株种毒及其f100代病毒液、prrsvnj株f80代病毒液分别采用dmem培养基稀释至病毒含量为1.0×10^5.0tcid50/ml，作为以下接种试验中的疫苗。

将4～6周龄prrsv病毒血清抗原、抗体阴性仔猪20头，随机分为4组，第一组：高保真弱毒疫苗组(免疫prrsv-njrb株种毒)；第二组：高保真弱毒疫苗组(免疫prrsv-njrb株f100代)；第三组：对照病毒疫苗组(免疫prrsvnj株f80代)；第四组：空白对照组。免疫当天，第一组每头仔猪肌肉注射2mlprrsv-njrb株种毒(1.0×10^5.0tcid50/ml)，第二组每头仔猪肌肉注射2mlprrsv-njrb株f100代病毒液(1.0×10^5.0tcid50/ml)，第三组每头仔猪肌肉注射2mlprrsvnj株f80代病毒液(1.0×10^5.0tcid50/ml)，第四组每头仔猪肌肉注射2mldmem培养基。于免疫后28天肌肉注射攻毒用强毒prrsvnj株病毒液(10^6.0tcid50/ml)2ml，每日观察体温，记录临床症状及发病数量；分别于攻毒后0、7、14、21、28天采集血液检测病毒血症(rt-pcr，参照实施例2)，连续观察28天。攻毒后28天剖检，观察大体解剖。

发病猪判定标准：1)至少3日体温在41℃以上；或精神食欲下降，眼结膜炎，有咳嗽、喘等呼吸道症状；2)大体剖检中发现肺部出现片状实变；3)病毒血症，攻毒后用rt-pcr检测仔猪血清，prrsv病毒血症至少持续28日。符合以上两条，即可判为发病。

结果显示：免疫后，各组仔猪均正常，无发烧、厌食等临床症状。攻毒后，第一、第二组所有仔猪体温均正常，第三组有1头仔猪体温达到41°以上1天，第一、第二、第三组试验结束后未见临床发病症状，病理剖检结果显示为100％保护(5/5)。空白对照组于攻毒后3天，所有仔猪的体温均达到41℃以上，41℃以上最多累计达到10天；并且仔猪临床表现有厌食、咳嗽、呼吸困难等症状，攻毒后10天开始死亡，至试验结束时5头仔猪全部死亡，病理剖检符合临床发病标准。上述结果证明：prrsv-njrb株种毒连续传代100代后，仍然保持原有免疫原性和毒力，仍然可以用于制备弱毒疫苗，将显著降低了生产成本、提高了生产效率。

实施例6prrsv-njrb株仔猪体内组织嗜性鉴定

prrsv-njrb株病毒液制备方法同实施例5。

将4～6周龄prrsv病毒血清抗原、抗体阴性仔猪15头，随机分为3组，第一组：高保真弱毒株试验组；第二组：对照毒试验组；第三组：空白对照组。接种当天，第一组每头仔猪肌肉注射2mlprrsv-njrb株f100病毒液(1.0×10^5.0tcid50/ml)，第二组每头仔猪肌肉注射2mlprrsvnj株f80病毒液(1.0×10^5.0tcid50/ml)，第三组每头仔猪肌肉注射2mldmem培养基。于接种后14天剖检，采集肺脏、扁桃体、支气管淋巴结、肌肉组织，分离prrsv，realtimepcr定量分析病毒含量(t.opriessnig,n.e.mckeown,k.l.harmon,etal.porcinecircovirustype2infectiondecreasestheefficacyofamodifiedliveporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusvaccine.clinicalandvaccineimmunology,.2006,13(8),923–929.)。

结果显示(图3)：prrsv-njrb株接种仔猪后，病毒在扁桃体、支气管淋巴结、肌肉组织中增殖均良好，与对照病毒(prrsvnj株f80病毒液)相比无明显差异；而在肺组织中对照病毒肺组织中滴度为10^4.3±0.12tcid50/g，而prrsv-njrb株基本不能增殖，组织中病毒滴度为10^0.8±0.07tcid50/g，下降超过1000倍。该结果与体外检测prrsv-njrb株组织嗜性一致。

sequencelisting

<110>江苏省农业科学院

<120>高保真猪繁殖与呼吸综合症病毒弱毒株及其应用

<130>20170626

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<213>猪繁殖与呼吸综合症病毒

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