Ⅰ群血清4型禽腺病毒卵黄抗体的制备方法及其制品与流程

本发明涉及一种禽腺病毒卵黄抗体的制备方法，尤其涉及一种ⅰ群血清4型禽腺病毒卵黄抗体的制备方法，本发明还涉及所述方法制备得到的ⅰ群血清4型禽腺病毒卵黄抗体，属于ⅰ群血清4型禽腺病毒卵黄抗体的制备领域。

背景技术：

ⅰ群禽腺病毒血清4型(fowladenovirusgroupⅰserumtype4，fav-4)属腺病毒科，鸡腺病毒ⅰ型，可引发禽的心包积水-肝炎综合征。ⅰ群禽腺病毒血清4型具有明显的致病年龄段，对雏鸡的致病力最强，可通过接触水平及垂直传播，并造成巨大的经济损失。

禽类卵黄中的抗体(卵黄抗体，eggyolkantibodies，igy)主要是卵黄免疫球蛋白，与血清抗体相比，卵黄抗体具有许多优点：(1)无需采血，只需收集免疫种禽产下的蛋即可纯化得到卵黄抗体，符合现代动物保护规则；(2)有良好的稳定性，且耐热耐酸，常温下仍能保持一定的活性，鸡蛋贮存在4℃条件下6个月，igy活性损失很小；(3)安全、无残留、温和环保；(4)在生产上具有无可比拟的优越性：首先，产生有效免疫反应所需抗原量小，尤其是高度保守的哺乳动物蛋白质对种系发生学上距离较远的禽类通常有较强的免疫原性；其次，每个蛋大约含100mg以上的igy，一个月可达3g，相当于动物的10-20倍；卵黄中没有其他的ig，易于提纯。

因此，开发一种新的ⅰ群血清4型禽腺病毒卵黄抗体的制备方法，对于有效防治ⅰ群4型禽腺病毒的感染与爆发，预防ⅰ群4型禽腺病毒引起的禽心包积液-肝炎综合征，具有重要意义。

技术实现要素：

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种ⅰ群血清4型禽腺病毒卵黄抗体的制备方法，该方法对卵黄抗体的提取效果好，工艺简化，可规模化生产；

本发明所要解决的第二个技术问题是提供所述方法制备得到的ⅰ群血清4型禽腺病毒卵黄抗体，该卵黄抗体能够有效的防治ⅰ群血清4型禽腺病毒的感染与爆发。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先公开了一种ⅰ群血清4型禽腺病毒卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：(1)培养ⅰ群血清4型禽腺病毒，制备灭活疫苗；(2)将灭活疫苗免疫产蛋鸡，收获鸡蛋，分离卵黄；(3)从卵黄中提取卵黄抗体，即得。

其中，步骤(3)所述提取卵黄抗体包括：(a)向卵黄中加入醋酸盐缓冲液，混匀，调节ph，然后静置，取上清液；(b)向步骤(a)所取的上清液中加入辛酸，混合，静置，取上清液；(c)调节步骤(b)所取上清液的ph，过滤、浓缩，灭活，得到卵黄抗体半成品；(d)调整卵黄抗体半成品的抗体效价，过滤除菌，分装，即得。

步骤(a)所述醋酸盐缓冲液的浓度为0.12mol/l，ph值为5.0；优选的，所述醋酸盐缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液；所述醋酸盐缓冲液的用量是卵黄体积的4-9倍，优选为7-9倍，更优选为8-9倍，最优选为8倍；

步骤(a)所述调节ph为调节ph至4.8-5.4，优选为调节ph至5.2-5.4，更优选为调节ph至5.2；步骤(a)所述静置是2-8℃静置3-20小时，优选为4℃静置3-20小时，更优选为4℃静置15-20小时。

按照体积百分比计，步骤(b)所述辛酸的加入量为使辛酸的终浓度为1-3％；优选为使辛酸的终浓度为1.5-3％；更优选为使辛酸的终浓度为1.5％；步骤(b)所述静置的时间为15-20小时，静置的温度为2-8℃；所述混合的时间优选为2小时。

步骤(c)调节步骤(b)所取上清液的ph至7.2；步骤(c)所述过滤是依次用孔径为1.0μm、0.45μm的筒式滤芯过滤；所述浓缩是经截留分子量为10kd的中空纤维超滤柱进行浓缩10倍；按照体积百分比计，所述灭活是加入终浓度为0.01-0.1％的甲醛溶液，室温灭活24小时；优选为加入终浓度为0.05％的甲醛溶液，室温灭活24小时。本发明所述室温为20-25℃。

步骤(d)所述调整卵黄抗体半成品的抗体效价是将卵黄抗体半成品用ph7.2的磷酸盐缓冲液稀释为琼扩抗体效价≥1：4；所述过滤除菌是用孔径为0.22μm滤膜过滤除菌。

本发明ⅰ群血清4型禽腺病毒卵黄抗体的制备方法，步骤(2)所述免疫的程序包括：首先用步骤(1)制备的灭活疫苗肌肉注射产蛋鸡，每只1.0ml，进行基础免疫；基础免疫21日后，将产蛋鸡肌肉注射灭活疫苗(步骤(1)制备，下同)，每只2.0ml，进行加强免疫；加强免疫21日后，将产蛋鸡肌肉注射灭活疫苗，每只2.0ml，进行强化免疫；在强化免疫后根据抗体效价，每隔2-3个月将产蛋鸡再加强接种灭活疫苗1次，每只2.0ml，进行维持免疫；免疫接种结束后10日，每隔5日测定高免鸡蛋黄中抗体的效价，当抗体琼扩效价≥1:64时，收集高免蛋。

本发明ⅰ群血清4型禽腺病毒卵黄抗体的制备方法，步骤(1)所述灭活疫苗的制备包括：将ⅰ群血清4型禽腺病毒接种鸡肝癌(lmh)细胞进行培养，收获病毒液，灭活；将灭活病毒液与油佐剂混合、乳化，即得。其中，所述病毒液的病毒含量≥10^7.5tcid50/0.1ml；所述灭活为加入10％(体积比)的甲醛溶液，使甲醛溶液的终浓度为0.1％(体积比)，37℃灭活24小时；所述油佐剂与灭活病毒液的混合比例为：按照体积比计，油佐剂：灭活病毒液＝1：2.5；本发明所述ⅰ群血清4型禽腺病毒优选为ⅰ群血清4型禽腺病毒hy株。

本发明对卵黄抗体提取的工艺进行了优化。不同稀释液优化结果表明，在稀释度为1:8时，用注射用水或ph4.3的注射用水提取抗体的除脂率在81-86％；而用醋酸-醋酸钠缓冲液(0.12mol/l，ph值5.0)提取抗体的除脂率达到98％以上，且上清液澄清，卵黄沉淀呈胶质状，无流动性。电泳结果显示，醋酸-醋酸钠缓冲液提取的卵黄抗体仅在66kda和25kda处分别出现两条带，为igy的重链和轻链，并无杂蛋白条带；而用注射用水和ph4.3的注射用水提取的卵黄抗体，在35kda-45kda处均有杂蛋白条带。说明，经醋酸-醋酸钠缓冲液提取的卵黄抗体液更为纯净。

稀释度优化实验结果表明，卵黄液用醋酸-醋酸钠缓冲液(0.12mol/l，ph值5.0)分别作1:4-1:9稀释，当稀释度为1:7以上时，卵黄抗体除脂率达96％以上；但1:7稀释的上清液轻度浑浊，卵黄沉淀呈胶质状，有流动性；而1:8和1:9稀释的上清液澄清，卵黄沉淀呈胶质状，无流动性。sds-page电泳结果显示，稀释度为1:4-1:6的卵黄抗体提取液除在65kda和22kda处分别出现两条带，为igy的重链和轻链，在35kda-40kda处有杂蛋白条带；而稀释度为1:7-1:9的卵黄抗体提取液仅在65kda和22kda处分别出现两条带，并无杂蛋白条带，说明稀释度为1:7-1:9的卵黄抗体提取液更为纯净。综合考虑，本发明确定卵黄液用醋酸-醋酸钠缓冲液(0.12mol/l，ph值5.0)作1:8稀释。

ph值优化结果表明，卵黄液用醋酸-醋酸钠缓冲液(0.12mol/l，ph值5.0)作1:8稀释，当调ph值为4.8时，几乎无沉淀且浑浊；随ph值增大，上清液逐渐澄清，沉淀逐渐结实，呈胶质状；当调ph值至5.2时，卵黄抗体除脂率达96％以上。sds-page电泳结果表明，调ph值为4.8和ph值为5.0提取的卵黄抗体提取液，除在66kda和25kda处分别出现两条带，在35kda-45kda处均有杂蛋白条带。而调ph值为5.2和ph值为5.4提取的卵黄抗体提取液仅在66kda和25kda处分别出现两条带，并无杂蛋白条带。说明，调ph值为5.2和ph值为5.4提取的卵黄抗体液更为纯净。

存放时间优化结果表明，卵黄液用醋酸-醋酸钠缓冲液(0.12mol/l，ph值5.0)作1:8稀释，调ph值至5.2，分别于4℃存放3、15和20小时，结果作用15和20小时抗体液的提取量较多；各组除脂率无明显差别，均达到96％以上；抗体效价无明显差异。从沉淀物状态比较，沉淀3小时，沉淀松散，不结实；而沉淀15和20小时，沉淀呈胶质状，无流动性较结实，利于抗体下一步提取的操作。综合以上结果，本发明确定卵黄抗体酸化时间为4℃作用15-20小时。

辛酸浓度优化结果表明，1％终浓度的辛酸提取抗体，不出现分层，液体浑浊，滤液不澄清；而1.5％、2％和3％终浓度的辛酸提取抗体，均出现分层，且滤液澄清。从降低生产成本考虑，本发明优选1.5％终浓度的辛酸提取抗体。

甲醛灭活浓度优化试验结果表明，当卵黄液中加入终浓度为0.05％甲醛结合1.5％辛酸后，可彻底灭活卵黄液中鸡白痢沙门氏菌、鸡大肠杆菌、荧光假单胞菌、eds-76病毒、禽网状内皮组织增生症病毒、禽呼肠孤病毒和鸡传染性贫血病毒，相对减少蜡样芽孢杆菌和铜绿假单胞菌数量。同时，由于辛酸也可用于卵黄抗体萃取，且当辛酸终浓度为1.5％时，可对卵黄抗体进行良好的萃取。因此，本发明确定1.5％辛酸结合0.05％甲醛用于卵黄抗体灭活。

本发明进一步公开了上述制备方法制备得到的ⅰ群血清4型禽腺病毒卵黄抗体。本发明制备得到的ⅰ群血清4型禽腺病毒卵黄抗体，为透明液体，久置后底部有少量白色沉淀；按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长，无支原体生长，无外源病毒污染，甲醛残留量符合规定，辛酸残留量不高于0.1％。本发明制备得到的ⅰ群血清4型禽腺病毒卵黄抗体的安全性好，抗体效价≥1:4。

本发明还公开了所制备得到的ⅰ群血清4型禽腺病毒卵黄抗体在制备预防或治疗ⅰ群血清4型禽腺病毒所致疾病的药物或试剂中的应用。优选的，本发明所述ⅰ群血清4型禽腺病毒所致疾病为由ⅰ群血清4型禽腺病毒引起的禽心包积液-肝炎综合征。

抗体最小预防剂量试验结果表明，按1.0ml/只剂量注射本发明制备得到的ⅰ群血清4型禽腺病毒卵黄抗体，鸡的攻毒保护率为93.33％；按1.5ml/只剂量注射卵黄抗体，鸡的攻毒保护率为96.67％。说明，本发明所述卵黄抗体注射28日龄健康易感鸡，1.0ml的预防剂量能起到较好的保护效果。

抗体预防试验结果表明，本发明ⅰ群血清4型禽腺病毒卵黄抗体注射21日龄健康易感鸡，对hy株强毒的攻毒保护率不低于90％，对现地鸡只有较好的保护作用。

抗体被动免疫期试验结果表明，本发明ⅰ群血清4型禽腺病毒卵黄抗体注射28日龄健康易感鸡，注射后1-5日攻毒保护率为80-100％，注射后7日攻毒保护率为80％以下；说明注射抗体5日后抗体仍能产生良好地保护作用。因此，本发明ⅰ群血清4型禽腺病毒卵黄抗体的被动保护期为5日。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明ⅰ群血清4型禽腺病毒卵黄抗体的制备方法，通过对提取酸化工艺的优化，有效提高了卵黄抗体的除脂率，使卵黄抗体液更为纯净，无杂蛋白。本发明制备方法的工艺简化，可规模化生产并应用于临床。本发明所制备得到的ⅰ群血清4型禽腺病毒卵黄抗体，能够安全、有效的预防ⅰ群4型禽腺病毒引起的禽心包积液-肝炎综合征，可以有针对性的防治ⅰ群4型禽腺病毒的感染与爆发。

附图说明

图1为不同液体提取卵黄抗体电泳图；其中，1为标准蛋白质marker，2为注射用水提取igy，3为ph4.3的注射用水提取igy，4为醋酸-醋酸钠缓冲液提取igy；

图2为不同稀释度提取的卵黄抗体sds-page电泳图；其中，1为1:4稀释度提取igy，2为1:5稀释度提取igy，3为1:6稀释度提取igy，4为1:7稀释度提取igy，5为1:8稀释度提取igy，6为1:9稀释度提取igy，7为蛋白质marker；

图3为不同ph值提取卵黄抗体的sds-page电泳图；其中，1为ph4.8卵黄液提取igy，2为ph5.0卵黄液提取igy，3为ph5.2卵黄液提取igy，4为ph5.4卵黄液提取igy，5为标准蛋白质marker。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

1、生产用毒株

制苗免疫原用ⅰ群血清4型禽腺病毒hy株，由哈药集团生物疫苗有限公司分离、鉴定、保管和供应。

实施例1ⅰ群血清4型禽腺病毒卵黄抗体的制备

1、病毒原液的制备

用细胞稀释液将hy株稀释10³倍，接种鸡肝癌(lmh)单层细胞转瓶，每瓶1.0ml，置37℃、co2培养箱中培养。每日观察，至96小时，将细胞瓶置-80℃反复冻融两次，振摇后置灭菌容器内，分别取样进行检验，置-20℃保存备用。并取样进行病毒含量(tcid50)测定。hy株病毒含量应不低于10^7.5tcid50/0.1ml。

2、病毒液灭活

将检验合格的hy株病毒液加入10％(v/v)的甲醛溶液，随加随摇使其充分混合，使甲醛溶液的终浓度为0.1％(v/v)，37℃条件下灭活24小时(从抗原温度升至37℃开始计时)，其间每4小时摇晃一次。灭活完毕，分别取样，进行灭活检验，灭活后的病毒液置2～8℃保存，有限期为30日。

3、油乳佐剂免疫原的配制

按油佐剂与灭活病毒液1:2.5(v/v)的比例进行配制。将1份油相注入预混罐中，低温搅拌的同时，缓慢加入2.5份水相，再注入乳化罐乳化5分钟。乳化后，取样10ml，以3000r/min离心15min，如不分层，终止搅拌，无菌操作分装至250ml无菌瓶。

4、免疫原的检验

4.1无菌检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。

4.2安全检验

用28～35日龄的spf鸡10只，每只胸部肌肉接种2.0ml，观察14日，全部健活。

5、抗体制造及半成品检验

5.1高免蛋鸡群应符合以下标准

5.1.1健康，无禽白血病、禽网状内皮组织增殖病，按0.5％抽样，血清抗体结果应全部为阴性。

5.1.2监测鸡白痢和鸡支原体，二者的阳性率不超过0.1％。

5.1.3应适时接种禽流感、鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊病、鸡马立克氏病、鸡减蛋综合征(eds76)及鸡大肠杆菌病等疫苗，并做好球虫病药物预防。

5.1.4应具有商品蛋鸡的良好生产性能。

5.2免疫程序

5.2.1基础免疫禽腺病毒血清4型油乳佐剂免疫原，肌肉注射健康产蛋鸡，每只1.0ml。

5.2.2加强免疫基础免疫21日后，肌肉注射相同的油乳佐剂免疫原，每只2.0ml。

5.2.3强化免疫加强免疫21日后，肌肉注射相同的油乳佐剂免疫原，每只2.0ml。

5.2.4维持免疫在强化免疫接种后根据抗体效价，每隔2～3个月再加强接种1次，每只2.0ml。

5.3高免蛋收集

产蛋鸡强化免疫接种结束后10日，每隔5日抽样测定高免鸡蛋黄中抗体效价，当抗体琼扩效价≥1:64时，收集高免蛋，置10～15℃，应不超过10日。

5.4血清4型禽腺病毒蛋黄抗体制造

5.4.1蛋壳消毒将鸡蛋浸入1‰新洁尔灭水溶液中消毒15分钟。然后用甲醛熏蒸鸡蛋30分钟。

5.4.2蛋黄分离打破蛋壳，除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄。

5.4.3除脂量取卵黄体积，加入灭菌玻瓶内，按其8倍体积量加入醋酸-醋酸钠缓冲液(0.12mol/l，ph5.0)，混匀，并调至ph5.2，置2～8℃保存过夜(优选4℃作用15～20小时)。

5.4.4萃取吸取上清液，缓慢加入辛酸至终浓度为1.5％(v/v)，搅拌混合2小时，静置15～20小时(2～8℃)，取上清液调至ph7.2。

5.4.5过滤、浓缩将加辛酸处理好的卵黄上清液用孔径为1.0μm和0.45μm的筒式滤芯过滤，再经截留分子量为10kd的中空纤维超滤柱进行浓缩10倍。

5.4.6灭活按终浓度为0.05％(v/v)加入甲醛溶液，充分搅拌混匀，室温(20-25℃)灭活24小时。

5.4.7半成品配制将浓缩灭活卵黄抗体用磷酸盐缓冲液(ph7.2)稀释为琼扩抗体效价不低于1:4，再用孔径为0.22μm滤膜过滤除菌。

5.5半成品检验

5.5.1无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。

5.5.2抗体效价测定卵黄抗体琼扩效价不低于1:4。

5.6分装

定量分装，加盖密封，2～8℃保存。

6、成品检验

6.1性状

本品为透明液体，久置后底部有少量白色沉淀。

6.2装量检查

按现行《中国兽药典》附录进行检查，符合规定。

6.3无菌检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。

6.4支原体检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，无支原体生长。

6.5外源病毒检验

用3～5瓶抗体混合，取混合抗体20ml加入透析袋(孔径0.2～0.25nm)，在2～5℃用pbs(0.01mol/l，ph值7.2)缓冲液对样品进行透析过夜，透析过夜后抗体样品体积应在20ml±0.5ml，作为检品。按现行《中国兽药典》附录进行检验，无外源病毒污染。

6.6甲醛残留量测定

按现行《中国兽药典》附录进行检验，符合规定。

6.7辛酸残留量检验

辛酸残留量不高于0.1％。

6.8安全检验

用5日龄spf鸡10只，肌肉注射抗体2.0ml，spf鸡全部健活；用体重18～22g清洁级小鼠10只，皮下注射抗体1.0ml。连续观察14日，小鼠全部健活。

6.9效力检验

6.9.1抗体效价测定

在8.0％氯化钠溶液100ml中加入1g优质琼脂粉，加热融化后，加入终浓度为0.01％硫柳汞防腐，浇制凝胶板。在其上按中央1孔外围6孔打孔，孔径5mm，间距3mm。将每批(201701、201702、201703)抗体作2倍系列稀释后进行试验，抗原及其抗体加样量以孔满为度(约25μl)，加样后置37～38℃湿盒孵育24～48小时。当阴、阳性血清对照成立时，与标准抗原形成白色沉淀线的抗体最大稀释倍数即为卵黄抗体的效价。结果，3批抗体效价均≥1:4。

6.9.2抗体最小预防剂量试验

取3批禽腺病毒卵黄抗体，按0.5ml/只、1.0ml/只和1.5ml/只剂量经颈部皮下接种28日龄健康易感鸡，每个剂量接种健康易感鸡各30只，同时另设同批28日龄健康易感鸡10只作为健康对照，10只作为攻毒对照。在注射抗体24小时后，试验抗体组与攻毒对照组鸡颈部肌肉注射禽腺病毒血清4型hy株强毒0.5ml(含100ld50)，观察10日，结果见表1。

表1最小预防剂量试验结果

从表1结果可以看出，28日龄健康易感鸡按0.5ml/只剂量注射抗体，鸡的攻毒保护率为56.67％～63.33％；按1.0ml/只剂量注射抗体，鸡的攻毒保护率为93.33％；按1.5ml/只剂量注射抗体，鸡的攻毒保护率为96.67％；攻毒对照组100％出现典型病变；健康对照组100％健活，且无典型病变。说明该抗体注射28日龄健康易感鸡，1.0ml的预防剂量能起到较好的保护效果。

6.9.3抗体预防试验

取3批禽腺病毒卵黄抗体，每批用21日龄现地健康鸡40只，每只肌肉注射禽腺病毒血清4型卵黄抗体1.0ml，同时设同批21日龄健康易感鸡10只作为健康对照，10只作为攻毒对照组。24小时后抗体组和攻毒对照组鸡每只肌肉注射禽腺病毒血清4型hy株强毒0.5ml(含100ld50)；健康对照组，不注射任何药品。3个组隔离饲养。连续观察10日。结果见表2。

表2预防试验情况

从表2结果可以看出，3批禽腺病毒血清4型卵黄抗体注射21日龄健康易感鸡，对强毒的攻毒保护率均不低于90％，对现地鸡只有较好的保护作用。

6.9.4抗体被动免疫期试验

取3批禽腺病毒卵黄抗体，每批肌肉注射28日龄现地健康鸡80只，1.0ml/只，同时设同批28日龄健康易感鸡10只作为健康对照，40只作为攻毒对照。在抗体注射后1、3、5和7日，从每批抗体注射鸡中随机抽取20只，连同攻毒对照10只健康易感鸡分别注射禽腺病毒血清4型hy株强毒，每只0.5ml(含100ld50)，健康对照组，不注射任何药品。连续观察10日，结果见表3。

表3抗体预防持续时间测定结果

从表3结果可以看出，3批禽腺病毒血清4型卵黄抗体注射28日龄健康易感鸡，注射抗体后1～5日攻毒保护率为80～100％，7日攻毒保护率为80％以下，说明注射抗体5日后抗体仍能产生良好地保护作用，注射7日后以后抗体不能达到良好的保护效果。因此，该卵黄抗体的被动保护期为5日。

试验例1卵黄抗体提取酸化工艺的优化

1、不同稀释液选取试验

取3等份高免鸡蛋的卵黄液(卵黄液的制备方法同实施例1)，每份150ml，分别用注射用水、ph4.3的注射水及醋酸-醋酸钠缓冲液(0.12mol/l，ph值5.0)作1:8稀释，调ph值至5.2，置4℃冰箱内15小时，观察并测定抗体提取的效果，结果见表4。

表4不同稀释液对卵黄抗体除脂率结果

从表4结果可以看出，注射用水和ph4.3的注射水提取抗体稀释度为1:8时(ph值为5.2，作用15小时)，除脂率在80％以上。而用醋酸-醋酸钠缓冲液的除脂率在98％以上，且上清液澄清，卵黄沉淀呈胶质状，无流动性。

从不同液体提取卵黄抗体电泳图(图1)中可以看出，用注射用水和ph4.3的酸水提取的卵黄抗体，除在66kda和25kda处分别出现两条带，为igy的重链和轻链，在35kda～45kda处均有杂蛋白条带；而醋酸-醋酸钠缓冲液提取的卵黄抗体仅在66kda和25kda处分别出现两条带，为igy的重链和轻链，并无杂蛋白条带。说明，经醋酸-醋酸钠缓冲液提取的卵黄抗体液更为纯净。

2、辛酸浓度选取试验

取4等份高免鸡蛋的卵黄液(卵黄液的制备方法同实施例1)，每份75ml，按8倍卵黄液体积的醋酸-醋酸钠缓冲液(0.12mol/l，ph5.0)除脂(具体操作同实施例1)，自然沉降15小时后取上清液，分别滴加终浓度为1％、1.5％、2％和3％的辛酸(体积百分比)，测定辛酸浓度对抗体提取的影响。结果见表5。

表5不同浓度的辛酸对卵黄抗体上清液的理化性状结果

从表5结果可以看出，1％浓度的辛酸提取抗体，不出现分层，液体浑浊，滤液不澄清；而1.5％、2％和3％浓度的辛酸提取抗体，均出现分层，且滤液澄清。

3、稀释度选取试验

取6等份高免鸡蛋的卵黄液(卵黄液的制备方法同实施例1)，每份150ml，分别用醋酸-醋酸钠缓冲液(0.12mol/l，ph值5.0)作1:4～1:9稀释，调ph值至5.2，置4℃冰箱内15小时，测定稀释度对抗体提取的影响。

不同稀释度对抗体提取的结果见表6。

表6不同稀释度对卵黄抗体除脂率结果

从表6结果可以看出，抗体稀释度为1:7以上时(ph值为5.2，作用15小时)，除脂率达96％以上。但1:7稀释的上清液轻度浑浊，卵黄沉淀呈胶质状，有流动性；而1:8和1:9稀释的上清液澄清，卵黄沉淀呈胶质状，无流动性。

从图2结果可以看出，sds-page电泳图中稀释度为1:4～1:6的卵黄抗体提取液除在65kda和22kda处分别出现两条带，为igy的重链和轻链，在35kda～40kda处有杂蛋白条带。稀释度为1:7～1:9的卵黄抗体提取液仅在65kda和22kda处分别出现两条带，为igy的重链和轻链，并无杂蛋白条带，说明稀释度为1:7～1:9的卵黄抗体提取液更为纯净。

4、酸碱度(ph值)选取试验

取4等份高免鸡蛋的卵黄液(卵黄液的制备方法同实施例1)，每份150ml，用醋酸-醋酸钠缓冲液(0.12mol/l，ph值5.0)作1:8稀释，分别调ph值至4.8、5.0、5.2和5.4，置4℃冰箱内15小时，测定ph值对抗体提取的影响。

不同ph值对卵黄抗体提取的影响见表7和图3。

表7不同ph值对卵黄抗体除脂结果

从表7结果可以看出，ph值为4.8时，几乎无沉淀且浑浊，随ph值增大，上清液逐渐澄清，沉淀逐渐结实，呈胶质状；当ph值至5.2时，除脂率达96％以上。sds-page电泳图(图3)中，ph值为4.8和ph值为5.0提取的卵黄抗体提取液，除在66kda和25kda处分别出现两条带，为igy的重链和轻链，35kda～45kda处均有杂蛋白条带。ph值为5.2和ph值为5.4提取的卵黄抗体提取液仅在66kda和25kda处分别出现两条带，为igy的重链和轻链，并无杂蛋白条带。说明ph值为5.2和ph值为5.4提取的卵黄抗体液更为纯净。

5、存放时间选取试验

取3等份高免鸡蛋的卵黄液(卵黄液的制备方法同实施例1)，每份150ml，用醋酸-醋酸钠缓冲液(0.12mol/l，ph值5.0)作1:8稀释，调ph值至5.2，分别存放于4℃冰箱内3、15和20小时，测定存放时间对抗体提取的影响，结果见表8。

表8存放时间对卵黄抗体提取结果

从表8结果可以看出，4℃作用3、15和20小时，卵黄抗体提取量分别为1015、1128和1170ml；作用15和20小时抗体液的提取量较多；除脂率无明显差别，均达到96％以上；抗体效价无明显差异。从沉淀物状态比较，卵黄沉淀3小时，沉淀松散，不结实；沉淀15和20小时，沉淀呈胶质状，无流动性较结实，利于抗体下一步提取的操作。综合以上结果，确定卵黄抗体酸化时间为4℃作用15～20小时。

6、灭活浓度选取试验

取卵黄液检品(具体操作同实施例1)，缓慢加入辛酸至终浓度为1.5％，2～8℃静置15小时，取上清液过滤，滤液调至ph值7.2。再分别加入甲醛溶液使其终浓度为0.01％、0.02％、0.05％和0.1％(体积百分比)进行灭活。充分搅拌均匀，置室温灭活24小时，取液用于检验。同时，设不加辛酸、甲醛对照。

不同浓度甲醛结合1.5％辛酸对卵黄抗体溶液中指示微生物灭活效果见表9。

表9不同浓度甲醛结合1.5％辛酸对卵黄抗体溶液中指示微生物灭活效果

注：“+”代表有活病毒，“－”代表无活病毒。

从表9结果可以看出，当卵黄液中加入终浓度为0.05％甲醛结合1.5％辛酸后，可彻底灭活卵黄液中鸡白痢沙门氏菌、鸡大肠杆菌、荧光假单胞菌、eds-76病毒、禽网状内皮组织增生症病毒、禽呼肠孤病毒和鸡传染性贫血病毒，相对减少蜡样芽孢杆菌和铜绿假单胞菌数量。同时，由于辛酸也可用于卵黄抗体萃取，且当辛酸终浓度为1.5％时，可对卵黄抗体进行良好的萃取。因此，确定1.5％辛酸结合0.05％甲醛用于卵黄抗体灭活。