【
技术领域：
：】本发明涉及人类生殖领域，具体涉及一种fsh-hsa融合蛋白及其制备方法。
背景技术：
：：促卵泡生成素(folliclestimulatinghormone，简称fsh)，是一种由脑垂体前叶嗜喊性细胞合成与分泌的高度糖基化蛋白，与脑垂体分泌的其他糖蛋白激素如促黄体激素(lh)、促甲状腺激素(tsh)，还有胎盘分泌的促绒毛膜激素(hcg)共同组成糖蛋白家族，都由α亚基和β亚基所组成，α亚基相同，而β亚基具有激素各自的特异性，是激素生物活性和免疫原性的决定因素。fsh的α亚基由92-96个氨基酸组成，β亚基由109-115个氨基酸组成。两亚基通过内部二硫键维持自身正确的三级结构，c端残基的位置决定其折叠的三维空间结构。根据qingr.fan等人在nature上发表的fsh与其受体的三维结构，fsh主要通过β亚基的c端与其受体结合，同时β亚基的c端通过内部二硫键的固定与α亚基紧密结合，其中真正与受体的结合位点是β亚基的c端第89-105位氨基酸，它像三明治一样，夹在α亚基的l2环和c端中间。女性卵泡颗粒细胞上含有fsh的特异性受体，雌激素协同fsh使颗粒细胞增生，内膜细胞分化，卵泡液形成，卵泡腔扩大，从而促进卵泡生长和发育成熟。卵泡在生长过程中会释放抑制素以阻断卵泡剌激素的进一步合成，并呈剂量依赖关系。这一机制保证了排卵的选择性。男性由细胞精管内的支持细胞是fsh的靶细胞，fsh与支持细胞上的特异性受体结合后将剌激由细精管上皮和次级精母细胞的发育，在lh和雄激素的协同下促进精子发育成熟。因为fsh对女性的卵泡成熟和男性的精子发育有非常重要意义，因而可以单独使用fsh或联合lh应用治疗不育不孕症。fsh可以从脑垂体或绝经后的妇女尿液中分离得到，但尿源hfsh存在病毒污染、原料来源有限、采集困难、含量低及纯化过程复杂等问题，欧美等发达国家普遍不接受尿源产品上市和销售。fsh也可以重组生产(us5，639，640、us5，156，957、us4，840，896、ep211，894)，但仍然存在一些缺点。首先，其半衰期短。刺激女性卵泡发生需要连续8-10天，有时高达21天，而对于低促性腺激素的男性，诱导精子发生需要高达18个月。为达到临床效果，需每天肌肉注射或皮下注射给药，这样的给药方案经常伴有局部反应和不适，常见的并发症如卵巢过渡刺激综合征，变现为卵巢增大、全身毛细血管通透性增加和腹水形成，重者可危及患者生命。其次，目前重组hfsh表达量低，制备过程复杂和生产成本巨大。因而开发长效fsh，减少给药频率具有实际临床应用价值。近年来有多篇专利及文章报道开发长效fsh，主要分为两类，一种是通过增加fsh的糖基化位点来达到提高半衰期的目的，另一种通过与fc片段融合来提高蛋白体内半衰期。前者可再细分为两类，一种是在fsh分子内部增加糖基化修饰位点，如w001/58493公开了可以在fsh的α亚基进行的77种突变和可以在fsh的β亚基进行的51种突变，但其未公开其突变后的效果；另一种是在序列末端添加额外序列来增加糖基化修饰位点。目前开发比较成功的是2010年由德国默克公司上市的elonva，该类似物具有天然fsh的生物活性，但却具有较长的循环半衰期，在人体内的半衰期约69h。蛋白具体序列在专利us5，338，835和us5，585，345中公开，是一种改造的fshβ亚基，其c末端谷氨酸以hcg的羧基末端肽(ctp)基团延长。igg类的免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质，它们的半衰期可高达到21天，而fc片段是igg保持体内较长半衰期的主要原因，fc片段可与新生fc受体(fcrn)结合，避免igg进入溶酶体中被降解。因此，igg的fc片段被用来与活性蛋白连接构成融合蛋白，以提高活性蛋白的体内半衰期，达到长效的目的。专利uso，186，662公布了通过构建fsh-fc融合蛋白同二聚体、异二聚体，在大鼠体内半衰期提高至60h。但该蛋白按三天给药一次，fsh已经代谢完毕没有活性。cn201210476665在此基础上加以完善，fsh融合蛋白的的β亚基直接或者间接通过链接元件linker融合在fc片段上，保留原有亲和力的前提下，增强了体内半衰期。但是其半衰期仍只有30-40小时(文献报道标准品重组fsh为12h)，且需达到同等效果剂量约为gonal-f的十倍，用量大。cn201310529897介绍另一种fsh-fc融合蛋白，该蛋白特征为β亚基链接ctp，α亚基链接fc片段，α亚基通过共价键形式与ctp相连。此蛋白活性与重组fsh相当，但其半衰期也仍只有重组fsh的三倍左右。临床上仍需要一种产品，在同等剂量下提供fsh部分或全部治疗相关的效果，且半衰期长，可以比现有的fsh产品更低频率给药。人血清白蛋白(humanserumalbumin，hsa)是人体血清中的主要成分，对维持体内渗透压和血浆体积起着至关重要的作用。人血清白蛋白具有585个氨基酸，是分子量为65kd的非糖基化蛋白，肾清除率非常低，体内半衰期为14-20d。它也是体内因子和药物转运的天然载体。研究表明将治疗性蛋白基因与人血清白蛋白基因融合所表达的融合蛋白可明显降低体内药物的清除速率，延长生物半衰期。yeh等发现，克鲁维氏酵母表达的hsa-cd4融合蛋白在以家兔为动物模型的实验中半衰期比单独的cd4延长了140倍。而克鲁维氏酵母表达的hsa-ifnα的融合蛋白(albuferon)在猕猴体内的半衰期比单独的ifnα延长了大约18倍。人血清白蛋白是血液循环中的一个非常重要的天然蛋白，在体液循环中可存在20天以上。目前已有多种hsa融合蛋白处于临床研究或已经上市，包括gsk公司研发的阿必鲁肽，其经过hsa融合后，半衰期由2min延长至6-8天，半衰期显著提高，每周仅需注射一次。技术实现要素：本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种fsh-hsa融合蛋白及其制备方法。本发明所述的一种fsh-hsa融合蛋白及其制备方法，它包括fsh的β亚基和α亚基；所述fsh的β亚基直接或者通过链接元件间接融合人血清白蛋白；所述fsh的α亚基通过亲和力或链接原件与β亚基结合在一起。进一步地，fsh-hsa包括两条肽链，为单体；符合以下方程：方程为：fshα@fshβ-l-hsa。其中：fshα指的是fsh的α亚基；@代表了fshα通过α亚基和β亚基的亲和力或者链接元件与fsh的β亚基结合在一起；fshβ指的是fsh的β亚基；l代表了hsa直接或通过链接元件间接融合到β亚基上；hsa指的是人血清白蛋白。进一步地，所述的fsh融合蛋白包括四条肽链，为二聚体，符合以下方程：方程为：fshα@fshβ-l-hsa：fshα@fshβ-l-hsa。其中：fshα指的是fsh的α亚基；@代表了fshα通过α亚基和β的亲和力或者链接元件与fsh的β亚基结合在一起；fshβ指的是fsh的β亚基；l代表了hsa直接或通过链接元件间接融合到α或者β亚基上；hsa指的是人血清白蛋白；冒号指的是两个fsh-hsa融合蛋白单体之间的相互作用。进一步地，所述fsh为人促卵泡生成素。进一步地，所述的hsa为人血清白蛋白，其氨基酸序列与seqid:7的氨基酸序列至少具有80％的一致性。进一步地，所述fsh融合蛋白，其中l为直接键合。进一步地，所述的连接子为约1-20个氨基酸。进一步地，所述fsh融合蛋白，其中两个单体的相互作用为非共价或共价结合。进一步地，所述fsh融合蛋白，其表达体系可是是哺乳动物宿主细胞，包括但不限于cho，hek293，骨髓瘤细胞，宿主细胞也可以是酵母或者原核细胞如e.coli。进一步地，所述fsh融合蛋白，其纯化方法包括但不限于色谱技术如体积排阻、离子交换、亲和色谱法及超滤法，也包括上述各种方法的适当组合。采用上述结构后，本发明有益效果为：本发明所述的一种fsh-hsa融合蛋白及其制备方法，它旨在提供一种融合hsa的fsh产品，进一步提高半衰期的同时，保持原有活性。【附图说明】此处所说明的附图是用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，但并不构成对本发明的不当限定，在附图中：图1为fsh-hsa融合蛋白单体(a)及二聚体(b)示意图。图2为fsh-hsa融合蛋白fshα重组质粒(a)及fshβ-hsa重组质粒(b)。图3为fsh-hsa二聚体经一步纯化后native-page图谱。图4为fsh-hsa二聚体经一步纯化后sds-page图谱。图5为fsh-hsa二聚体hplc-sec图谱；【具体实施方式】下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，其中的示意性实施例以及说明仅用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。如图1-图5所示，本具体实施方式所述的一种fsh-hsa融合蛋白及其制备方法，fsh融合蛋白的β亚基直接或者通过链接元件间接融合重组人血清白蛋白,而fsh的α亚基通过亲和力或链接原件与β亚基结合在一起。本发明同cn201210476665的fsh-fc融合蛋白的区别为其β亚基链接fc片段，而本发明β亚基末端链接hsa。本发明的fsh融合蛋白包括两条肽链，为单体，其特征符合以下方程：fshα@fshβ-l-hsa；其中：fshα指的是fsh的α亚基；@代表了fshα通过α亚基和β亚基的亲和力或者链接元件与fsh的β亚基结合在一起；fshβ指的是fsh的β亚基；l代表了hsa直接或通过链接元件间接融合到β亚基上；hsa指的是人血清白蛋白。本发明的fsh融合蛋白包括四条肽链，为同二聚体，其特征符合以下方程：(fshα@fshβ-l-hsa)；其中：fshα指的是fsh的α亚基；@代表了fshα通过α亚基和β亚基的亲和力或者链接元件与fsh的β亚基结合在一起；fshβ指的是fsh的β亚基；l代表了hsa直接或通过链接元件间接融合到β亚基上；hsa指的是人血清白蛋白。括号内下标2代表着此代表为二价同二聚体。本发明还涉及一种载体，该载体含有编码seqidno:3的序列的fshα亚基的dna。该载体可以是表达载体。本发明还涉及一种载体，该载体含有编码seqidno:6的序列的fshβ-hsa亚基的dna。该载体可以是表达载体。本发明还涉及一种载体，该载体含有第一dna和第二dna，其中第一dna编码含有seqidno:3的序列的fshα亚基的dna，第二dna编码含有seqidno:6的序列的fshβ-hsa亚基的dna。该载体可以是表达载体。所述的fsh-hsa融合蛋白涉及的hsa包括全长野生型的人血清白蛋白，也包括对于野生型人血清白蛋白氨基酸个别的改变，还包括某个人血清白蛋白结构域或其新生儿fc受体(fcrn)结合片段。在具体实施方法中，本发明所用的人血清白蛋白为全长野生型人血清白蛋白，包括三个结构域。本发明涉及的哺乳动物宿主细胞包括但不限于cho，hek293，骨髓瘤细胞。宿主细胞也可以是酵母或者原核细胞如e.coli。本发明涉及的fsh-hsa融合蛋白可以用标准的实验手段从宿主细胞中纯化。例如fsh-hsa融合蛋白包含了hsa，蛋白可以用bluesepharose纯化。纯化包括但不限于色谱技术如体积排阻、离子交换、亲和色谱法及超滤法。本发明涉及的融合蛋白的分离纯化也包括上述各种方法的适当组合。本发明提供了一个在不丢失fsh体内活性的基础上进一步增强fsh的体内半衰期的融合方法。具体方式是将fshβ亚基直接或间接通过链接元件融合在hsa蛋白上，而α亚基则通过亲和力或链接元件与此亚基结合在一起。本发明的fsh-hsa融合蛋白为二聚体或者是单体。具体实施例一：fsh-hsa同二聚体的质粒构建：1)根据基因库中搜索到的人fshα亚基基因序列(fj624079.1)，经密码子优化后人工合成获得的人fshα基因(seqidno：1)，合成好的fshα基因经金斯瑞公司通过ta克隆构建到载体pcdna3.3topo中，测序验证构建质粒的准确性，获得重组质粒dna。2)人的fshα序列见seqidno:1，信号肽序列见(seqidno:2)，编码该序列的核苷酸序列检seqidno:3。3)根据基因库中搜索到的人fshβ亚基基因序列(hf564664.1)，野生型全长人血清白蛋白基因序列(dq986150.1)，经密码子优化后人工合成获得的人fshβ-hsa融合蛋白基因(seqidno：4)，合成好的fshα基因经金斯瑞公司通过ta克隆构建到载体poptivec-topo中，测序验证构建质粒的准确性，获得重组质粒dna。4)人的fshβ-hsa融合蛋白基因序列见seqidno:4，信号肽序列见(seqidno:5)，编码该序列的核苷酸序列检seqidno:6。具体实施例二：fsh-hsa二聚体蛋白瞬时表达：1)转染前24小时，用培养基以2x106cells/ml密度接种cho-te细胞。转染当天摇匀，取样计数。转染前，将准备转染的宿主细胞使用预热的培养基稀释，将密度调至4x106cells/ml，将准备好的细胞放入温度36.5℃，湿度85％，co26％，80～110rpm培养。dna用量为1μg/106cells/ml，pei的用量是dna的3倍，即3μg/106cells/ml.使用移液器吸取peireagent滴加入待转染的细胞中，摇动摇瓶使其混匀；再使用移液器将相应的dna滴加入待转染的细胞中。该过程应在2分钟内完成，然后将转染后的细胞放回到36.5℃摇床中，四小时后向每份转染后的细胞中加入1％体积的vpa溶液、0.5倍体积的anti-clumping和0.8％体积的cystine溶液。然后放到32℃摇床上。每天对细胞取样进行vi-cell计数直到活率在80％左右，取细胞悬液7000rpm离心10min收集fsh-hsa二聚体培养上清。具体实施例三：fsh-hsa二聚体白纯化：用20mmtris，7.0平衡folliclestimulatinghormoneaffinitymatrix(lifetechnologies)。细胞液经离心后，取上清0.22μm过滤后上载到fsh亲和柱上，然后用20mmtris漂洗后，最后用20mmtris，2mmgcl27.0洗脱蛋白。具体实施例四：fsh-hsa二聚体蛋白分析鉴定：native-page结果如图3所示，sds-page结果如图4所示，hplc-sec结果如图5所示。fsh中β亚基的c端通过内部二硫键的固定与α亚基紧密结合，而hsa与β融合后会以非共价键形式形成二硫键。在非变性胶(native-page)及hplc-sec中，非还原不加热条件非共价键均未打开，成单一条带，分子量约180kd。加入dtt后，β亚基中二硫键断裂，不能与α亚基结合，从而只存在(fshβ-hsa)2。另外dtt断裂hsa中二硫键，使之产生多聚体，加热时亦产生多聚体。在变性胶(sds-page)中，由于本身sds作用，破坏了部分hsa间的作用力，使之有大量单体fsh-hsa产生，同时也有少量fshα亚基解离，形成fshα亚基及fshβ-hsa。加热后，αβ亚基之间的共价键断裂更为严重，fshα亚基及fshβ-hsa含量增加，同时多聚体产生。加入dtt的还原样品可看到，β亚基中二硫键断裂，不能与α亚基结合，fsh-hsa消失，产生大量fshα亚基及fshβ-hsa。经一步纯化后，fsh-hsa二聚体蛋白纯度达98％以上本发明所述的一种fsh-hsa融合蛋白及其制备方法，它旨在提供一种融合hsa的fsh产品，进一步提高半衰期的同时，保持原有活性。以上所述仅是本发明的较佳实施方式，故凡依本发明专利申请范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均包括于本发明专利申请范围内。inhaosequencetable<110>hangzhouhaoyangbiotechnologyco.,ltd.<120>akindoffsh-hsafusionproteinanditspreparationmethod<130>indicatesthefilereferencenumber<160>representsthenumberofsequencesinthesequencetable<170>indicatesthesoftwareversioninformationoftheseriallistelectronicfile<210>1<211>122<212>ptr<213>race（homosapiens）<223>peoplefshαsubunitaminoacidsequence<400>1mdyyrkyaaiflvtlsvflhvlhsapdvqdcpectlqenpffsqpgapilqcmetgccfsrayptplrskktmetlvqknvtsestccvaksynrvtvmetggfkvenhtachcstcyyhks<210>2<211>24<212>ptr<213>race（homosapiens）<223>peoplefshαsignalpeptideaminoacidsequence<400>2mdyyrkyaaiflvtlsvflhvlhs<210>3<211>351<212>dna<213>race（homosapiens）<223>peoplefshαsubunitnucleotidesequence<400>3atggactactatagaaagtacgccgctatcttcctggtgaccctgagcgtgtttctgcacgtgctgcattctgcccctgacgtgcaggattgcccagagtgtacactgcaggagaaccccttcttttctcagccaggagctccaatcctgcagtgcatgggatgctgtttctccagggcttaccccacccctctgcggagcaagaagacaatgctggtgcagaagaatgtgacctccgagagcacatgctgcgtggccaagtcctataaccgcgtgaccgtgatgggcggctttaaggtggagaatcacaccgcttgccattgttctacatgttactatcacaagtcctga<210>4<211>745<211>ptr<213>race（homosapiens）<223>peoplefshβ-hsaaminoacidsequence<400>4metktlqffflfccwkaiccnsceltnitiaiekeecrfcisinttwcagycytrdlvykdparpkiqktctfkelvyetvrvpgcahhadslytypvatqchcgkcdsdstdctvrglgpsycsfgemetkeggggsggggsggggsdahksevahrfkdlgeenfkalvliafaqylqqcpfedhvklvnevtefaktcvadesaencdkslhtlfgdklctvatlretygemetadccakqepernecflqhkddnpnlprlvrpevdvmetctafhdneetflkkylyeiarrhpyfyapellffakrykaafteccqaadkaacllpkldelrdegkassakqrlkcaslqkfgerafkawavarlsqrfpkaefaevsklvtdltkvhtecchgdllecaddradlakyicenqdsissklkeccekpllekshciaevendemetpadlpslaadfveskdvcknyaeakdvflgmetflyeyarrhpdysvvlllrlaktyettlekccaaadphecyakvfdefkplveepqnlikqncelfeqlgeykfqnallvrytkkvpqvstptlvevsrnlgkvgskcckhpeakrmetpcaedylsvvlnqlcvlhektpvsdrvtkccteslvnrrpcfsalevdetyvpkefnaetftfhadictlsekerqikkqtalvelvkhkpkatkeqlkavmetddfaafvekcckaddketcfaeegkklvaasqaalgl<210>5<211>18<211>ptr<213>race（homosapiens）<223>peoplefshβ-hsasignalpeptideaminoacidsequence<210>5mktlqffflfccwkaicc<210>6<211>2190<212>dna<213>race（homosapiens）<223>peoplefshβ-hsanucleotidesequence<210>6atgaagaccctgcagttctttttcctgttctgctgttggaaggccatctgctgtaactcctgcgagctgaccaatatcacaatcgctatcgagaaggaggagtgcagattttgtatcagcatcaacaccacatggtgcgccggctactgttataccagagacctggtgtacaaggatcccgctcgccctaagatccagaagacctgcacattcaaggagctggtgtatgagacagtgagagtgccaggctgtgcccaccatgctgattccctgtacacctatcccgtggccacacagtgccactgtggcaagtgcgacagcgattctaccgactgtacagtgcgcggactgggaccatcctactgcagctttggcgagatgaaggagggcggcggcggctctggaggaggaggatccggaggaggaggaagcgatgcccacaagtctgaggtggctcatcgctttaaggacctgggcgaggagaatttcaaggccctggtgctgatcgcttttgcccagtatctgcagcagtgccctttcgaggaccacgtgaagctggtgaacgaggtgaccgagtttgccaagacatgcgtggccgacgagtccgctgagaattgtgataagagcctgcataccctgttcggcgataagctgtgcaccgtggctacactgagagagacatacggcgagatggccgactgctgtgctaagcaggagcccgagcgcaacgagtgctttctgcagcataaggacgataacccaaatctgcccagactggtgcgccctgaggtggacgtgatgtgcaccgcctttcacgataatgaggagacattcctgaagaagtacctgtatgagatcgctaggcggcatccctacttctatgcccctgagctgctgtttttcgctaagcggtataaggccgcttttaccgagtgctgtcaggccgctgataaggccgcttgcctgctgcctaagctggacgagctgagggatgagggcaaggcttcctccgccaagcagcggctgaagtgtgccagcctgcagaagtttggcgagagggctttcaaggcttgggctgtggctaggctgtcccagcggtttccaaaggccgagttcgctgaggtgagcaagctggtgaccgacctgacaaaggtgcacaccgagtgctgtcatggcgacctgctggagtgcgctgacgatagggctgatctggctaagtacatctgtgagaaccaggacagcatctcttccaagctgaaggagtgctgtgagaagcctctgctggagaagtctcactgcatcgccgaggtggagaacgacgagatgcctgctgatctgccatctctggccgctgacttcgtggagtccaaggacgtgtgcaagaattacgccgaggctaaggacgtgttcctgggcatgttcctgtacgagtatgccagacgccacccagactactctgtggtgctgctgctgaggctggctaagacct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