本发明涉及一种治疗犬腹泻的灌肠液及其制备方法，具体的，涉及一种磷酸化川牛膝多糖、其灌肠液及其制备方法，属于医药
技术领域：
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背景技术：
：犬细小病毒(canineparvovirus，cpv)是一种烈性传染性病毒，以剧烈呕吐、腹泻、出血性肠炎及化脓性心肌炎为主要特征的犬细小病毒病(canineparvovirusinfection)的病原(颜文卿等，2006)。犬细小病毒在我国广泛流行，犬细小病毒病的主要自然宿主是犬，对不同年龄、性别的犬均有易感性，尤其以幼犬的易感性为最高，其中又以断奶前后的幼犬最为易感，另外狐、貂等犬科动物也是本病的主要传染源。犬的呕吐物、唾液和粪便均带毒，患病犬或隐性感染的带毒犬与健康犬可接触感染，或者经污染的饲料、饮水、食具与垫料通过消化道感染。犬细小病毒病的潜伏期根据动物机体的自身免疫力和病毒感染剂量的不同而不同，一般为7～14天，cpv侵入机体后的初始2天，机体不表现临床症状，而5～7天后表现病毒血症。临床上，单纯的cpv感染症状较轻，而cpv与细菌的混合感染，及其引发的继发感染的临床症状则明显很多，共有3种临床症状，即肠炎型、心肌炎型和慢性型。以肠炎综合征和心肌炎综合征为主，同一只患病动物一般仅表现为一种典型症状，同时有两种症状的患病动物比较少见。肠炎型多发生于2～4月龄的幼龄犬，潜伏期1～2周，主要是3～6月龄的幼犬发病。心肌炎型又称急性型，多见于缺乏母源抗体的4～6周龄的幼犬。常表现为突然发病、可视黏膜苍白、衰弱，呼吸困难、心力衰竭，也可见轻度呕吐和腹泻。听诊时心跳有杂音、心率不齐、肌肉震颤。发病较急，病程一般不超过24小时，患病动物表现急性心力衰竭，常因来不及诊断和治疗就死亡，致死率为60％～100％。慢性型主见于成犬、家养犬或已注射cpv疫苗的宠物，患病宠物主要表现为精神抑郁、食欲锐减甚至废绝，频繁地呕吐与腹泻。犬细小病毒会感染肠道上皮细胞，导致大量肠粘膜破坏，脱落，肠道大面积的炎症、出血。大多数病犬死于犬细小病毒引起的重剧肠炎。目前对犬细小病毒性肠炎的控制主要是通过全身用药的方式，主要通过注射抗病毒制剂，例如病毒唑，病毒灵等西药制剂，这些制剂在肠道中的浓度低，对肠道中存在的活病毒的直接杀灭作用较弱。因此，导致抗病毒作用较弱。目前临床上没有能够直接杀灭犬细小病毒发挥在肠道局部抗病毒作用的灌肠液——磷酸化川牛膝多糖灌肠液。技术实现要素：为解决现有技术的问题，本发明提供一种能够抗犬细小病毒作用的磷酸化川牛膝多糖、其灌肠液及其制作方法，制备的灌肠液能够发挥显著的抗犬细小病毒作用。本申请为了实现上述技术目的，采用如下的技术方案：一种磷酸化川牛膝多糖，分子量为171～182kd，磷酸根枝接量为8.27～9.76。磷酸化川牛膝多糖在制备治疗犬腹泻药物中的应用，将其制成注射液、灌肠液等剂型，作为治疗犬腹泻的药物。一种磷酸化川牛膝多糖灌肠液，包含2％～6％质量浓度的磷酸化川牛膝多糖。进一步的，一种磷酸化川牛膝多糖灌肠液，还包括质量浓度0.7～2.1％的氯化钠，质量浓度为0.1％～0.3％的酸碱度缓冲液。进一步的，一种磷酸化川牛膝多糖灌肠液，酸碱度缓冲溶液为包括2～4g/l碳酸氢钠、0.31～0.62g/l硫酸镁、0.48～0.48g/l氯化钾、0.77～1.54g/l乳酸钙及15～30g/l的葡萄糖的水溶液。进一步的，一种磷酸化川牛膝多糖灌肠液，酸磷酸化川牛膝多糖灌肠液的ph值为7.0～7.5。一种磷酸化川牛膝多糖及其灌肠液的制备方法，包括以下步骤：步骤一，提取川牛膝多糖：步骤1.1、取川牛膝100g，碾碎，加入1.0～1.5l蒸馏水煮2～3h，过滤并收集滤液；步骤1.2、将步骤1.1中得到的滤液在60℃下，浓缩至100ml，得到川牛膝多糖提取液；步骤1.3、在步骤1.2中得到的川牛膝多糖提取液中加入川牛膝多糖提取液1/6～1/3体积的三氯甲烷、1/18～1/16体积的正丁醇，震荡3～5min，在2000r/min条件下离心10～15min，重复3～5次，得到离心物；步骤1.4、将步骤1.3中的离心物中加入6～8倍的无水乙醇醇沉，于4℃下静置12～24h，用丙酮、无水乙醇洗涤得到沉淀物，将沉淀物置于冷冻干燥机中，于-70℃条件下，冷冻干燥48h，得到川牛膝多糖。步骤二、制备磷酸化川牛膝多糖：步骤2.1、取步骤1.4得到的川牛膝多糖1g，加入5～8％体积百分含量的hno3溶液及100ml蒸馏水，加热至70℃，然后分别加入0.8～1.2g的na2po3和1.44～2.16g的bacl2，70℃下静置加热6～8h，然后取出冷却至室温，过滤，滤液用无水碳酸钠调节ph值至6-7；步骤2.2、在步骤2.1调节ph值后的滤液中，加入1.4～4.2g无水硫酸钠，振荡1～2min，在2000r/min离心，离心时间10～15min，得到离心物；步骤2.3、将步骤2.2得到的离心物在50℃下复溶，选用截留相对分子质量为14000da的透析袋，将复溶后的离心物溶液装入透析袋中，以蒸馏水为透析液透析48h，测定透析前后电导率的变化，当电导率下降至160μs/cm时，停止透析，得到透析物；步骤2.4、将步骤2.3得到的透析物置于真空冷冻干燥机中，于-70℃条件下冷冻干燥48h，得磷酸化川牛膝多糖。一种磷酸化川牛膝多糖灌肠液的制备方法，按照上述方法制备磷酸化川牛膝多糖后，还包括以下的步骤：步骤三、制备磷酸化川牛膝多糖灌肠液：将2～6g步骤2.4制备成功的磷酸化川牛膝多糖，0.7～2.1g氯化钠，0.1～0.3g酸碱度缓冲溶液，溶于水中，加水至总重为100g，得到磷酸化川牛膝多糖灌肠液；所述酸碱度缓冲溶液包括2～4g碳酸氢钠，0.31～0.62g/l硫酸镁，0.48～0.48g/l氯化钾，0.77～1.54g/l乳酸钙和15～30g/l的葡萄糖。本发明采用上述技术方案取得如下技术效果。本发明的磷酸化川牛膝多糖，在体外能够显著抑制犬细胞病毒感染细胞的能力，具有很好的抗病毒作用。本发明的磷酸化川牛膝多糖灌肠液，可以有效预防犬感染犬细小病毒，对幼犬感染犬细小病毒具有很好的治疗作用，可有效的提高感染细小病毒犬的生存率。本发明的磷酸化川牛膝多糖灌肠液，天冷时可将溶液加温至30～37℃后应用，不影响其药效，天冷用药时，可以使用药犬更为舒适。附图说明图1是本发明具体实施例1的川牛膝多糖和磷酸化川牛膝多糖的红外光谱图。其中a为川牛膝多糖的红外光谱，b为磷酸化川牛膝多糖的红外光谱。具体实施方式为了使本
技术领域：
的技术人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施方式对本发明的内容作进一步的详细说明。实施例1至4对一种磷酸化川牛膝多糖及其灌肠液的制备方法进行了具体的描述。实施例1一种磷酸化川牛膝多糖及其灌肠液的制备方法，具体步骤如下。步骤一，提取川牛膝多糖。步骤1.1、取川牛膝100g，研磨碾碎，加入1.0l蒸馏水煮2h，过滤并收集滤液。步骤1.2、将步骤1.1中得到的滤液放入烧杯中，置于60℃水浴锅中，浓缩至100ml，得到川牛膝多糖提取液。步骤1.3、在步骤1.2中得到的川牛膝多糖提取液中加入川牛膝多糖提取液1/6体积的三氯甲烷及1/18体积的正丁醇，震荡3min，在2000r/min条件下离心10min，如此重复3次，得到离心物。步骤1.4、将步骤1.3中的离心物中，加入6倍的无水乙醇醇沉，于4℃静置12小时。所得沉淀，先用丙酮洗涤一遍，再用无水乙醇洗涤一遍，连续反复洗涤2次。然后将沉淀物置于冷冻干燥机中，于-70℃条件下，冷冻干燥48h，得到川牛膝多糖。通过硫酸苯酚法检测其多糖含量为96.6％。步骤二、制备磷酸化川牛膝多糖步骤2.1、取步骤1.4得到的川牛膝多糖1g，加入5％体积浓度的的hno3及100ml蒸馏水，水浴加热至70℃，然后分别加入0.8g的na2po3和1.44g的bacl2，继续在水浴锅中，70℃下静置加热8h，然后取出冷却至室温，过滤，将滤液用无水碳酸钠调节ph值6。步骤2.2、在步骤2.1调节ph值后的滤液中，加入1.4g无水硫酸钠，振荡1min，在2000r/min离心，离心时间10min，得到离心物。步骤2.3、将步骤2.2中获得的离心物干燥后，溶于50℃水浴中复溶，选用截留相对分子质量为14000da的透析袋，将复溶后的离心物溶液装入透析袋中，以蒸馏水为透析液透析48小时，测定透析袋中溶液前后电导率的变化，当电导率下降至160μs/cm时，停止透析。步骤2.4、将步骤2.3的透析后的透析袋中的溶液置于真空冷冻干燥机中于于-70℃条件下，冷冻干燥48h，得到磷酸化川牛膝多糖。参见图1，图中a为川牛膝多糖的红外光谱图，b为磷酸化川牛膝多糖的红外光谱图，经红外光谱检测，磷酸化川牛膝多糖与川牛膝多糖的红外光谱图有很多特征性改变，与川牛膝多糖的红外光谱图相比，磷酸化川牛膝多糖红外光谱显示两个特征吸收峰，在1000至800cm-1的区域，显示有一个对称的c-o-p伸缩振动峰，对应c-o-po3集团。另外在1300到1200cm-1区域，出现一个不对称的p＝o伸缩振动，表明磷酸化川牛膝多糖合成成功。经检测获得的磷酸化川牛膝多糖分子量为171kd，磷酸根枝接量为8.27.步骤三、制备磷酸化川牛膝多糖灌肠液将2g步骤2.4制备成功的磷酸化川牛膝多糖，0.7g氯化钠，0.1g酸碱度缓冲溶液，溶于水中，加水至总重为100g，得到磷酸化川牛膝多糖灌肠液。灌肠液的ph值为7.0～7.5。酸碱度缓冲溶液中，每100ml中含有碳酸氢钠0.2～0.4g，硫酸镁0.031～0.062g，氯化钾0.048～0.048g，乳酸钙0.077～0.154g，葡萄糖1.5～3.0g。此缓冲液可以调节缓冲灌肠液的ph值，吸收后有助于调节体内电解质平衡。实施例2一种磷酸化川牛膝多糖及其灌肠液的制备方法，具体步骤如下。步骤一，提取川牛膝多糖。步骤1.1、取川牛膝100g，研磨碾碎，加入1.5l蒸馏水煮3h，过滤并收集滤液。步骤1.2、将步骤1.1中得到的滤液放入烧杯中，置于60℃水浴锅中，浓缩至100ml，得到川牛膝多糖提取液。步骤1.3、在步骤1.2中得到的川牛膝多糖提取液中加入川牛膝多糖提取液1/3体积的三氯甲烷及1/17体积的正丁醇，震荡4min，在2000r/min条件下离心12min，如此重复4次，得到离心物。步骤1.4、将步骤1.3中的离心物中，加入10倍的无水乙醇醇沉，于4℃静置24小时。所得沉淀，先用丙酮洗涤一遍，再用无水乙醇洗涤一遍，连续反复洗涤3次。然后将沉淀物置于冷冻干燥机中，于-70℃条件下，冷冻干燥48h，得到川牛膝多糖。通过硫酸苯酚法检测其多糖含量为96.6％。步骤二、制备磷酸化川牛膝多糖步骤2.1、取步骤1.4得到的川牛膝多糖1g，加入8％体积浓度的hno3及100ml蒸馏水，水浴加热至70℃，然后分别加入1.2g的na2po3和2.16g的bacl2，继续在水浴锅中，70℃下静置加热7h，然后取出冷却至室温，过滤，将滤液用无水碳酸钠调节ph值7。步骤2.2、在步骤2.1调节ph值后的滤液中，加入4.2g无水硫酸钠，振荡2min，在2000r/min离心，离心时间12min，得到离心物。步骤2.3、将步骤2.2中获得的离心物干燥后，溶于50℃水浴中复溶，选用截留相对分子质量为14000da的透析袋，将复溶后的离心物溶液装入透析袋中，以蒸馏水为透析液透析72小时，测定透析袋中溶液前后电导率的变化，当电导率下降至160μs/cm时，停止透析。步骤2.4、将步骤2.3的透析后的透析袋中的溶液置于真空冷冻干燥机中于于-70℃条件下，冷冻干燥48h，得到磷酸化川牛膝多糖。所得磷酸化川牛膝多糖的分子量为179kd，磷酸根枝接量为9.21。步骤三、制备磷酸化川牛膝多糖灌肠液将6g步骤2.4制备成功的磷酸化川牛膝多糖，2.1g氯化钠，0.3g酸碱度缓冲溶液，溶于水中，加水至总重为100g，得到磷酸化川牛膝多糖灌肠液。灌肠液的ph值为7.5。酸碱度缓冲溶液中，每100ml中含有碳酸氢钠0.2～0.4g，硫酸镁0.031～0.062g，氯化钾0.048～0.048g，乳酸钙0.077～0.154g，葡萄糖1.5～3.0g，调节灌肠液的ph值，吸收后调节体内电解质平衡。此缓冲液可以调节缓冲灌肠液的ph值，吸收后有助于调节体内电解质平衡。实施例3一种磷酸化川牛膝多糖及其灌肠液的制备方法，具体步骤如下。步骤一，提取川牛膝多糖。步骤1.1、取川牛膝100g，研磨碾碎，加入1.2l蒸馏水煮2h，过滤并收集滤液。步骤1.2、将步骤1.1中得到的滤液放入烧杯中，置于60℃水浴锅中，浓缩至100ml，得到川牛膝多糖提取液。步骤1.3、在步骤1.2中得到的川牛膝多糖提取液中加入川牛膝多糖提取液1/4体积的三氯甲烷及1/16体积的正丁醇，震荡5min，在2000r/min条件下离心15min，如此重复5次，得到离心物。步骤1.4、将步骤1.3中的离心物中，加入8倍的无水乙醇醇沉，于4℃静置48小时。所得沉淀，先用丙酮洗涤一遍，再用无水乙醇洗涤一遍，连续反复洗涤2次。然后将沉淀物置于冷冻干燥机中，于-70℃条件下，冷冻干燥48h，得到川牛膝多糖。通过硫酸苯酚法检测其多糖含量为96.6％。步骤二、制备磷酸化川牛膝多糖步骤2.1、取步骤1.4得到的川牛膝多糖1g，加入6％体积浓度的hno3及100ml蒸馏水，水浴加热至70℃，然后分别加入1.0g的na2po3和1.8g的bacl2，继续在水浴锅中，70℃下静置加热6h，然后取出冷却至室温，过滤，将滤液用无水碳酸钠调节ph值6.5。步骤2.2、在步骤2.1调节ph值后的滤液中，加入2.8g无水硫酸钠，振荡1min，在2000r/min离心，离心时间15min，得到离心物。步骤2.3、将步骤2.2中获得的离心物干燥后，溶于50℃水浴中复溶，选用截留相对分子质量为14000da的透析袋，将复溶后的离心物溶液装入透析袋中，以蒸馏水为透析液透析60小时，测定透析袋中溶液前后电导率的变化，当电导率下降至160μs/cm时，停止透析。步骤2.4、将步骤2.3的透析后的透析袋中的溶液置于真空冷冻干燥机中于于-70℃条件下，冷冻干燥48h，得到磷酸化川牛膝多糖。所获得磷酸化川牛膝多糖的分子量为182kd，磷酸根枝接量为9.76。步骤三、制备磷酸化川牛膝多糖灌肠液将4g步骤2.4制备成功的磷酸化川牛膝多糖，1.4g氯化钠，0.2g酸碱度缓冲溶液，溶于水中，加水至总重为100g，得到磷酸化川牛膝多糖灌肠液。灌肠液的ph值为7.0。酸碱度缓冲溶液中，每100ml中含有碳酸氢钠0.2～0.4g，硫酸镁0.031～0.062g，氯化钾0.048～0.048g，乳酸钙0.077～0.154g，葡萄糖1.5～3.0g，调节灌肠液的ph值，吸收后调节体内电解质平衡。此缓冲液可以调节缓冲灌肠液的ph值，吸收后有助于调节体内电解质平衡。实施例4一种磷酸化川牛膝多糖及其灌肠液的制备方法，具体步骤如下。步骤一，提取川牛膝多糖。步骤1.1、取川牛膝100g，研磨碾碎，加入1.2l蒸馏水煮2h，过滤并收集滤液。步骤1.2、将步骤1.1中得到的滤液放入烧杯中，置于60℃水浴锅中，浓缩至100ml，得到川牛膝多糖提取液。步骤1.3、在步骤1.2中得到的川牛膝多糖提取液中加入川牛膝多糖提取液1/4体积的三氯甲烷及1/16体积的正丁醇，震荡5min，在2000r/min条件下离心15min，如此重复5次，得到离心物。步骤1.4、将步骤1.3中的离心物中，加入6倍的无水乙醇醇沉，于4℃静置24小时。所得沉淀，先用丙酮洗涤一遍，再用无水乙醇洗涤一遍，连续反复洗涤3次。然后将沉淀物置于冷冻干燥机中，于-70℃条件下，冷冻干燥48h，得到川牛膝多糖。通过硫酸苯酚法检测其多糖含量为96.6％。步骤二、制备磷酸化川牛膝多糖步骤2.1、取步骤1.4得到的川牛膝多糖1g，加入5％体积浓度的的hno3及100ml蒸馏水，水浴加热至70℃，然后分别加入0.8g的na2po3和1.44g的bacl2，继续在水浴锅中，70℃下静置加热6h，然后取出冷却至室温，过滤，将滤液用无水碳酸钠调节ph值6。步骤2.2、在步骤2.1调节ph值后的滤液中，加入1.4g无水硫酸钠，振荡1min，在2000r/min离心，离心时间15min，得到离心物。步骤2.3、将步骤2.2中获得的离心物干燥后，溶于50℃水浴中复溶，选用截留相对分子质量为14000da的透析袋，将复溶后的离心物溶液装入透析袋中，以蒸馏水为透析液透析48小时，测定透析袋中溶液前后电导率的变化，当电导率下降至160μs/cm时，停止透析。步骤2.4、将步骤2.3的透析后的透析袋中的溶液置于真空冷冻干燥机中于于-70℃条件下，冷冻干燥24h，得到磷酸化川牛膝多糖。步骤三、制备磷酸化川牛膝多糖灌肠液将2g步骤2.4制备成功的磷酸化川牛膝多糖，0.7g氯化钠，0.1g酸碱度缓冲溶液，溶于水中，加水至总重为100g，得到磷酸化川牛膝多糖灌肠液。灌肠液的ph值为7.0～7.5。酸碱度缓冲溶液中，每100ml中含有碳酸氢钠0.2～0.4g，硫酸镁0.031～0.062g，氯化钾0.048～0.048g，乳酸钙0.077～0.154g，葡萄糖1.5～3.0g。此缓冲液可以调节缓冲灌肠液的ph值，吸收后有助于调节体内电解质平衡。实施例1至实施例4制备的磷酸化川牛膝多糖该灌肠液，天冷时可将溶液加温至30～37℃后应用，不影响其药效。试验例一、磷酸化川牛膝多糖体外抗病毒试验本试验为磷酸化川牛膝多糖体外抗病毒试验。设病毒对照组(只加病毒)、细胞对照组(只加维持液)和无细胞的空白调零孔，以实施例1得到的磷酸化川牛膝多糖，按照磷酸化川牛膝多糖的最大无毒浓度15.625(μg/ml)为起始浓度的磷酸化川牛膝多糖药液，将其2倍稀释5个浓度(见表1)，每种浓度的磷酸化川牛膝多糖药液重复4孔按以下3种方式加药。1、先加磷酸化川牛膝多糖药液再接种病毒：先将不同浓度含磷酸化川牛膝多糖药液培养液接入已长满单层的96孔细胞培养板内，每浓度4孔，每孔100μl，37℃孵育2h后，弃药液，再接入100tcid50病毒液每孔100μl，37℃孵育2h。2、磷酸化川牛膝多糖药液和病毒混合作用后加入细胞：先将不同浓度含磷酸化川牛膝多糖药液培养液与100tcid50病毒液37℃作用2h后，再将混合液接入已长成单层的96孔细胞培养板内，每浓度4孔，每孔100μl，37℃孵育2h。3、先加病毒再加磷酸化川牛膝多糖药液：先将100tcid50病毒液接入已长满单层的96孔细胞培养板内，每孔100μl，37℃孵育2h后，吸弃病毒液，再接入不同浓度含磷酸化川牛膝多糖药液培养液，每浓度4孔，每孔100μl，37℃孵育2h。测定方法：cck-8法检测，将上述处理的细胞培养板孔内的液体吸弃，加入维持液每孔100μl，置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养72h后，按cck-8法测各孔的吸光度(od)值。表1磷酸化川牛膝多糖的稀释倍数表2先加磷酸化川牛膝多糖药液后接种病毒时各组细胞的od值注:同行数据标不同字母者表示差异显著(p<0.05)。从表2结果可以看出，磷酸化川牛膝多糖药液在15.625～0.907g/ml时的细胞od值均显著大于病毒对照组(p<0.05)。说明在这些浓度范围内磷酸化川牛膝多糖显著促进f81抵抗cpv感染(表2)。表3磷酸化川牛膝多糖药液和病毒混合感作后加入时各组细胞的od值注:同行数据标不同字母者表示差异显著(p<0.05)。从表3结果可以看出，磷酸化川牛膝多糖药液在15.625～1.954g/ml时的细胞od值均显著大于病毒对照组(p<0.05)。说明在这些浓度范围内磷酸化川牛膝多糖显著促进f81抵抗cpv感染(表3)。表4先接种病毒后加磷酸化川牛膝多糖时各组细胞的od值注:同行数据标不同字母者表示差异显著(p<0.05)。从表4结果可以看出，磷酸化川牛膝多糖在15.625–0.907g/ml时的细胞od值均显著大于病毒对照组(p<0.05)。说明在这些浓度范围内磷酸化川牛膝多糖显著促进f81抵抗cpv感染(表4)。以上结果表明：磷酸化川牛膝多糖在体外，在三种加药方式下，均能够显著抑制犬细胞病毒感染细胞的能力。说明磷酸化川牛膝多糖体外具有很好的抗病毒作用。二、磷酸化川牛膝多糖灌肠液对犬细小病毒病预防和治疗作用试验。取80只犬随机分为8组，每组10只。第1组为空白对照组，采用生理盐水灌肠，2次/d，连用3d，每次0.5ml/kg。第2组为阴性对照组(模型组)，用犬细小病毒攻毒不给药。第3、4、5组为磷酸化川牛膝多糖预防组，先对实验犬进行灌肠给药，然后再攻毒。灌肠分别采用实施例1中的灌肠液进行高剂量(6ml/kg)、中剂量(3ml/kg)、低剂量(1.5ml/kg)的磷酸化川牛膝多糖液灌肠，2次/d，连用3d。其高剂量、中剂量和低剂量灌肠液剂量分别为6ml/kg体重、3ml/kg体重、1.5ml/kg体重。第4d用犬细小病毒攻毒。第6、7、8组为磷酸化川牛膝多糖治疗组，先对实验犬进行攻毒，犬体温升高，出现症状后再灌肠给药。灌肠分别采用实施例1中的灌肠液进行高剂量(6ml/kg)、中剂量(3ml/kg)、低剂量(1.5ml/kg)的磷酸化川牛膝多糖液灌肠，2次/d，连用3d。其高剂量、中剂量和低剂量灌肠液剂量分别为6ml/kg体重、3ml/kg体重、1.5ml/kg体重。以上8组，分别于攻毒前1d、治疗后3d、7d采血，检测血清中ifn-γ和il-2的浓度，并统计药物对犬的保护率。1、磷酸化川牛膝多糖灌肠液对犬细小病毒病预防作用(1)磷酸化川牛膝多糖灌肠液对犬细小病毒病发病率及死亡率的影响见表5，试验结果表明，试验犬感染犬细小病毒后，攻毒组死亡率为80％。其他应用磷酸化川牛膝多糖灌肠液进行预防的各个组的结果表明，高中低剂量预防给药组犬保护率分别为70％、60％、50％。由此可见，磷酸化川牛膝多糖可以有效预防幼犬感染犬细小病毒。川牛膝多糖灌肠液预防给药可以有效降低犬细小病毒的感染率，及降低犬的死亡率。表5磷酸化川牛膝多糖灌肠液预防给药对犬细小病毒的攻毒的预防作用(2)磷酸化川牛膝多糖灌肠液预防给药对犬细小病毒的攻毒犬血清中ifn-γ水平的影响ifn-γ是体内重要的具有抗病毒作用的细胞因子，ifn-γ的浓度反映机体抗病毒免疫的水平，血清中ifn-γ的浓度越高，机体抗病毒能力越强。如表6所示，与空白组相比，攻毒组的ifn-γ水平显著下降(p<0.05)，说明抗病毒免疫水平显著下降。攻毒前1天，中药预防给药高、中剂量加攻毒组的ifn-γ水平显著高于攻毒组和空白组(p<0.05)。攻毒后第3、7d,预防给药各组的ifn-γ水平均显著高于攻毒组和空白组(p<0.05)。表明中药预防性灌肠显著促进犬细小病毒感染犬血清中ifn-γ水平(p<0.05)。说明磷酸化川牛膝多糖灌肠液预防性给药能够显著促进cpv感染犬的抗病毒能力。表6磷酸化川牛膝多糖灌肠液预防给药对犬细小病毒的攻毒犬体内ifn-γ含量的影响组别攻毒前1天攻毒后第3天攻毒后第7天第1组421.21±39.91a432.21±43.46a419.21±32.94a第2组429.25±26.22a263.25±23.76d183.25±34.97d第3组431.29±28.12a399.48±51.43b339.67±34.27c第4组447.54±46.09b368.34±39.36c370.24±31.52b第5组452.25±48.28b406.53±47.13b383.51±42.34b注：同列数值不同字母表示差异显著(p<0.05)(3)磷酸化川牛膝多糖灌肠液预防给药对犬细小病毒的感染犬血清中il-2水平的影响il-2的浓度反映机体抗病毒免疫的水平，il-2的浓度越大，病毒病毒免疫水平越高。如表7所示，与空白组相比，攻毒组的il-2水平显著下降(p<0.05)，说明细小病毒感染病犬抗病毒免疫水平显著下降。预防给予灌肠液的各组动物攻毒后的il-2水平显著高于攻毒组(p<0.05)，表明各个磷酸化川牛膝多糖预防灌肠显著减少犬细小病毒感染犬血清中il-2含量下降(p<0.05)。说明磷酸化川牛膝多糖灌肠预防性给药能够促进cpv感染犬的抗病毒水能力。表7磷酸化川牛膝多糖灌肠液预防给药对犬细小病毒的攻毒犬血清中il-2含量的影响组别攻毒前1天攻毒后第3天攻毒后第7天第1组159.21±39.91c162.12±43.46b171.21±23.49a第2组162.23±31.24c85.52±23.76c83.25±43.79d第3组181.29±24.57b152.65±42.81b159.39±32.72b第4组193.67±93.23a157.37±39.54b133.48±39.61c第5组204.25±56.12a179.25±31.45a134.57±13.51c注：同列数值不同字母表示差异显著(p<0.05)2、磷酸化川牛膝多糖灌肠液对犬细小病毒病治疗作用(1)磷酸化川牛膝多糖灌肠液对犬细小病毒的攻毒犬死亡率及保护率的影响如表8所示，试验犬感染犬细小病毒后，攻毒组死亡率为80％，我们使用磷酸化川牛膝多糖灌肠液对攻毒犬进行了治疗，治疗结果表明，磷酸化川牛膝多糖高中低剂量治疗组犬保护率分别为80％、70％、60％。由此可见，磷酸化川牛膝多糖对幼犬感染犬细小病毒具有很好的治疗作用，可有效的提高感染细小病毒犬的生存率。表8磷酸化川牛膝多糖灌肠液对犬细小病毒的攻毒的治疗作用(2)磷酸化川牛膝多糖灌肠液对犬细小病毒的攻毒犬血清中ifn-γ水平的影响ifn-γ的浓度反映机体抗病毒免疫的水平，ifn-γ的浓度越大，病毒免疫水平越高。如表9所示，与空白组相比，攻毒组的ifn-γ水平显著下降(p<0.05)，说明抗病毒免疫水平显著下降。攻毒加中药灌肠各组的ifn-γ水平显著高于攻毒组(p<0.05)，表明各个中药灌肠组显著促进犬细小病毒感染犬血清中ifn-γ含量(p<0.05)。说明磷酸化川牛膝多糖能够促进cpv感染犬的抗病毒水平。表9磷酸化川牛膝多糖灌肠液对犬细小病毒的攻毒犬体内ifn-γ含量的影响。组别攻毒前1天攻毒后第3天攻毒后第7天第1组421.21±39.91a432.21±43.46a419.21±32.94a第2组429.25±26.22a263.25±23.76d183.25±34.97d第6组398.29±42.88a382.29±42.81b379.67±23.21b第7组408.67±39.11a368.34±39.65b370.24±39.23b第8组416.25±31.84a326.79±31.21c346.25±31.54c注：同列数值不同字母表示差异显著(p<0.05)(3)磷酸化川牛膝多糖灌肠液对犬细小病毒的感染犬血清中il-2水平的影响il-2的浓度反映机体抗病毒免疫的水平，il-2的浓度越大，病毒病毒免疫水平越高。如表10所示，与空白组相比，攻毒组的il-2水平显著下降(p<0.05)，说明细小病毒感染病犬抗病毒免疫水平显著下降。攻毒加中药灌肠各组的il-2水平显著高于攻毒组(p<0.05)，表明各个中药灌肠组显著促进犬细小病毒感染犬血清中il-2含量(p<0.05)。说明磷酸化川牛膝多糖灌肠给药能够促进cpv感染犬的抗病毒水平。表10磷酸化川牛膝多糖灌肠液对犬细小病毒的攻毒犬血清中il-2含量的影响组别攻毒前1天攻毒后第3天攻毒后第7天第1组159.21±39.91a162.12±43.46a171.21±23.49a第2组179.25±62.22a85.52±23.76d83.25±43.79d第6组178.29±24.88a132.92±42.81b149.67±32.12b第7组169.67±93.11a118.43±39.65c123.24±39.32c第8组163.25±13.84a116.97±31.21c114.25±13.45c注：同列数值不同字母表示差异显著(p<0.05)治疗案例病例1：病例情况：2015年9月2日、金毛犬、年龄：4个月、体重：10kg、疫苗情况：未作任何疫苗。犬主叙述：昨天给小狗刚洗完澡，没有吹的很干，突然精神沉郁，有点吐，并且伴有拉稀现象、并且粪便内可见血丝。临床症状：呕吐、稀便、恶臭，并且粪便中伴有血色、精神萎靡，眼窝深陷。诊断方法：做实验室cpv检查，结果cpv检测为犬细小病病毒、根据临床症状、试纸检查结果初步判断为犬细小病病毒。治疗方法：使用灌肠疗法，首先使用肥皂水灌入直肠，用于清除直肠和结肠中蓄积粪便，然后使用磷酸化川牛膝多糖灌肠液，按照3ml/kg体重的剂量灌肠，灌肠后前低后高的位置保持5min。每天2次，连用3天。第二天，肠道出血减轻，犬精神好转，第3天无血便排出。病例2：病例情况：时间：2015年11月7日、犬种：萨摩耶犬、年龄：3个月、体重：8kg、疫苗情况：只做了两次疫苗免疫。犬主叙述：回家之后便，之后有点咳嗽，晚上开始排稀便，番茄汁样稀便。临床症状：血便，精神萎靡。诊断方法：通过胶体金试纸板检查，结果cpv阳性，根据临床症状、试纸检查结果初步判断为犬细小病病毒。治疗方法：使用灌肠疗法，首先使用生理盐水灌入直肠，用于清除直肠和结肠中的粪便，然后使用磷酸化川牛膝多糖灌肠液，按照3ml/kg体重的剂量灌肠，灌肠后前低后高的位置保持5min。每天2次，连用5天。第二天，血便颜色变淡，出血减轻，第5天无血便排出。病例3：病例情况：2015年4月23日、犬种：杂交犬，年龄：10岁、体重：5kg、犬主叙述：发现该犬精神沉郁，持续呕吐，排稀便混有血丝，体温40℃。诊断方法：通过胶体金试纸板检查，结果cpv阳性，根据临床症状、试纸检查结果初步判断为犬细小病病毒。治疗方法：治疗周期5日、采用灌肠疗法。治疗前的准备：温肥皂水调至37～38℃，首先使用问肥皂水灌入直肠清除直肠和结肠中的粪便，然后使用磷酸化川牛膝多糖灌肠液，按照3ml/kg体重的剂量灌肠，灌肠后前低后高的位置保持5min。每天2次，连用5天。第二天，血便颜色变淡，出血减轻，第5天无血便排出。以上对本发明所提供一种能够抗犬细小病毒作用的灌肠液及其制作方法进行了详细介绍，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。当前第1页12