一种安全型抗CEA嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法及其应用与流程

本发明涉及及生物与新医药技术领域，更具体的说，是一种安全型抗cea嵌合抗原受体修饰t细胞的制备方法及其应用。

背景技术：

癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，cea)是一种高表达多种恶性肿瘤的酸性糖蛋白，如表达95％以上的结肠直肠癌，90％左右的胃癌、胰腺癌，80％以上的非小细胞性肺癌，50％左右的乳腺癌。因此cea已被公认为肿瘤标志物之一，使之成为肿瘤靶向治疗和诊断的最佳靶位之一。

传统的治疗cea肿瘤方法包括手术、放疗、化疗等远不能满足广大癌症患者的要求，每年因cea肿瘤而死亡的人数是全部肿瘤死亡人数的60％以上，是人类健康的严重威胁。而以癌胚抗原嵌合抗原受体(chimericantigenreceptorcar)修饰t细胞(car-t)过继性地靶向免疫治疗已成为cea肿瘤治疗的富有希望的疗法。目前car-t技术已在急性白血病、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、乳腺癌、肾癌、结肠癌等多种恶性肿瘤的治疗上有着显著的疗效，但也引起了“脱靶效应”和“细胞因子风暴”等不良反应。因此，在保证car-t细胞治疗效果的前提下，如何提高car-t细胞的安全性是目前临床应用面临的首要问题。

技术实现要素：

为了弥补以上不足，本发明提供了本发明提供一种安全型抗cea嵌合抗原受体修饰的t细胞。

本发明的方案是：

一种安全型抗cea嵌合抗原受体修饰t细胞的制备方法，将leader-scfv(cea)-cd8-cd137-cd3ζ-t2a-hsv-tk核苷酸合成，将合成的leader-scfv(cea)-cd8-cd137-cd3ζ-t2a-hsv-tk的基因片段插入到plent-c-gfp载体(invitrogen)noti-asisi位点，经测序正确后，构建成质粒，将所述质粒转染293t细胞，包装成携带有leader-scfv(cea)-cd8-cd137-cd3ζ-t2a-hsv-tk编码基因的慢病毒，将所述携带有leader-scfv(cea)-cd8-cd137-cd3ζ-t2a-hsv-tk编码基因的慢病毒感染单核细胞诱导的异质t淋巴细胞，得到安全型抗cea嵌合抗原受体修饰的t细胞。

作为优选的技术方案，所述leader-scfv(cea)-cd8-cd137-cd3ζ-t2a-hsv-tk的基因片段为序列表seq.id.no.1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种将单核细胞诱导的异质t淋巴细胞制备如下：取患者自体外周血，分离外周血单个核细胞，用重组干扰素α2a的培养基诱导培养24小时后，加入重组白细胞介素2、okt-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养24小时；每隔两天倍比加液，培养至第14天，流式细胞术检测t细胞中的cd3+、cd56+的阳性表达率；cd3+阳性率>80％，cd3+cd56+双阳性率>20％，获得单核细胞诱导的异质t淋巴细胞。

本发明还提供了一种将所述质粒转染293t细胞，包装成携带有leader-scfv(cea)-cd8-cd137-cd3ζ-t2a-hsv-tk编码基因的慢病毒的方法：将慢病毒包装细胞系293t接种于含有dmem+10％fbs10cm培养皿中，37℃，5％的co2条件下培养，贴壁率为70％-80％后进行转染，所述质粒采用磷酸钙转染法转染293t细胞，转染后24h后，细胞明显增大、呈球形，细胞核变大，变圆，贴壁能力下降而易脱落；48h后在倒置荧光显微镜下观察到细胞内有绿色荧光蛋白表达；72h后，收集上清，过滤除菌，获得慢病毒，在-80℃低温冰箱中保存备用。

本发明还提供一种治疗肿瘤的药物，含有权利要求1所述的安全型抗cea嵌合抗原受体修饰的t细胞。

由于采用了上述技术方案，一种安全型抗cea嵌合抗原受体修饰t细胞的制备方法，将leader-scfv(cea)-cd8-cd137-cd3ζ-t2a-hsv-tk核苷酸合成，将合成的leader-scfv(cea)-cd8-cd137-cd3ζ-t2a-hsv-tk的基因片段插入到plent-c-gfp载体(invitrogen)noti-asisi位点，经测序正确后，构建成质粒，将所述质粒转染293t细胞，包装成携带有leader-scfv(cea)-cd8-cd137-cd3ζ-t2a-hsv-tk编码基因的慢病毒，将所述携带有leader-scfv(cea)-cd8-cd137-cd3ζ-t2a-hsv-tk编码基因的慢病毒感染单核细胞诱导的异质t淋巴细胞，得到安全型抗cea嵌合抗原受体修饰的t细胞。

该发明的优点：

具有活性“开关”的中等亲和力重组嵌合抗原受体，包括中等亲和力癌胚抗原结合区、cd8的hinge区和跨膜区、cd137和cd3ζ的胞内信号区，在重组嵌合抗原受体的3'端插入活性“开关”元件。

本发明所述的重组嵌合抗原受体，活性“开关”元件是由自杀基因单纯疱疹胸腺嘧啶激酶构成。通过自裂解多肽t2a与重组嵌合抗原受体其它功能结构域相连。由t2a连接的基因在转入t细胞后能正常翻译和表达，且表达水平相当。更昔洛韦诱导后，含有重组嵌合抗原受体的t细胞裂解死亡以实现更昔洛韦控性的“关”作用，即通过注射更昔洛韦来预防和治疗car-t的不良反应。

本发明所述的重组嵌合抗原受体，中等亲和力抗原结合区选自中等亲和力单链抗体。使car-t细胞能够根据抗原密度的差异选择的杀伤肿瘤细胞，而豁免正常细胞，在保证疗效的同时降低“脱靶效应”，提高安全。

附图说明

图1为本发明所述的嵌合抗原受体leader-scfv(cea)-cd8-cd137-cd3ζ-t2a-hsv-tk的融合基因片段的设计图；

图2为本发明所述的慢病毒leader-scfv(cea)-cd8-cd137-cd3ζ-t2a-hsv-tk表达质粒的示意图；

图3为本发明car-t细胞的表达car的效率为18±1.56；

图4为本发明car-t体内抑制cea阳性结直肠癌细胞系sw480细胞的生长，且car-t活性受自杀基因系统的控制；

图5是不同亲和力的car-t细胞杀伤4种cea表达量不同的肿瘤细胞的结果图；

具体实施方式

为了弥补以上不足，本发明提供了一种安全型抗cea嵌合抗原受体修饰的t细胞，以解决上述背景技术中的问题。

实施例1表达本发明核酸编码的嵌合抗原受体蛋白的慢病毒质粒的构建及病毒包装

1.将融合基因片段leader-scfv(cea)-cd8-cd137-cd3ζ-t2a-hsv-tk插入慢病毒表达载体plent-c-gfp。

leader-scfv(cea)-cd8-cd137-cd3ζ-t2a-hsv-tk的car模块示意见图1(完整核酸序列见附录seqidno.1)。

anti-cea的car各模块序列

(1)导引子leader核酸人工序列(seqidno.2)

(2)anti-carcinoembryonicantigenantibodysinglechainfvantibody(scfv)核酸人工序列(seqidno.3)

(3)cd8hinge区核酸人工序列(seqidno.4)

(4)cd8跨膜区核酸人工序列(seqidno.5)

(5)cd137胞内区核酸人工序列(seqidno.6)

(6)cd3ζ胞内区核酸人工序列(seqidno.7)

(7)自裂解多肽t2a核酸人工序列(seqidno.8)

(8)hsv-tk核酸人工序列(seqidno.9)

分别按导引子leader的核酸人工序列、anti-cea的核酸人工序列、cd8hinge区核酸人工序列、cd8跨膜区的核酸人工序列、cd137的核酸人工序列、cd3ζ的核酸人工序列，自裂解多肽t2a核酸人工序列，hsv-tk核酸人工序列(seqidno.10)委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框，插入plent-c-gfp载体(invitrogen)noti-asisi位点(见图2)，转化到e.coli(dh5α)，经测序正确后，使用qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得重组表达载体的高品质质粒。

2.慢病毒包装，滴度检测

将慢病毒包装细胞系293t接种于含有dmem+10％fbs10cm培养皿中，37℃，5％的co2条件下培养，贴壁率为70％-80％后进行转染。重组质粒和空载质粒分别与慢病毒包装质粒采用磷酸钙转染法共转染293t细胞，具体方法参考分子克隆。转染后24h后，细胞明显增大、呈球形，细胞核变大，变圆，贴壁能力下降而易脱落。48h后在倒置荧光显微镜下观察到细胞内有绿色荧光蛋白表达。72h后，收集上清，过滤除菌，在-80℃低温冰箱中保存备用。根据lenti-x^tmgostix^tm试剂盒(北京华夏远洋科技有限公司产品)测定病毒滴度，结果表明，重组慢病毒的滴度2.66×10⁶pfu/ml，空载慢病毒的滴度2.78×10⁶pfu/ml。

实施例2慢病毒感染t细胞

1.异质性t细胞的制备

取75ml患者自体外周血，用tbd样本密度分离液(购自天津灏洋华科生物)，分离外周血单个核细胞。用含有1000iu/ml的重组干扰素α2a(购自沈阳三生制药)的培养基(购自corning公司，88-551-cm)诱导培养24小时后，加入1000iu/ml的重组白细胞介素2(购自沈阳三生制药)、50ng/ml的okt-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养24小时。每隔两天倍比加液，培养至第14天，流式细胞术检测t细胞中的cd3+、cd56+的阳性表达率(cd3-fitc，cd16/cd56-pe抗体购自beckman公司，a07735)。cd3+阳性率>80％，cd3+cd56+双阳性率>20％，视为t细胞诱导成功，并留取该t细胞待病毒感染

2.慢病毒感染t细胞及感染后t细胞的扩增培养

以moi＝5用上述重组和空载慢病毒分别感染t细胞。感染后的细胞37℃，5％co2培养箱中培养8小时后，收集细胞，重新加入病毒液，1000g，32℃，再次离心90分钟后，37℃，5％co2培养箱中继续培养，如此反复进行多重感染，提高t细胞的感染效率。吸弃2ml培养上清，加入2ml的新鲜corning培养基，继续扩大培养，培养17天至细胞扩增至足够的用量。通过荧光显微镜检测嵌合抗原受体表达，由于gfp与car共表达，检测gfp的阳性细胞即为表达嵌合抗原受体的阳性细胞(图3)。以未感染的t淋巴细胞作为阴性对照，重组慢病毒感染t细胞其阳性率18±1.56％，空载慢病毒感染t细胞其阳性率19.33±1.38％。

实施例3：具有自杀基因系统的car-t细胞杀伤活性研究

取稳定表达荧光素酶(fire-luciferase)的cea阳性的结直肠癌细胞系sw480作为靶细胞，效应细胞为car-t细胞和空载慢病毒感染t。

1.自杀基因系统对car-t细胞活性的控制

将car-t细胞按照密度1×10⁵个/ml接种96孔板中，每孔100ul，置于5％co2、37℃培养箱培养24h；加入10ng更昔洛韦(自杀基因系统的诱导剂，武汉海特生物制药股份有限公司)，每12小时一次，共3次。以未加更昔洛韦的car-t细胞作为阴性对照。用荧光素酶检测系统试剂盒e4550(南京生兴生物技术有限公司)检测孔板中剩余细胞内luciferase含量，自杀基因系统对修饰后t细胞活性的控制率＝(1-加更昔洛韦培养孔荧光强度/未加更昔洛韦培养孔荧光强度)×100％。自杀基因系统对car-t细胞活性的控制率为98.34％±2.03％；结果说明本发明设计的car-t细胞活性受自杀基因系统的控制。

2.car-t细胞对cea阳性肿瘤细胞系杀伤活性分析

接种100μl1×10⁴/孔的靶细胞sw480到96孔细胞培养板中，按照1:1效靶比加入效应细胞即car-t细胞，置于5％co2、37℃培养箱培养24h。以加入空载慢病毒感染t作为对照组。利用荧光素酶检测系统试剂盒e4550(南京生兴生物技术有限公司)检测孔板中剩余细胞内luciferase含量，car-t细胞株对靶细胞的体外杀伤效率＝(1-car-t细胞靶细胞共培养孔荧光强度/空载慢病毒感染t细胞靶细胞共培养孔荧光强度)×100％。效应t细胞对cea阳性肿瘤细胞系sw480细胞的杀伤效率为82.34％±1.97％；结果说明本发明设计的car-t细胞对cea阳性肿瘤细胞系具有很高杀伤作用。

实施例4：car-t细胞对结直肠癌balb/c小鼠肿瘤生长抑制作用

18-22g雌性km小鼠(购自广州中医药大学)于动物房饲养(室温23±2℃，湿度50％±10％)，收集对数期的结直肠癌细胞系sw480细胞，磷酸盐缓冲液(pbs)稀释至2×10⁵个/ml。无菌条件下，小鼠左腋下接种0.2ml结直肠癌sw480细胞悬浮液，观察3-5d，待腋下出现米粒大小较硬的结节作为建模成功的标准。

c57bl/6结直肠癌移植瘤模型小鼠(游标卡尺量取皮下肿瘤组织块的大小为90-100mm³)随机分成4组，每组20只，开始注射治疗实验。实验组分别为：

a.对照组，尾部静脉注射同等体积的生理盐水；

b.治疗一组，尾部静脉注射2×10⁶个细胞/只car-t细胞，首次注射后7天再进行第二次同剂量注射；

c.治疗二组，尾部静脉注射2×10⁶个细胞/只car-t细胞，首次注射后7天再进行第二次同剂量注射，且首次治疗注射12h后，每天尾部静脉注射更昔洛韦(8mg/kg)进行清除car-t细胞，共持续14d。

d.治疗三组，尾部静脉注射2×10⁶个细胞/只car-t细胞，首次注射后7天再进行第二次同剂量注射，且二次治疗注射12h后，每天尾部静脉注射更昔洛韦(8mg/kg)进行清除car-t细胞，共持续7d。

每天通过游标卡尺量取各个实验组小鼠皮下肿瘤组织块大，并记录，用肿块均值绘制肿瘤生长曲线图，结果如图4所示。注射car-t细胞后第3天，40％小鼠的肿瘤开始变小，在14天时，65％小鼠几乎触摸不到肿瘤。注射更昔洛韦后几乎完全抑制了car-t对肿瘤的作用，说明更昔洛韦可以消除car-t细胞，防止对正常的组织和器官的旁系损伤。结果表明本发明设计的car-t细胞对balb/c小鼠肿瘤生长有明显的抑制作用，且活性受自杀基因系统的控制。

实施例5：car-t细胞临床应用方法：

用于cea肿瘤病人的治疗，治疗方法是局部肿瘤注射和静脉回输2×10⁶个car-t细胞,每周一次,连续免疫两周。若有不良反应的发生，则局部肿瘤注射和静脉回输更昔洛韦(5-10mg/kg)，连续7-14d。

实施例6：运用流式细胞术检测两种不同亲和力的car-t细胞对cea表达量不同的4组肿瘤细胞的杀伤活性研究

1.不同类型肿瘤细胞表面cea的表达量的分析

首先收获并调整细胞浓度为1×10⁶/ml于eppendorf管中，加人2mg/l与抗cea人鼠嵌合型抗体t84.66(igg1)(德泰生物产品)，混匀于冰上1h，pbs洗后，冰上lh荧光标记抗体，pbs再次洗后，悬浮于1.0mlfacsflow溶液中，采用流式细胞仪facscalibur(为美国bd公司产品)检测分析肿瘤细胞表面cea的表达量，以人igg为对照抗体。与重组抗体t84.66(igg1)特异性结合较明显的细胞株为结直肠癌细胞系sw480；结合稍弱的为肺癌细胞系kns-62；少量结合的为结肠癌细胞系ht-29：；不与cea特异性抗体结合的细胞株为胃癌细胞系mkn-74。

2.两种不同亲和力的car-t细胞对cea表达量不同的4组肿瘤细胞的杀伤功能的分析

将不同的靶细胞sw480，kns-62，ht-29，mkn-74以100μl1×10⁴/孔的分别接种到96孔细胞培养板中，按照1:1效靶比分别中等亲和力car-t细胞和高亲和力car-t细胞(抗体序列见seqidno.10，构建过程同上)，置于5％co2、37℃培养箱培养24h。以自动化xcelligenceptcadp仪器(罗氏产品)实时监测car-t的杀伤功能，结果如图5所示。中等亲和力car-t细胞根据抗原的差异，特异杀伤cea高表达结直肠癌细胞系sw480和肺癌细胞系kns-62，且杀伤能力随着抗原表达量的降低而显著减弱，对cea少量表达的结肠癌细胞系ht-29和不表达的胃癌细胞系mkn-74没有杀伤力。高亲和力car-t细胞，除对cea不表达的胃癌细胞系mkn-74没有杀伤力外，对其余各组均有有效的杀伤功能。结果表明中等亲和力car-t细胞能够根据抗原密度的差异选择的杀伤肿瘤细胞，而豁免正常细胞，在保证疗效的同时降低“脱靶效应”，提高安全。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110>山东兴瑞生物科技有限公司

<120>一种安全型抗cea嵌合抗原受体修饰t细胞的制备方法及其应用

<130>2017

<160>10

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>2678

<212>dna

<213>anti-cea的car人工序列

<400>1

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<213>cd8跨膜区核酸人工序列

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<213>hsv-tk核酸人工序列

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