白蚁溶纤维类芽孢杆菌NP1、木聚糖酶PtXyn1及其编码基因和应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种白蚁溶纤维类芽孢杆菌np1、木聚糖酶ptxyn1及其编码基因和应用。
背景技术：
：木质纤维素是自然界最丰富的生物质资源，对其进行综合利用对人类社会的可持续发展具有重要意义。在自然界能降解木质纤维素的微生物主要是一些真菌和细菌，对这些微生物资源的挖掘将有助于对生物质的开发与利用。木质纤维素由纤维素、半纤维素和木质素这三种高分子化合物组成，在自然界能稳定存在。降解木质纤维素需要一系列复杂酶系中多种酶的相互作用。能降解木质纤维素的微生物均含有丰富的纤维素酶、半纤维素酶等，因此，从自然环境中筛选纤维素降解菌，将具有良好的开发与应用前景。木聚糖在半纤维素中含量丰富，结构要比纤维素复杂，完全降解木聚糖需要多种水解酶(即木聚糖降解酶系统)的协同作用。木聚糖酶(e.c3.2.1.8)是一类以内切方式降解木聚糖分子中β-1,4-木糖苷键的酶系。内切-β-1,4-木聚糖酶是木聚糖降解的主要作用酶，它与β-木糖苷酶共同作用可以使木聚糖降解为木糖或者木聚寡糖。近年来，木聚糖酶在食品、纺织、饲料、能源工业中都显示了广阔的应用前景。在仔猪饲料中添加含有木聚糖酶的复合酶制剂能够提高干物质、粗蛋白质粗纤维等的表观消化率以及降低粪便中大肠杆菌数和腹泻率。在造纸工业中，应用半纤维素酶进行预漂、助漂，可以降低化学药品的使用量，已经成为一种较为成熟的工艺技术。在果汁生产过程中，采用木聚糖酶、纤维素酶和果胶酶共同处理能够降低提取液的粘度，有利于过滤和浓缩。但在实际的生产以及应用过程中，需要一些在中温和高温条件下稳定并且能够较好地发挥酶活作用的木聚糖酶。因此，获得活性高且在中温和高温稳定的木聚糖酶对于木聚糖酶的工业应用具有重要的实践价值。技术实现要素：本发明目的在于提供一株具有多种纤维素降解酶的白蚁溶纤维类芽孢杆菌np1。本发明的第二个目的在于提供一种在中温和高温条件下酶活活性高且稳定的木聚糖酶ptxyn1。本发明的另一个目的在于提供一种编码所述木聚糖酶ptxyn1的基因。本发明的又一个目的在于提供一种包含所述编码木聚糖酶ptxyn1基因的重组载体、转化子、重组病毒、重组菌和转基因细胞系。本发明的再一个目的在于提供所述木聚糖酶ptxyn1在降解木聚糖方面的应用。为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：一株白蚁溶纤维类芽孢杆菌，该菌株命名为类芽孢杆菌np1(paenibacillustermiticellulosilyticusnp1)，已于2016年2月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国，武汉，武汉大学，保藏号为cctccno：m2016072。上述类芽孢杆菌np1的菌落形态及生理生化特性为：类芽孢杆菌np1菌落呈圆形、湿润、光滑，菌体呈杆状，菌体大小约0.3-0.4×1.7-3.0μm；革兰氏染色阴性，好氧，无鞭毛或周毛，不具有运动性，芽孢近端生(图1)；该菌的生长温度范围为5～50℃，生长ph值范围为4.5～9.5，生长盐度范围为0％～1.75％；能利用l-阿拉伯糖、d-核糖、d-木糖、d-半乳糖、d-葡萄糖、d-甘露糖、甲基-β-d-吡喃木糖苷、纤维二糖、麦芽糖、七叶灵等为碳源生长；具有酯酶(c4)、白氨酸芳胺酶、萘酚-as-bi-磷酸水解酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶等酶的活性；能同化精氨酸、尿素、七叶灵、对硝基-β-d-甲基半乳糖等，具有精氨酸双水解酶、脲酶、β-葡萄糖苷酶等酶的活性；菌体脂肪酸主要为anteiso-c15:0和iso-c16:0，呼吸醌主要类型为mk-7，细胞壁含有内消旋二氨基庚二酸(dap)。上述类芽孢杆菌np1的基因序列特征为：类芽孢杆菌np1基因组大小约为6.1mb，基因组dnag+c含量为54.41mol％，具有5329个编码基因；该菌基因组中含有200多个与木质纤维素降解相关的酶基因，包括属于63个糖基水解酶(gh)家族的112个酶基因，属于22个家族的72个编码碳水化合物结合结构域的基因，10个内切葡聚糖酶基因，3个外切葡聚糖酶基因，9个葡萄糖苷酶基因，12个木聚糖酶基因和5个β-木糖苷酶基因等。系统发育分析表明该菌属于类芽孢杆菌属，与其最相近的已经鉴定菌株为解凝乳类芽孢杆菌jcm12163t，两株菌16srrna基因的相似性为97％(图2)。一种来自于类芽孢杆菌np1的木聚糖酶，命名为木聚糖酶ptxyn1，其特征在于，所述木聚糖酶ptxyn1的氨基酸序列如seqidno.2所示。一种编码上述木聚糖酶ptxyn1的基因，所述编码基因为任何编码上述木聚糖酶ptxyn1的dna序列。上述方案中，所述编码木聚糖酶ptxyn1的基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。一种包含上述编码木聚糖酶ptxyn1基因的重组载体、转化子、重组病毒、重组菌和转基因细胞系。上述木聚糖酶ptxyn1在降解木聚糖方面的应用。本发明的有益效果如下：本发明筛选获得了一株具有多种纤维素降解酶的类芽孢杆菌np1，从类芽孢杆菌np1的基因中筛选获得了木聚糖酶ptxyn1的编码基因，通过构建重组质粒获得重组菌、编码基因表达后获得了木聚糖酶ptxyn1；本发明所述木聚糖酶ptxyn1在中温和高温条件下具有酶活活性高且稳定的优点，在木聚糖酶的工业应用具有重要的实践价值，在食品、饲料等行业中具有广阔的应用前景。附图说明图1为类芽孢杆菌np1的形态扫描电镜图片，左：类芽孢杆菌np1的扫描电镜图；右：类芽孢杆菌np1的芽孢染色。图2为类芽孢杆菌np1的系统发育分析图。图3为重组表达质粒pet30a(+)-ptxyn1构建过程图。图4为重组木聚糖酶ptxyn1的sds-page分析，其中m：蛋白marker；1：空载对照；2：未诱导对照；3：诱导20小时蛋白样品；4：纯化的蛋白。图5为木聚糖酶ptxyn1的最适反应ph值(a)和ph稳定性(b)。图6为木聚糖酶ptxyn1最适反应温度(a)和温度稳定性(b)。具体实施方式为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。实施例1类芽孢杆菌np1(cctccm2016072)的研究本实验室从象白蚁肠道分离培养获得了一株白蚁溶纤维类芽孢杆菌，命名为类芽孢杆菌np1。(一)对类芽孢杆菌np1的形态学特征和生长特性作如下研究：类芽孢杆菌np1在tsb培养基(美国bd公司，ph值7.2)中30℃恒温培养。接种到固体培养基培养一天，在平板上形成圆形、湿润、光滑的菌落。菌细胞大小约0.3-0.4×1.7-3.0μm，菌体呈杆状，为革兰氏阴性菌，好氧，芽孢近端生(见图1)，没有运动性。以1％的接种量用tsb液体培养基培养np1，测得该菌生长温度范围为5℃～50℃，最适生长温度为30℃；生长ph范围为4.5～9.5，最适生长ph为7.0；在0％～1.75％的盐度范围内可以生长，在盐度大于2％的情况下表现为不生长。(二)对类芽孢杆菌np1的生理生化特性作如下研究：(1)碳源利用：应用api50ch试剂条研究类芽孢杆菌np1对碳源利用的特性。结果表明，该菌可以利用l-阿拉伯糖、d-核糖、d-木糖、d-半乳糖、d-葡萄糖、d-甘露糖、甲基-β-d-吡喃木糖苷、纤维二糖、麦芽糖、七叶灵等底物代谢产酸。(2)细胞内酶活性与同化作用：应用apizym和api20ne试剂条研究类芽孢杆菌np1的细胞内酶活性和同化作用。结果表明，该菌具有酯酶(c4)、白氨酸芳胺酶、萘酚-as-bi-磷酸水解酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶等酶的活性。能够同化精氨酸、尿素、七叶灵、对硝基-β-d-甲基半乳糖等，具有精氨酸双水解酶、脲酶、β-葡萄糖苷酶等酶的活性。(3)氧化酶、触酶等其它酶活性：以类芽孢杆菌np1菌细胞作用等体积的1％对-氨基二甲基苯胺盐酸盐水溶液和1％α-奈酚乙醇溶液，根据颜色反应说明该菌氧化酶为阴性。以菌细胞作用5％h2o2产生气泡，说明其触酶为阳性。类芽孢杆菌np1能将硫代硫酸钠还原为亚硫酸盐并释放出h2s。此外，该菌不能水解酪素，酯酶和淀粉水解酶均为阴性。(4)菌体脂肪酸、呼吸琨等的分析：提取菌株np1的脂肪酸后经气相色谱仪检测分析得到菌株np1脂肪酸主要组分为anteiso-c15:0和iso-c16:0。提取菌株np1的呼吸琨，经hplc分析发现，该菌株的呼吸醌主要类型为mk-7。此外，其细胞壁含有内消旋二氨基庚二酸(dap)。(三)对类芽孢杆菌np1基因组的研究以tsb液体培养基培养类芽孢杆菌np1，收集菌细胞，利用细菌基因组dna提取试剂盒提取菌株np1的基因组dna。使用三代测序平台对样品进行测序。对测序结果进行分析，结果表明，类芽孢杆菌np1基因组大小约为6.1mb，具有5329个编码基因。基因组中含有200多个与木质纤维素降解相关的酶基因，包括10个内切葡聚糖酶基因，3个外切葡聚糖酶基因，9个葡萄糖苷酶基因，12个木聚糖酶基因和5个β-木糖苷酶基因等。系统发育分析表明该菌属于类芽孢杆菌属，与其最相近的已经鉴定菌株为解凝乳类芽孢杆菌jcm12163t，两株菌16srrna基因的相似性为97％。类芽孢杆菌np1，已于2016年2月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏单位地址：中国，武汉，武汉大学，保藏号为m2016072。实施例2木聚糖酶ptxyn1及其编码基因(一)木聚糖酶ptxyn1的制备(1)pcr扩增获得木聚糖酶ptxyn1的编码基因：以类芽孢杆菌np1的基因组dna为模板，用引物30a-ptxyn1-f、30a-ptxyn1-r(引物序列见下表1)进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。表1用于克隆木聚糖酶ptxyn1的引物引物名称引物序列(5’-3’)30a-ptxyn1-fcccatatgcaccatcatcatcatcatgcaacgacgatcacgtccaatc30a-ptxyn1-rccctcgaggttaatttccaaataatcgagg(2)酶切、连接：用xhoi和ndei双酶切pcr扩增产物，与预先使用xhoi和ndei双酶切的pet-30a(+)(购自novagen，产品目录号为69909-3)通过t4dna连接酶进行连接，构建得到重组表达载体，再转化e.colidh5α感受态细胞，转化步骤如下：a)取3μl连接产物于50μl感受态细胞中，轻弹混匀，冰上放置30min；b)42℃准确热激90sec，不要晃动，立即置于冰上；c)加入800μllb(或soc)培养基，200rpm，37℃振荡培养1～1.5小时；d)4000rpm离心3min，弃适量上清后，轻轻悬浮菌体，取100μl菌液均匀涂布至含50μg/mlkana的琼脂平板上，待菌液充分吸收后，倒置平皿37℃培养12～16h。(3)阳性重组子的筛选与鉴定：挑取单菌落使用ptxyn1基因引物进行pcr扩增，验证含有正向插入目的基因片段的重组子，挑选验证成功的菌落进行扩大培养和提取质粒，进行双酶切及测序验证，测序用引物为t7promoterprimer(5’-taatacgactcactataggg-3’)和t7terminatorprimer(5’-gctagttattgctcagcgg-3’)，获得的序列(即ptxyn1编码基因)如序列表中序列1所示。重组表达质粒pet30a(+)-ptxyn1构建过程如图3所示，以类芽孢杆菌np1的基因组dna为模板进行pcr扩增，得到目的基因片段。将基因ptxyn1连接表达载体pet30a(+)，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，并通过菌落pcr扩增、双酶切验证载体是否构建成功。(4)重组木聚糖酶ptxyn1的诱导表达：将重组质粒pet30a(+)-ptxyn1转化到e.colibl21(de3)中，获得重组菌株。挑取重组菌株单菌落，接种到含有kana(50μg/ml)的5mllb培养基中，200r/min，37℃恒温振荡器过夜培养进行活化。将活化后的菌液按1％的转接量，转接到含kana(50μg/ml)的lb液体培养基中，200r/min，37℃培养3～4h，使od600＝0.6，加入iptg至终浓度为0.2mmol/l，16℃诱导。同时，以未诱导的重组质粒pet30a(+)-ptxyn1和含有空载质粒的e.colibl21(de3)作为对照。诱导表达结束后，取1ml菌液，10,000rpm离心1min，去上清，菌体沉淀中加入50μl去离子水重悬菌体，再加入50μl2×sds-page上样缓冲液，混匀后煮沸10分钟，10,000rpm离心5min，冷却后上样，取20μl进行sds-page凝胶电泳，凝胶电泳采用5％的浓缩胶，12％的分离胶。(二)木聚糖酶ptxyn1的纯化1.粗酶液的制备：大量诱导表达目的蛋白后，离心收集菌体，溶于适量的bufferb中，均匀重悬菌体后低温高压细胞破碎仪破碎细胞。所得破碎液于4℃、10000g，离心30min，所得上清液经0.45μm滤膜进行过滤，获得粗酶液。2.目的蛋白纯化采用镍柱亲和层析进行纯化，用hispurnintaresin(thermo)纯化上清，上清液用0.45μm滤器过滤。利用ni-agarose-resin蛋白纯化柱对带有his标签的目的蛋白进行分离纯化，步骤如下：a将1mlni-agarose-resin填料混匀后加入层析柱，室温静置10min，流出柱中的乙醇后加入10倍柱体积的无菌去离子水将乙醇冲洗干净；b.加入10倍柱体积的bufferb(bindingbuffer)平衡柱子；c.将粗酶液加入柱子中，4℃摇晃结合2h；d.用10倍柱体积的bufferb冲洗柱子后依次加入咪唑浓度逐渐升高(5-500mm)的洗脱buffer，收集洗脱峰；e.洗脱后，使用5倍柱体积的bufferb和5倍柱体积的无菌去离子水洗涤柱子；f.最后加入5倍柱体积的20％乙醇，2-8℃保存镍柱。所述bufferb(bindingbuffer，ph8.0)：50mmnah2po4，300mmnacl。3.重组酶ptxyn1的检测及浓缩：利用sds-page凝胶电泳法检测目的蛋白的纯化效果。纯化后的目的蛋白使用截留10kda分子量的超滤管浓缩，并且使用检测酶活所用的buffer置换含有咪唑的buffer，以去除蛋白溶液中的咪唑。将重组表达质粒pet30a(+)-ptxyn1经过0.2mmiptg诱导后，产生了一条分子量约为40kda的重组蛋白，与理论预测值相符合，如图4所示，经ni-nta-sefinose纯化后sds-page电泳显示条带单一(图4泳道4)，得到具有电泳纯的目的蛋白，可以用来进行后续的酶学特性分析。(三)木聚糖酶tmxyn1的特性研究1.重组酶ptxyn1活性检测：采用dns法测定木聚糖酶酶活，取50μl适当稀释的酶液，加入100μl1％木聚糖(sigmabeechwoodxylan)溶液，55℃温育5min，加入200μldns溶液后，沸水浴10min，冷却到室温后，加入1ml去离子水，540nm处测定吸光值。以1mg/ml的木糖为标准样品绘制标准曲线，根据标准曲线计算所得还原糖的量。酶活定义：每分钟水解木聚糖产生1μmol木糖的酶量定义为一个酶活单位。1％木聚糖(sigmabeechwoodxylan)溶液的组成：1g木聚糖溶于100ml0.1m乙酸-乙酸钠缓冲液(ph6.0)中，置于沸水浴中加热5min，将所得木聚糖悬浊液10,000×g离心5分钟，弃沉淀后得木聚糖溶液4℃保存备用。dns溶液的组成：称取185g酒石酸钾钠加到500ml去离子水中，在磁力搅拌器上搅拌至完全溶解后，加20.96gnaoh，然后再加入6.3g3,5-二硝基水杨酸(避光)，易形成结块，不断搅拌，颜色会逐渐变得深红。完全溶解后再加5g无水亚硫酸钠，5g结晶酚(结晶酚事先放到55℃水浴锅中溶解，通过密度计算加入4.673ml)，按次序加。棕色瓶室温贮藏，放置一周以上后才可用。2.最适反应ph和ph耐受性测定不同ph范围缓冲液：乙酸-乙酸钠缓冲液(ph3.0-5.0)，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(ph5.0-7.0)，tris-hcl缓冲液(ph7.0-9.0)，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(ph9.0-11.0)，以0.5为一梯度。在55℃测定重组酶ptxyn1在不同ph范围的酶活，确定其最适反应ph值；将酶液与ph3.0～11.0的缓冲液按1:10的比例与混合，4℃冰箱放置2d，在最适反应ph值下分别测定重组酶活力，确定其ph耐受性。在不同ph条件下检测重组酶ptxyn1的活性,发现该酶最适反应ph为6.0(图5a)。将重组酶稀释于不同ph的缓冲液中，4℃放置2d，然后测定重组酶的残余酶活，测得的重组酶ptxyn1ph耐受性曲线表明，在ph7.5时重组酶耐受性最好，并且在整个ph范围内处理后的酶活力均保持在60％以上，说明该重组酶具有很宽的ph耐受性。但在ph7.0～11.0范围内的残余酶活力高于酸性条件，说明该酶对碱性条件的耐受性更强(图5b)。3.最适反应温度和温度稳定性测定在其最适反应ph值条件下检测其在不同温度范围(25-65℃)的酶活，确定重组酶ptxyn1最适反应温度；将重组蛋白溶液分别在45、50、55、60℃下保温不同时间，保温完成后迅速置于冰上。55℃下反应10min测定残余酶活力，确定其热稳定性。以未进行热处理的木聚糖酶活性作为对照，残余酶活与对照酶活的百分比，作为相对酶活。测定结果表明，重组酶ptxyn1最适反应温度为55℃，在25～65℃温度范围内酶活力保持在40％以上，说明该酶具有较宽的酶活力温度范围(图6a)。分别在45、50、55、60℃下保温不同时间，55℃下测定残余酶活力，以确定其热稳定性。结果表明该酶在低于45℃时，温度稳定性良好，45℃温浴30min后，对酶活性几乎没有影响。在50℃保温30min后保持70％左右的酶活(图6b)。4.酶促反应动力学参数的测定采用lineweaver-burk双倒数法计算出米氏常数km值和最大反应速率vmax值。用0.2mol/l柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(ph6.0)配制成1-10mg/ml浓度的山毛榉木聚糖底物，将等量的蛋白酶液与不同浓度的底物在最适反应条件下反应10min，分别计算出酶活力，即反应速度v。以1/[s]为横坐标、1/v为纵坐标作图，得到一条直线，其横轴截距为-1/km，纵轴截距为1/vmax(最大反应速度)，斜率为km/vmax，由此求出km和vmax。测定结果显示，重组酶ptxyn1的米氏常数km值和最大反应速率vmax的测定采用lineweaver-burk作图法。重组酶ptxyn1对山毛榉木聚糖的km和vmax分别为6.2mg/ml和3765.1μmolmg-1min-1。5.底物特异性的测定在酶促反应最适反应条件下，测定重组蛋白以山毛榉木聚糖(beechwoodxylan1％)、玉米芯木聚糖(corncobxylan，1％)、羧甲基纤维素钠(cmc-na，1％)、微晶纤维素(avicelph-101，1％)、4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷(pnpg，10mm)，4-硝基苯基-β-d-吡喃纤维二糖苷(pnpc，10mm)、4-硝基苯基-β-d-吡喃木糖苷(pnpx、10mm)为底物时的酶活力，以上底物均由0.2mol/l柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(ph6.0)配制。分别以dns法和pnp法检测重组木聚糖酶ptxyn1对不同底物的酶活反应，结果表明重组木聚糖酶ptxyn1只对山毛榉木聚糖有活性，测得其比活力为2118.7u/mg。对其他底物均没有表现出活性。表明重组木聚糖酶ptxyn1具有较强的底物专一性。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。序列表<110>华中师范大学<120>白蚁溶纤维类芽孢杆菌np1、木聚糖酶ptxyn1及其编码基因和应用<160>2<210>1<211>1095bp<212>dna<213>类芽孢杆菌np1（paenibacillustermiticellulosilyticusnp1）＜400＞1atgaaagtaaccaaatcgaaattattgttggcgttagtgcttagctttacgcttgctatg60cctgtaggagtcgcgaatgcggcaacgacgatcacgtccaatcaaacgggtacgcaagac120ggctacgactacgagctgtggaaagattccggcacgacgagcatgacgctcaacagcggc180ggcgcgttcagcgcaacgtggagcaatattaataacgccttgttccgtaagggcaaaaag240ttcaatgccacccaaacgcaccagcaaatcggcaacatctccatcaattacgctgcaacg300ttcaatccgggcggcaactcttatctgacggtatacggctggacgaagagctcgctcatc360gagtactacatcatggataactggggaacgtaccgcccgtccggcacgaataaaggttcg420ttctcggttgacggcggcacgtacgatatttacgagacgacccgggttaaccagccgtct480atcgaaggtacggcgacgttcaaacaatattggagcatccggacggccaaacgttcgagc540ggtacgatctcggtaagcgagcacttcaagaagtgggaaagcctgggcatgtcgctcggc600aaactgtacgaagtagcgcttacggttgagggctatcaaagcagcggcaatgcgaacgtg660acgacgaacgtgctgacgatcggcggaagcggaagcggcggcggcggcggtacaacgacc720cctccaagctcgggcgctacgaaagtggaagcggagagcatgtcgaagagcggccaatac780acgggcaacatcagctcgccgttctcgggcgttgcactgtacgcgaataacgatctggtc840aaatttacgcaaaacttcacgtccggcacgcacagcttctcgcttcgcggcgcttcgaac900aactccagcacggctagagtcgatctgaaaatcggcggcgtgaccaaaggcagcttctac960ttcaccggtacgactcctgccgtctcgacgatcagcaacgtcagcacgggaaccggtaat1020caagaaatccagctcgtcgtcacgaccgataacgggcaatgggacgctttcctcgattat1080ttggaaattaactag1095<210>2<211>337<212>prt<213>类芽孢杆菌np1（paenibacillustermiticellulosilyticusnp1）＜400＞2alathrthrilethrserasnglnthrglythrglnaspglytyrasptyrgluleutrp5101520lysaspserglythrthrsermetthrleuasnserglyglyalapheseralathrtrp25303540serasnileasnasnalaleuphearglysglylyslyspheasnalathrglnthrhis45505560glnglnileglyasnileserileasntyralaalathrpheasnproglyglyasnser65707590tyrleuthrvaltyrglytrpthrlysserserleuileglutyrtyrilemetaspasn859095100trpglythrtyrargproserglythrasnlysglyserpheservalaspglyg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